酶法合成研究进展

β-内酰胺抗生素的酶法合成研究进展 β-内酰胺抗生素经过多年的发展，己成为抗生素中的最主要类型之一。由于具有良好的抗菌效力，较低的毒副作用，在临床上广泛应用，其发展非常迅速。现全世界耗用量已过万吨，预计今后还会增长。其中，青霉素和头孢菌素为最重要的两大类β-内酰胺抗生素。酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初，经过 30多年的发展，现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展，配套技术日益完善，具备了大规模工业化生产的条件。 全球著名的β-内酰胺抗生素生产厂家如荷兰DSM公司已有酶法合成的商品头孢氨苄、阿莫西林等产品面世。由于酶法应用于β-内酰胺抗生素合成，不仅可减少反应步骤，而且还可减少废弃物的产生，有利于保护环境，降低生产成本，产品质量优异，所含杂质极少。因此，21世纪β-内酰胺抗生素的酶法合成将是发展的必然趋势。 我国酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大规模工业化生产，与国外先进厂家差距较大。随着我国经济快速发展，人们对自身居住环境的要求，政府对环保的重视，政府和越来越多的企业加大“绿色化学制药”的研究开发，特别是加快工业化生产的推进进程。现将近年来β-内酰胺抗生素合成研究、产品的分离纯化、酶反应器研究进行概述。

1 现状 青霉素中如氨苄西林、阿莫西林等，头孢菌素中如头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢丙烯、头孢唑林等，这些产品有化学半合成法（简称化学法）和酶半合成法（简称酶法）。化学法是将母核与侧链以化学法缩合，现在世界上绝大多数生产这些产品的企业使用的是化学法，常用的方法有酰氯法、混合酸酐法、 Vilsmeier法及活性醋法。酶法则是将母核与侧链通过酶催化缩合。化学法需要

较多的有机化学原料（如溶剂二氯甲烷、吡啶、二甲苯胺），反应条件苛刻，如需无水条件，反应温度低（有的需低至零下90℃），反应步骤多，产生大量的三废需处理。 这些产品酶法合成技术自1969年开始报道，但由于当时酶的性能较差，分

离纯化技术也一直未能很好的解决，因此多年来酶法合成技术仍处于研究和试生产阶段。近年来，随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展，酶法制备β-内酰胺抗生素的技术也不断得到提高。

2 酶催化合成研究进展 2.1 酶催化酰胺化缩合反应 酶法制备β-内酰胺抗生素酰胺化缩合反应的研究涉及的品种有氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢丙烯、头孢克洛等。 酶催化缩合反应类型一般有两类，一类为热力学控制的酶催化缩合反应，另

一类为动力学控制的酶催化缩合反应。 (1)热力学控制的酶催化缩合反应

其特点是不必活化酰基配体，废物产生少。Schroen等研究了不同pH、溶剂浓度和温度条件下，热力学控制的头孢氨苄酶法合成。pH 5－8，酶的稳定性较好；pH 4，酶的活性大大减弱；在水中直接合成，只有很少量的头孢氨苄生成，加入与水互溶的有机溶剂（甲醇和三甲醇二甲醚）有一定好的效果，头孢氨苄平衡浓度增加2－3倍，最大为0.25mmo1/L (36%三甲醇二甲醚，30℃，3d)。研究了不同侧链对产品平衡浓度影响，侧链有苯乙酸、α-溴苯乙酸、L-马来酸、D-马来酸、对羟基马来酸、吲哚乙酸。研究发现，当侧链为苯乙酸，产品平衡浓

度最大 (2.8mmol/L)，当侧链带有α羟基苯乙酸（即马来酸），产品平衡浓度小（最小0.6mmol/L）。结果表明，侧链结构对产品平衡浓度影响很大。酶可以是游离酶，也可以是固定化酶，来源E.coli。虽然，热力学控制的头孢氨苄酶法生产头孢氨苄，由于产品平衡浓度低，应用价值不大，但提示对某些β-内酰胺抗生素，由于侧链结构特性，热力学控制的酶催化缩合有可能实施。 Diender等报道了热力学控制阿莫西林酶法合成，在水溶液中，加入青霉素G酰化酶（来源E.coli），同时加入有机溶剂，提高阿莫西林合成平衡常数和合成缩合收率。 Ulijn等报道，以青霉素酰化酶（粗酶，游离态）为催化剂，通过沉淀产品

制备酸性和两性离子β-内酰胺抗生素的研究。将苯乙酸和氨水溶液、底物6-APA （悬浮物）直接加入到反应器中，加入酶催化剂，一边反应一边将产品沉淀。这种热力学控制酶催化反应对青霉素G可行，但对两性β-内酰胺抗生素阿莫西林则不行。研究发现，通过加人某些相反离子，使其有利沉淀。阿莫西林阴离子与Zn2+阳离子形成溶解性差的盐。 Zn2+离子加入尽管使β-内酰胺降解，但使缩

合收率增加至少30倍，产品平衡浓度可达30mmol/L。 由于热力学控制的酶催化缩合β-内酸胺抗生素反应，现阶段缩合收率还较

低，应用价值还不大。 (2)动力学控制的酶催化缩合反应

此类反应酰基配体需活化，而酰基配体活化一般是形成酰胺类化合物或酯类化合物。Vroom报道，将苯甘氨酸、对羟基苯甘氨酸制成相应的酰胺衍生物，在青霉素酰化酶作用下，此酶固定在包含凝胶和由氨基酸组成的多聚体上，酶来源于Escherichia coli、Acetobacter pasteuri- anum、Xanthomonas citrii、Kluyvera citrophila、Bacillus megaterium、Alcaligenes faecalis, 反应温度0－35℃，最适

为10℃，pH5－9，合成了头孢氨苄、头孢羟氨苄、氨苄西林、阿莫西林。用此方法，也可合成头孢拉定、头孢克洛、头孢丙烯。Boesten等报道，7-ADCA与苯甘氨酰胺缩合得到头孢氨苄，并将母核7-ADCA 从母液中回收。 van Doren报道将底物母核通过pH调节，使其达到过饱和浓度，在青霉素

酰化酶（最好固定化）作用下（酶来源Acetobacter pasterurianuyn、Alcaligenes faecalis、Bacillus megaterium、Escherichia coli、Fusarium oxysporum、Xanthomonas citri等），与相应侧链酰胺缩合，得到产品。这种方法比不将底物母核调到过饱和浓度的转化率高10%左右，母核与侧链摩尔比不大于2.5。用此方法合成了头孢克洛、头孢氨苄。 侧链形成酯类化合物中，形成甲酯的较多。Youshko等报道，6-APA与侧链

苯甘氨酸甲酯在青霉素酰化酶ATCC11105（游离态，来源Escherichia coli ）作用下，合成氨苄西林。青霉素酰化酶催化水溶液中氨苄西林合成主要由初始底物浓度决定。比较了均相体系中和非均相体系中酶合成反应。在“水溶液-沉淀”非均相体系中，通过形成过饱和溶液进行，然后沉淀产品氨苄西林使得生物催化过程良好进行，使得氨苄西林转化率由6-APA计为93%。最近还有报道，侧链与多醇（如乙二醇）形成含羟基的酯，再与母核在酶的催化下缩合，转化率高达99%，此方法尤适于头孢丙烯、头孢羟氨苄的合成。 在酶法制备β-内酰胺抗生素的过程中，一般使用经固定化技术处理得到的固定化青霉素酰化酶，而早期使用的固定化细胞等形态的酶，因其形态结构和性能方面的缺陷，目前已不再使用。随着固定化酶技术进步，和对固定化酶在反应中失活原因的深人研究，固定化酶的使用寿命已经大大延长，半数失活(half-life)已经达到50-100批次。 在制备β-内酰胺抗生素的酶缩合反应过程中，不可避免地会产生逆反应—

—水解反应，即反应产物由于酶的作用再逆分解成原料，这对提高反应产率是很不利的，为提高酶缩合反应的产率，侧链对母核的投料量大大过量，这造成了侧链的过高消耗，并在产品中引入了不需要的杂质，对生产来说仍是不经济的。MauriZi报道酶缩合反应制备头孢氨苄，向反应体系中加人少量的酶抑制剂（苯

乙酸、苯氧乙酸、扁桃酸等），可降低酶解作用，同时又不会对酶催化缩合反应产生太大的影响，从而可以得到较高的反应产率，大大降低侧链的投料量，使侧链与母核的投料比例降到2:1以下。 2.2 酶催化氯化反应 酶催化β-内酰胺抗生素合成研究，对其酰化缩合反应报道较多。最近，开始对酶催化氯化反应有研究报道。从微生物Rathayibacter种中分离制备对头孢菌素氯化过氧化物有活性的酶，在pH6.0磷酸盐缓冲液中，加人氯化钠和3%过氧化氢溶液，此种酶可将廉价的头孢氨苄转为价高的头孢克洛。仅有Rathayibacter biopuresis能产生头孢菌素氯化过氧化物酶。现转化率不高，如能

提高转化率，将对头孢克洛的生产产生巨大的影响。 2.3“一锅法”酶法研究情况 酶法合成β-内酰胺抗生素，一般一步反应在一个反应器中进行，近年来，有人将几步酶法反应（例如水解/缩合或缩合/缩合等）在一个反应器中进行，这样，不需分离中间体，简化了过程，有利于工业化生产，这将是酶法合成的趋势之一。 Ternadez-Lafuente等报道新型化学酶法合成头孢唑林，通过D-氨基酸氧化

酶、戊二酰化酶和青霉素G酰化酶催化作用，生物转化头孢唑林。以头孢菌素C为起始原料，在水溶性中，经三步酶法和一步化学法合成头孢唑林，不分离纯化中间体，每步酶法收率接近100%。先将头孢菌素C酶法脱乙酰基，然后由 DAO和GA催化，再由PGA固定化酶（来源Esherichia coli ATCC11105）进一步催化酰化7-ACA，得到7-[(1H-四氮唑)-乙酰氨基]-3-乙酰氧甲基-△3-头孢烷酸，最后与MMTD侧链化学法缩合得到头孢唑林。 Wegman等报道，自苯甘氨酸腈二步酶法转化，一锅法制备头孢氨苄。腈

水解酶（来源R. rhodochrous）催化水解D-苯甘氨酸腈为酰胺，然后在青霉素酰化酶(E.C.3.5.1.11)作用下，7-ADCA与 D-苯甘氨酰胺缩合，得到头孢氨苄。然后将1，5-二羟基萘加至反应液中，与头孢氨苄一起结晶，这使得反应液头孢氨苄浓度很低，避免了水解，收率79%，合成/水解比7.7。研究还显示D-苯甘氨酸腈对青霉素 G酰化酶有明显选择抑制作用。 Schnien等报道己二酰7-ADCA水解和头孢氨苄酶法合成一锅法完成，所用

酶为固定酰胺化酶（来源 Escherichia coli），缩短了头孢氨苄制备过程。

酶水解 苯甘氨酸酯或酰胺 己二酰7-ADCA————→7-ADCA————————→头孢氨苄