H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定
Ｈ９亚型禽流感病毒的分离与鉴定
摘要 从临床表现呼吸困难并伴有啰音、肺部和支气管黄色干酪样栓塞为特征的病鸡肝脾肺混合匀浆中分离到1株病毒(yd株),该病毒能凝集鸡红细胞并能被aiv h9标准阳性血清抑制,对热不稳定且对热敏感;对鸡胚和番鸭胚的最小致死量分别为10-7和10-6,其mdt分别为78h和70h;鸡胚尿囊液毒的ha效价和eid50明显高于番鸭胚尿囊液毒;能扩增出大小约为1 027bp的特异性目的片段。结果表明,该分离毒为h9亚型禽流感病毒。
关键词 h9亚型禽流感病毒;分离;鉴定
中图分类号 s858.31 文献标识码 a 文章编号
1007-5739(2009)13-0303-03
禽流感病毒(avian influenza virus,aiv)属正粘病毒科流感病毒属a型流感病毒。禽流感又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟,被国际兽医局(oie)列为a类传染病。aiv h9亚型为低致病性禽流感病毒,主要引起禽类产蛋量下降,肉鸡和蛋鸡的复合型呼吸道疾病乃至死亡,可使养禽业产生重大损失。
2007年11月,福建省某鸡场发现80～90日龄的大鸡出现精神萎顿、羽毛松乱、食欲减退、呼吸困难并伴有啰音为特征的病例,并很快地传染给小鸡,2 000羽鸡1周内连续死亡200羽。死亡鸡病理剖检可见肺部和支气管里有许多黄色干酪样栓塞,部分死亡鸡支气管剖开有白色分泌物。通过病毒分离、电镜观察、血清学和rt-pcr鉴定确定为h9亚型禽流感病毒,现将结果报道如下。 1 材料与方法
1.1 试验胚及动物
番鸭胚、鸡胚、30日龄无母源抗体雏鸡等均来自非疫区。
1.2 标准阳性血清及单克隆抗体
抗新城疫病毒(ndv)阳性血清购于中国兽药监察所;抗减蛋综合征(edsv76)阳性血清和抗h5、h7、h9亚型禽流感病毒阳性血清均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。抗新城疫病毒(ndv)单抗和抗鸡传染性法氏囊病病毒(ibdv)单抗均由实验室保存。
1.3 试验试剂
trizol ls reagent,rnasin,m-mlv购自invitrogen公司,rtaq聚合酶、dntps、pmd18-t、感受态细胞dh5α购自大连宝生物工程公司。
1.4 病毒分离
1.4.1 病料采集及处理。无菌采集死亡鸡的心、肝、脾、肺、肾,剪碎研磨,以hank’s液制成1∶5匀浆,加双抗各1 000u,4℃过夜,冻融3次,7 000rpm离心10min,取上清液供接种病料。
1.4.2 病毒分离。取处理的病料上清液经尿囊腔接种9日龄鸡胚3枚,0.1ml/枚,37℃孵化,观察2次/d,弃去24h内的死胚,收取24～120h的死胚或活胚,置4℃过夜后,收获鸡胚尿囊液,并观察胚胎病变。
1.5 血清学鉴定
1.5.1 间接免疫荧光抗体(ifa)试验。取死胚的心脏冷冻切片,冷丙酮固定后,按常规方法[1]用抗ndv和ibdv单抗进行间接荧光抗体试验。
1.5.2 血凝价(ha)测定。参照allan等[2]的报道,测定鸡胚尿囊液的ha价。
1.5.3 血凝抑制试验(hi)。用4个血凝单位的分离毒(第3代胚液毒)分别与抗新城疫、抗edsv76 和aiv h5、h7、h9等标准阳性血清,按微量法进行hi试验[3]。
1.6 分离毒生物学特性
1.6.1 血球凝集(ha)试验。采集小白鼠、鸽、鸭和鸡的红细胞,按常规方法进行ha试验。
1.6.2 血凝素热稳定性试验。将第3代胚液毒(yd3)分装于灭菌离心管,于56℃水浴分别作用0min、5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min,测定各自的ha效价。
1.6.3 耐热性试验。将第3代胚液毒分装于灭菌离心管,于50℃水浴分别作用10min、20min、30min、60min,60℃水浴分别作用10min、20min、30min后,分别接5枚非免疫鸡胚,37℃培养,收集鸡胚尿囊液测定ha效价。
1.6.4 对鸡胚、番鸭胚的eld50和最小致死量平均死亡时间(mdt)的测定。将分离毒用hank’s液作连续10倍倍比稀释,每个稀释度接种4枚9日龄鸡胚或12日龄番鸭胚,0.1 ml/枚,37℃孵化,弃去24h内的死胚,以后每2h照蛋1次,记录胚胎死亡情况,按karber氏法计算eld50。根据文献计算全部胚胎死亡的最高稀释度mdt[4]。 1.7 rt-pcr鉴定
1.7.1 病毒rna的提取。取感染aiv h9n2鸡胚尿囊液250 μl,加入750μl trizol ls reagent rna提取液,混匀,室温放置15min,加入200μl氯仿,振荡混匀,4℃ 12 000rpm离心15min,取上清加入500μl异丙醇,室温放置10min后12 000rpm离心10min,弃上清,75%乙醇除盐,倒置滤纸上吸掉剩余液体,干燥后悬于25μl的depc水中,备用。
1.7.2 引物设计。根据禽流感m基因全长序列,用oligo 6软件设计1对引物如下:上游引物p1为5′-agcaaaagca ggtagatg-3′,下游引物p2为5′-agtagaaacaaggta gttttttac-3′,以上引物由大连宝生物takara公司合成。
1.7.3 rt-pcr反转录聚合酶链式反应。①rt采用20μl体系,在pcr反应管中分别加入7μl已制备的rna,加入1μl下游引物(20pmol),70℃热吸附10min,冰浴10min,继续加入5×first
standing buffer 4μl,10mm dntps 2μl,0.5μl反转录酶(m-mlv)5u/μl,0.25μl rna酶抑制剂(40u),用无rna酶水调至总体积20μl,瞬时离心混匀。反应程序:30℃ 10min,42℃
60min,99℃ 5min。②m基因的扩增用50μl体系。以制备好的cdna
2μl作模版,加入相应的上、下游引物(20pmol)各1μl,2.5mm
dntps 4μl,10×buffer 5 μl,rtaq 1μl,灭菌水36μl,反应体系50μl。在pcr扩增仪内进行扩增,扩增条件为95℃预变性 5min,然后94℃ 变性1min、53℃ 变性1min、72℃延伸2min,35个循环,最后72℃延伸10min。结束后取pcr产物4μl,在1%琼脂凝胶上电泳检查,然后在紫外灯下观察结果,自动凝胶成像扫描仪拍照及处理。
1.8 人工感染试验
将分离毒鸡胚尿囊液毒原液经腿肌注射30日龄雏鸡3羽,每羽0.5ml;另取3羽,注射生理盐水,每羽0.5ml,隔离饲养。观察发病情况和临床症状,并从病死鸡中进行病毒分离或测定耐过鸡血清抗体。
2 结果与分析
2.1 病毒分离
鸡胚接种病料96h后开始死亡,死胚的胚体呈弥漫性充血、出血,其ha效价为27。连续盲传3代,病毒增殖趋于稳定,接种分离毒36h开始死亡,其ha效价为29。分离毒按karber氏法计算对鸡胚的eld50为10-5.5。
2.2 血清学鉴定
2.2.1 ifa试验。死胚心脏冷冻切片,经抗ndv和ibdv单抗染色后,均未发现有荧光病灶。
2.2.2 血凝抑制试验(hi)。分离毒的血凝特性能被aiv h9标准阳性血清所抑制,但不被新城疫、减蛋综合征和aiv h5、h7标准阳性血清所抑制。
朱鹮低致病性禽流感病毒的分离与鉴定
动物医学进展。２０１ｌ，３２（２）：４２ ４４ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 朱鹦低致病性禽流感病毒的分离与鉴定 李六斤，毛峰峰，师长宏，张 海，赵 勇，张彩勤，白 冰 （第四军医大学实验动物中心，陕西西安７１００３２） 摘 要：为了掌握朱鹗禽流感病毒流行情况，利用鸡胚分离方法从病死朱鹗脑组织标本中分离出禽流感 病毒毒株，并将所分离的病毒进行血凝试验、血凝抑制试验、鸡胚最小致死量平均死亡时间（ＭＤＴ）、半数致 死量（ＬＤｓｏ）及１日龄鸡脑内接种致病指数（ＩＣＰＩ）试验。结果表明，所分离的病毒均能够凝集鸡、肉鸭、绵羊、 山羊、猪、人、兔等的红细胞，且这种血凝性可被Ｈ９型标准抗体血清所抑制，所分离毒株的ＭＤＴ为４８ ｈ， ＬＤ５ｏ指数为５Ｏ ，ＩＣＰＩ为１．５４４。以上结果表明所分离的病毒为低致病力禽流感毒株。 关键词：朱鹨；禽流感病毒；分离鉴定 中图分类号：￥８５２．６５９．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１１）０２—００４２—０３ 禽流感（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＡＩ）是由禽流感病毒 （Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ，ＡＩＶ）引起的一种能感染几 乎所有野生和家养禽类的急性高度接触性传染 病［１］。ＡＩＶ属甲型流感病毒，有不同的亚型，依据其 血凝素（Ｈ）和神经氨酸酶（Ｎ）蛋白抗原性的不同，目 前可分为ｌ５个Ｈ亚型（Ｈ１～Ｈ１５）和９个Ｎ亚型 （Ｎ１～Ｎ９）。根据ＡＩＶ致病性的不同，可以将禽流 感病毒分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无 致病性禽流感。ＡＩＶ引起的禽流感已被世界动物卫 生组织（ＯＩＥ）列为Ａ类传染病。ＡＩＶ的感染谱很 广，大多数的禽类都可感染，以鸡、火鸡和某些野禽 最易感，鸭、鹅及其他水禽为隐性感染或带毒，有时 会诱发疾病并引起死亡，造成严重的经济损失［２］。 我国自１９９３年以来在鸡、鸭、鹅、鸽等家禽中经血清 学调查证实有ＡＩＶ阳性禽群存在或已分离到Ａ型 禽流感病毒。据报道，迄今为止，我国已分离的ＡＩＶ 有Ｈ４、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９和Ｈ１４等亚型Ｌ３ｊ。ＡＩＶ （ＨＳＮ１）主要能使鸡、鸭等禽类感染发病，也可以感 染人类，且致病力强，病死率高。朱鹦属珍稀鸟类， 为国家一级保护动物，数量稀少。截至目前，国内还 没有分离朱鹦流感病毒株的报道。为了解ＡＩＶ毒 株在朱鹦体内的流行状况，本试验首次在国内从朱 鹦体内分离到Ａ型禽流感病毒毒株，为以后对其致 病性和其他相关特性的研究提供了基础，同时也为 我国更好地预防和控制朱鹪禽流感的发生和流行， 防止其自然减员提供了技术支持。 １材料与方法 １．１ 材料 标本采自陕西某地动物保护区；９日龄非免疫 鸡胚，ｉ日龄及６周龄ＳＰＦ鸡，由杨凌绿方生物工程 有限公司提供；Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９亚型禽流感病毒阳性血 清，均为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所产品。 １．２ 方法 １．２．１ 标本处理取病、死朱鹦的肝、肺、脾剪碎研 磨以Ｈａｎｋ Ｓ液制成１：５匀浆，分别加双抗各 １ ０００单位／ｍＬ，４℃过夜，冻融３次，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离 心１５ ｍｉｎ，取上清液备用。 １．２．２ 病毒分离 取经过处理的病料上清液，经 尿囊腔接种９日龄非免疫鸡胚３枚，０．１ ｍＬ／枚， ３７℃孵化，观察２次／ｄ，弃去２４ ｈ内的死胚，收集 ２４ ｈ～１２０ ｈ的死胚或活胚，置４℃过夜后，收获鸡 胚尿囊液，并观察胚胎病变。 １．２．３ 血凝和血凝抑制试验 按常规方法制备 １０ ｍＬ／Ｌ鸡红细胞悬液，对病毒尿囊液进行微量血 凝（ＨＡ）试验，按Ｉ３微量法分别应用禽流感病毒 （Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９亚型）标准阳性血清进行ＨＩ试验［４ ］。 １．２．４ 鸡胚ＭＤＴ和ＬＤ 。的测定 将所分离毒株 用无菌Ｈａｎｋ Ｓ液作１Ｏ倍递增稀释，取１Ｏ ～ｌＯ 每个稀释度接种９日龄非免疫鸡胚６枚，对照组接 种无菌Ｈａｎｋ Ｓ液，０．１ ｍＬ／枚，置３７℃继续孵化。 接种后２４ ｈ照蛋１次，弃去死胚，以后每１２ ｈ照蛋 １次，记录鸡胚的死亡时间，持续９６ ｈ ］。ＡＩＶ对 收稿日期：２０１０—０８－２７ 基金项目：陕西省自然科学研究计划项目（２０Ｏ４Ｃ１—２５） 作者简介：李六斤（１９５２一），男，陕西合阳人，教授。主要从事动物病毒学研究。
三株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析
动物医学进展。２０１２，３３（５）：１－７ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
三株Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒全基因组序列分析
刘国乾，曹 蓝，和 君，冯军祥，张长辉，田 进，焦培荣，亓文宝，廖 明
（华南农业大学兽医学院，人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室，农业部兽用疫苗创制重点实验室，
广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州５１０６４２）
摘 要：采用ＲＴ—ＰＣＲ对３株Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒基因组进行扩增，测序后再利用ＤＮＡＳｔａｒ和
ＭＥＧＡ ４对所得到的序列和部分具有代表性的参考序列进行遗传演化及分子特点分析，旨在从分子水平探
讨华南地区Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒的流行特点，为该病的综合防控提供依据。结果表明，３个分离株ＣＫ／
ＧＤ／１６２／０３、Ｆｒａｎｃｏｌｉｎ／ＧＤ／２９８／０５与ＣＫ／ＧＤ／Ａ８／１０分别属于Ｂ３４、Ｂ４７和Ｂ５４基因型；３个分离株ＨＡ基
因未发生明显的变异，符合我国大陆Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ ＨＡ基因的遗传进化特点，但内部基因出现不同程度
重组且部分基因与人源高致病性Ｈ５Ｎ１亚型ＡＩＶ同源性很高；ＣＫ／ＧＤ／１６２／０３、Ｆｒａｎｃｏｌｉｎ／ＧＤ／２９８／０５两
株分离株具有宿主多样性。因此，对华南地区Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ进行监控及分子流行病学调查具有重要意
义。
关键词：禽流感病毒；Ｈ９Ｎ２亚型；基因重组；遗传演化
中图分类号：￥８５２．６５９．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１２）０５—０００１—０７
禽流感病毒（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ，ＡＩＶ）变异
频繁，血清亚型众多，迄今已发现１６种ＨＡ亚型和
９种ＮＡ亚型。１９６６年，Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ首次分离
于北美洲，１９９４年在中国大陆首次分离到，并逐渐
成为中国大陆流行的ＡＩＶ亚型［１］。近年的研究结
果表明，Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ的ＨＡ基因大部分来自于
H9N2亚型禽流感的流行动态及其防制策略
《上海畜牧兽医通讯》２０１３年第２期 ・ ５１ ・
Ｈ ９ Ｎ２亚型禽流感的流行动态及其防制策略
陆国庆 （１阜新蒙古自治县平安地畜牧兽医职高 路卫星 王景春
１２３１０９ ２辽宁农业职业技术学院畜牧兽医系
禽流感根据致病性的不同，可以分为高致病性禽流感 （ＨＰＡＩ）和低致病性禽流感（ＬＰＡＩ）。高致病性禽流感一旦
发生会造成家禽的大批死亡，所以高致病性禽流感病毒已被 各国政府高度重视，采取了各种措施来严密监控高致病性禽
流感的发生和流行。 高致病禽流感所造成的危害往往是迅即的、猝不及防
的。与之相比，低致病禽流感的发生是潜在性的，但也可以
给养禽业带来灭顶之灾，对人类的威胁同样严重。低致病性 禽流感病毒的流行特点就是分布极为广泛，危害持久和难以
控制。尤其是Ｈ９Ｎ２禽流感病毒（Ａ１Ｖ），不仅在全世界范围 的禽类中广泛流行，而且可以感染人，同时还是１９９７年香港
禽流感感染人事件的Ｈ５Ｎ１ ＡＩＶ的内部基因的供体，因此， 对Ｈ９Ｎ２ ＡｌＶ的研究工作也非常重要。为了阐述Ｈ９Ｎ２亚
型禽流感的流行动态及其防制策略，本文分别从病原学、流
行动态、发病特点、诊断和防治等几个方面阐述了东北地区
Ｈ９Ｎ２亚型禽流感的现状。
１ Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病原学与流行病学
Ｈ９Ｎ２亚型禽流感是低致病性禽流感 。其病毒（ＡＩＶ）
属于正粘病毒科、正粘病毒属；病毒粒子多呈球形，为８Ｏ～ １２ｏ ｎｍ的直径，表面有１Ｏ～１２ ｎｍ的密集钉状物或纤突覆
盖，包括血凝素（ＨＡ）和神经氨酸酶（ＮＡ）两种不同形状的 表面钉状物，病毒囊膜内有螺旋形核衣壳。ＡＩＶ属于单股负
链ＲＮＡ病毒，其基因组由８股ＲＮＡ节段构成，分别编码不
同蛋白。病毒的基因组极易发生变异，其中以编码ＨＡ的基
因突变率最高，其次为ＮＡ基因。不同的ＨＡ和ＮＡ之间可 能发生不同形式的随机组合，从而构成许多不同亚型。多数
亚型属非致病性或低致病性。ＡＩＶ所有毒株均对热比较敏 感，抵抗力弱，５６℃加热３０ ｍｉｎ、６０℃加热１０ ｍｉｎ，６５～
2021—2022年广州市南沙区肉菜市场外环境禽流感病毒检测及分型报告
CHINA FOOD SAFETY 145分析检测2021—2022年广州市南沙区肉菜市场外环境 禽流感病毒检测及分型报告
刘晓红，黄国财，梁莹莹（广州市南沙区疾病预防控制中心，广东广州 511458）摘 要：为了解南沙区肉菜市场外环境中禽流感病毒的流行特点和趋势，为预防人感染禽流感病毒提供依据，本项目从2021年1月到2022年6月，历时共18个月，一共采集南沙区8个街镇的肉菜市场外环境相关样本1 160份，采用实时定量RP-PCR的检测方法进行禽流感病毒的H5/H7/H9分型检测。Ct值≤32.00时结果判定为阳性，共有184份样本检出禽流感病毒，检出率为15.86%。其中，9份检出禽流感病毒H5亚型，检出率为0.78%；173份检出禽流感病毒H9亚型，检出率为14.91%；H5和H9混合亚型阳性2份，检出率为0.17%；所有样本均未检出禽流感病毒H7亚型。检测结果提示南沙区肉菜市场外环境中存在一定的禽流感病毒传播风险，应通过定期的消毒和清洁等措施，降低此风险。关键词：禽流感病毒；肉菜市场；外环境；检测2021—2022 Avian Influenza Virus Detection and Classification Report Outside the Meat Market in Nansha District, GuangzhouLIU Xiaohong, HUANG Guocai, LIANG Yingying(Guangzhou Nansha District Center for Disease Control and Prevention, Guangzhou 511458, China)Abstract: In order to understand the epidemic characteristics and trends of avian influenza virus in the external environment of the meat and vegetable market in Nansha District and provide a basis for preventing human infection with the avian influenza virus, this project took a total of 18 months from January 2021 to June 2022 to collect a total of samples related to the environment outside the meat market in 8 streets and towns in Nansha District 1 160 samples, using real-time quantitative RP-PCR detection method for H5/H7/H9 classification of avian influenza virus, judged to be positive by Ct value ≤32.00. A total of 184 samples detected avian influenza virus, with a detection rate of 15.86%, 9 of which detected avian influenza disease The detection rate of H5 subtype is 0.95%, and 173 cases have detected the H9 subtype of avian influenza virus, with a detection rate of 15.09%, and 2 positive cases of H5 and H9 subtypes, with a detection rate of 0.17%. All samples have not detected the H7 subtype of avian influenza virus. The test results indicate that there is a certain risk of avian influenza virus transmission in the external environment of the meat and vegetable market in Nansha district, which should be reduced through regular disinfection and cleaning measures.Keywords: avian influenza virus; meat and vegetable market; external environment; detection禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV），为单股负链RNA病毒，属正粘病毒科、流感病毒属甲型流感病毒。按照致病性强弱，可分为高致病性、低致病性和非致病性3类。依据其外膜血凝素（H）分型，目前已知可感染人类发病的主要为H5、H7及H9亚型。禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护性，使得近年来全球多国和地区禽流感疫情频发，而在我国已报告有多次人感染禽流感病毒的事件。因其节段RNA病毒自身特性，部分亚型以抗原漂移和抗原转换的方式作者简介：刘晓红（1983—），女，广东广州人，本科，主管技师。研究方向：疾控检验。146 食品安全导刊 2023年8月（中）分析检测
两株H9N2亚型禽流行性病冒病毒HA基因序列分析
第１８卷 第３期 ２ ０ ０ ２年９月 病 毒 学 报 Ｓ ＪＱＵＲＮＡＬ ０Ｆ ＶＩＲＩ Ｖ０Ｉ．１８ Ｎｏ．３ Ｓｅｐｔ． ２ ０ ０ 两株Ｈ９Ｎ２亚型禽流行性感冒病毒ＨＡ基因序列分析 程坚，刘红旗，彭大新，张如宽，刘秀梵 （扬州大学 农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏扬州 ２２５００９） 关键词：禽流感病毒；血凝素基因；序列分析 中图分类号：￥８５８．３１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００—８７２１（２００２｝０３—０２８５ ０３ 禽流感（ＡＩ）是由Ａ型流行性感冒（流感）病毒 引起的一种严重危害禽类健康的传染性疾病。禽类 感染禽流感病毒（ＡＩＶ）后，症状可表现为非显性感 染，亚临诊感染，或轻度呼吸道疾病，产蛋量降低，直 至急性全身致死性疾病等多种形式。根据ＡＩＶ对 易感鸡致病性的差异，可将ＡＩＶ分为高致病性和低 致病性ＡＩＶ。高致病性ＡＩＶ对养禽业具有毁灭性 打击，故被国际兽疫局规定为Ａ类疾病；而一些低 致病性ＡＩＶ的感染虽然对家禽的危害性较小，但亦 可引起蛋鸡产蛋量下降，并造成免疫抑制，因而在普 遍存在复合感染的情况下，对养禽业造成的经济损 失也相当可观。因此，ＡＩ一直是威胁世界养禽业的 主要疾病之一，世界各国都十分重视对ＡＩＶ的研究 工作 。 于康震等人的研究表明，近年来在我国许多地 区都广泛存在着低致病性禽流感病毒的流行＿２ Ｊ，引 起了国内兽医界的高度重视。最近本室也从华东地 区发病鸡群中分离到数株低致病性禽流感病毒，经 国家流感中心鉴定为Ｈ。Ｎ２亚型。为了从分子水平 上研究这些Ｈ。亚型禽流感病毒的分布、流行规律 以及为控制禽流感在我国的流行打下一定的基础， 我们采用Ｐｈａｒｍａｃｉａ生产的Ｔｉｍｅｓａｖｅ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅ— ｓｉｓ Ｋｉｔ以及ＲＴ—ＰＣＲ方法，克隆、测定了其中两株 ＡＩＶ（Ｌ株和ｓ株）的｝｛Ａ基因的全序列，并结合国 内外已发表的Ｈ。亚型禽流感病毒的｝｛Ａ基因序列 进行了初步序列分析。 测序结果表明，我们克隆的｝｛Ａ基因共有１ ７０８ 个核苷酸，包含｝｛Ａ完整的阅读框架区的１ ６８０个 核苷酸，共编码５６０个氨基酸，其中前１８个氨基酸 为信号肽序列，｝｛Ａ有３１９个氨基酸，ＨＡ２有２２３个 收稿日期：２０００—０７—０３修回日期：２００１—０２—０９ 作者简介：程坚（１９７１～），男，博士生，研究方向为基因工程疫 联系作者：刘秀梵 氨基酸，其部分氨基酸序列见图１。 初步序列分析表明，本室分离的两株ＡＩＶ的 ｝｛Ａ的信号肽１８个氨基酸中有７个不同于国外毒 株ＡＩＶ［Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／６６（Ｈ９Ｎ２）］，是整 个｝｛Ａ基因中变异频率最高的部位。Ｎｏｂｕｓａｗａ Ｅ 等人的研究也表明，信号肽序列为｝｛Ａ基因的高变 区＿３ Ｊ。这可能是由于信号肽的功能主要是使得蛋 白质能被定向转运，而成熟的蛋白质中并不含有该 序列，故它所受的选择性压力较小。由于变异较大 的信号肽序列位于｝｛Ａ基因的起始部位，所以起初 我们根据Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２／６６（Ｈ９Ｎ，）｝｛Ａ的 信号肽序列设计引物，以ＲＴ—ＰＣＲ方法扩增本室 分离到的两毒株的｝｛Ａ基因没有成功。其后在进行 ｃＤＮＡ合成时，我们就应用｝｛Ａ这段特异性序列和 非通用引物，极大地提高了ｃＤＮＡ文库中的阳性克 隆率，减少了筛选工作量，从而较快地得到了｝｛Ａ阳 性克隆。 在进行序列测定之前，已用血清学方法证实我 们分离的两株Ｈｑ亚型ＡＩＶ与国外毒株ＡＩＶ［Ａ／ Ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／６６（Ｈ９Ｎ２）］的抗原性差异较 大；而序列测定结果也表明，本室所分离的两株Ｈｑ 亚型ＡＩＶ的｝｛Ａ基因之间氨基酸同源性高达９６％， 而它们与毒株Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／６６（ＨｑＮ２）的 ｝｛Ａ基因的同源性较低，氨基酸和核苷酸的同源性 分别为９０％和８９％。但是在｝｛Ａ基因编码的５６０ 个氨基酸中，相对保守的８５个氨基酸中只有一个发 生了变异，而其余５９个发生变异的氨基酸也仅是由 于核苷酸点突变引起的，不存在移码突变和缺失突 变的现象。对流感病毒的研究表明，同一亚型内 ｝｛Ａ的氨基酸同源性一般在８０％～１００％＿４ｊ。以这 个标准来看，本室分离的两株Ｈ。亚型的ＡＩＶ亲缘 关系很近，可能来源相同，但与国外毒株ＡＩＶ［Ａ／ Ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／６６（Ｈ９Ｎ２）］的亲缘关系较远。 为了进一步探讨这两株ＡＩ
禽流感H9亚型病毒WD株毒种的纯化研究
２００６，４０（８）：１～４／姜北宇，等 中国兽药杂志
禽流感Ｈ９亚型病毒ＷＤ株毒种的纯化研究
姜北宇 ，赵继勋 ，张国中 ，景小冬 ，黄凤军 ，章振华
（１．北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京１０００８９；２．中国农业大学实验动物研究所，北京１０００９４） ［收稿日期］２００６—０４—０３［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２—１２８０（２００６）０８—０００１—０４［中圈分类号］７３８５２．６５９．５
［摘要］ 采用鸡胚终点稀释法并结合ＮＤ抗血清中和法对禽流感Ｈ 亚型病毒ＷＤ株毒种进
行了纯化。将纯化的ＷＤ株毒种在ＳＰＦ鸡胚连续传１２代，对各代次毒种进行了毒价测定，选择
一定代次的毒种进行了免疫原性试验及外源病毒检验。结果表明，ＷＤ株在鸡胚中连续传１２代，
其ＨＡ价稳定在１：５１２—１：１ ０２４，毒价在１０ 一一１０ ＥＩＤ∞／０．１ｍＬ；不同代次毒种不含外源病毒，
免疫原性均符合要求。由此可见，毒种的纯化方法是有效的，将ＷＤ株毒种限制在１２代内是可行
的，并建立了该毒种的种子批。
［关键词］ Ｈ 亚型禽流感病毒；纯化；外源病毒
为了确保在疫苗生产过程中种子质量均一，笔
者进行了禽流感Ｈ。亚型病毒ＷＤ株毒种的纯化及
传代试验，并对各代次毒种进行了毒价测定、免疫
原性测定及外源病毒检验。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１鸡胚从北京实验动物中心购入ＳＰＦ鸡种
蛋，北京某种鸡场购入非免疫种蛋，在本研究室孵
化至１０日龄时接种，ＳＰＦ鸡胚用于毒种传代及毒
价测定，非免疫种蛋用于制苗抗原液的生产。
１．１．２试验鸡从北京实验动物中心购入的３周
龄ＳＰＦ白色来航公雏鸡。
１．１．３ 试验用鸡血清鸡新城疫阳性血清，由中
国农业大学实验动物研究所赵继勋老师馈赠；禽流
感Ｈ０亚型阳性血清由本组自制。
１．１．４外源病毒检验试剂禽流感（ＡＩ）、新城疫
（ＮＤ）ＨＩ诊断抗原，购自哈尔滨兽医研究所；产蛋
下降综合征（ＥＤＳ）ＨＩ诊断抗原，购自中国兽医药
H9N2亚型禽流感病毒辽宁分离株HA1蛋白的原核表达
动物医学进展，２０１３，３４（１０）：８９—９１ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒辽宁分离株ＨＡ１蛋白的原核表达
陈 欣 ，张乐萃 ，卢春晓。，尹燕博¨
（１．青岛农业大学动物科技学院，山东青岛２６６１０９；２．青岛即墨市畜牧兽医局，山东青岛２６６２００）
摘 要：为表达Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒的ＨＡ１蛋白，从Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒辽宁分离株中扩增其
ＨＡ１基因片段，将扩增得到的ＨＡ１基因克隆至原核表达载体ｐＯＥＸ一６ｐ一１中，转化到ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行表 达。结果表明，ＩＰＴＧ诱导融合蛋白表达条件确定最佳诱导时间为８ ｈ，ＩＰＴＧ最佳终浓度为０．８ ｍｍｏｌ／Ｌ。
经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析鉴定，表达产物的分子质量约为６１ ｋｕ。 关键词：ＨｇＮ２亚型禽流感病毒；疫苗；大肠埃希茵；表达
中图分类号：￥８５２．６５９．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１３）１０—００８９—０３
禽流感是由Ａ型流感病毒引起的一种禽类的
感染或疾病综合征。自１９６６年Ｈｏ Ｍｅｅ从患温和
呼吸道病的火鸡中分离到第１株Ｈ９Ｎ２亚型禽流感 病毒后，禽流感在世界范围内迅速流行［１ ］。随着
Ｈ９亚型禽流感病毒灭活疫苗的广泛应用，低致病性 禽流感的疫情有所缓解 ］，但近年来随着规模化养 殖的覆盖面越来越广，Ｈ９亚型禽流感也时常发生，
最主要的原因就是由于灭活疫苗免疫压力下的病毒
变异，造成免疫失败。本试验旨在表达能够制备亚 单位疫苗的蛋白，以预防Ｈ９亚型禽流感。
禽流感病毒属于正黏病毒科，Ａ型流感病毒属， 基因组由８段线状单股负链ＲＮＡ构成，第４节段
ＲＮＡ编码病毒的血凝素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）蛋
白，ＨＡ是构成病毒囊膜纤突的主要部分之一，它以 三聚体形式存在于病毒囊膜表面，对病毒的吸附、穿 膜、宿主特异性和致病力起关键作用［６］。ＨＡ基因
H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立
动物医学进展。２０１４，３５（１）：１２—１６ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｈ９亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管
炎病毒多重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建立
徐守振，尹燕博
（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛２６６１０９）
摘 要：根据ＧｅｎＢａｎｋ发表的Ｈ９亚型禽流感病毒（ＡＩＶ（Ｈ９））ＨＡ基因、新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ基因和 传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｎ基因分别设计了３对特异性引物，通过优化扩增条件，建立了同时检测ＡｌＶ
（Ｈ９）、ＮＤＶ和ＩＢＶ的多重ＰＣＲ方法，对其特异性和敏感性进行检验，并在临床中进行了初步应用。结果表
明，该多重ＰＣＲ方法具有良好的特异性和敏感性，可同时扩增出大小分别为３８０ ｂｐ（ＡＩＶ（Ｈ９））、５２９ ｂｐ
（ＮＤＶ）和８５３ ｂｐ（ＩＢＶ）的特异片段，能分别检出１ ｐｇ ＡＩＶ（Ｈ９）、１ ｐｇ ＮＤＶ和１０ Ｐｇ ＩＢＶ的ＲＮＡ模板，且 对ＡＩＶ（Ｈ９）、ＮＤＶ和ＩＢＶ混合感染的临床阳性病料的检测结果与单项ＰＣＲ的检测结果一致。该多重
ＰＣＲ方法可为ＡＩＶ（Ｈ９）、ＮＤＶ和ＩＢＶ的临床检测和流行病学调查提供技术支撑。 关键词：Ｈ９亚型禽流感病毒；新城疫病毒；鸡传染性支气管炎病毒；多重聚合酶链反应
中图分类号：￥８５８．３１；Ｑ７８９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１４）０１—００１２—０５
Ｈ９亚型禽流感（Ｈ９ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＡＩ（Ｈ９））、
鸡新城疫（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＤ）和鸡传染性支气
管炎（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ，ＩＢ）是严重危害养鸡业
的３种主要呼吸道疾病。２００８年１月至２００９年６
月期间，对山东潍坊、青岛和烟台三地区的临床疑似
病料中该３种病毒感染的调查结果发现，该３种病
毒总阳性率高达６５．７６％，且呈现混合感染 。ＡＩ
（Ｈ９）、ＮＤ和ＩＢ在流行病学、临床症状和病理变化 等方面极为相似，常规方法（如病原分离鉴定和血清
H9N2亚型禽流感流行现状
动物医学进展，２０１ｌ，３２（１０）：１０７—１１ｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｈ９Ｎ２亚型禽流感流行现状
孙泉云，陈 琦，夏炉明 （上海市动物疫病预防控制中心，上海２０１１０３）
摘要：低致病性禽流感主要是由ＨｇＮ２亚型禽流感病毒所引起，近几年在世界上许多国家都暴发了 Ｈ９Ｎ２亚型禽流感疫情。研究表明，ＨｇＮ２亚型禽流感病毒在陆禽中至少可分为北美和欧亚两个种系，该病
毒在自然环境中很容易发生变异，通过混合基因组分而形成不同的病毒亚型。Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒已经 能传播至哺乳动物，包括猪和人类，从而引发对其是否会成为潜在的大流行性病原体的关注。Ｈ９Ｎ２亚型禽 流感病毒感染宿主谱很广，可在家禽、野鸟、哺乳动物和人类中造成不同程度的致病性和毒力。论文重点对 Ｈ９Ｎ２亚型禽流感在家禽、野鸟、猪和人群中的流行现状进行了综述，对源自不同动物品种的Ｈ９Ｎ２亚型禽
流感病毒分离株的基因及遗传进化分析进行了阐述。 关键词：禽流感；Ｈ９Ｎ２亚型；流行状况
中图分类号：￥８５２．６５９．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１１）１０—０１０７—０５
禽流感（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＡＩ）是由正黏病毒科 Ａ型流感病毒属禽流感病毒（ＡＩＶ）引起的家禽、野
鸟和部分哺乳动物发病的一种传染病。由于ＡＩＶ 血清型众多，不同毒株间毒力差异很大，给临床诊断
和防控带来很大的问题。尤其是２００４年以来几乎 席卷全球的并致数百人死亡的Ｈ５Ｎ１亚型禽流感的
暴发，引起了我国政府和相关行政主管部门的高度 重视，通过疫苗免疫和综合监管，有效控制了ＨＳＮ１
亚型高致病性禽流感的流行蔓延。但在大力防控高 致病性禽流感的同时，却在某种程度上忽视了对Ｈ９
亚型低致病性禽流感的预防，导致１９９７年以后 Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ在中国大陆的鸡和其他家禽甚至 猪群中被分离到［１］，证实了中等毒力以下Ｈ９亚型
禽流感监测中HA和HI试验的应用
畜牧兽医科技信息
2018年第10
期禽流感（AvianInfluenza，AI）是由A型流感病毒引起的一种禽类病毒性疾病，被国际兽疫局确定为一类传染病。自1878年首次在意大利发生和流行后，140年来在世界各地多次流行，对养禽业造成重大经济损失。某种病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验。当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝抑制试验。1材料与仪器本文所用病毒尿囊液、血清皆由扬州大学兽医学院畜禽传染病学重点开放实验室提供。1.2.1PBS液的配制（pH:7.2）1.2.21%红细胞悬液的配置（1）采新鲜的鸡血，其中加抗凝剂1/5~1/10左右；（2）分装入10mL的离心管中（未满则用PBS液补足量），配平后用离心机离心10min，14000rpm/min；（3）离心结束后，弃去上清液，加PBS吹打，配平后再次离心；（4）反复离心3次，吹打3次即可；（5）根据红细胞体积，用PBS配成溶液浓度为1%的红细胞悬液。恒温金属水浴锅CHB-100型（杭州大和热磁电子有限公司）、各种量程微量移液器、微量振荡器、96孔V型微量反应板。2实验步骤具体步骤：按照表2，向1~12孔加25μLPBS；吸取25μL病毒，并从第1孔开始稀释一直稀释到第11孔，11孔稀释完后弃去25μL，第12孔不加病毒；12孔全部再加一遍PBS，剂量为25μL，注意悬空滴加；12孔全部再加一遍1%红细胞悬液，剂量为25μL，注意滴加时要悬空滴加；轻微震荡混匀；放37℃恒温箱20min，观察结果实验结果。具体步骤：按照表3，向1~12孔加25μLPBS；吸取25μL阳性血清，并从第1孔开始稀释一直稀释到第10孔，10孔稀释完后弃去25μL，第11、12孔都不加血清；4单位病毒的配制：即将一个血凝单位的病毒增加至4倍浓度，例如一个血凝单位为1:64，4个血凝单位则为64/4=16倍稀释（1倍的病毒+15倍的PBS）；从第1孔开始，病毒悬空滴加至第11孔，每孔加病毒25μL，第12孔用25μLPBS代替；振荡混匀，室温或37℃温箱15~30min；每孔加25μL1%红细胞悬液，振荡混匀，室温10min后开始观察，直到结果出现。3血凝及血凝抑制试验结果由表4得出病毒尿囊液的HA效价为27，将HA试验中得到效价为27的尿囊液，用PBS按1:4稀释成4U病毒，然后进行HI试验。由表5可以得出，该病毒样品既不能被H9亚型禽流感抗血清抑制，也不能被NDV阳性血清抑制，只能被H5亚型禽流感抗血清抑制，其HI效价为28。可初步判断为H5亚型禽流感病毒。4小结与讨论病毒样品HA血凝素效价可达27，HI效价达28，且血凝活性不能被抗新城疫病毒血清和AIV~H9标准阳性血清抑制抑制，排除鸡新城疫和H9，初步判断为H5亚型禽流感。HA和HI试验不仅可以用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定，更可用于禽群免疫状态评价。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量样品，并能在短时间内报告抗体水平等优点，已成为禽流感监测中HA和HI试验的应用谢弘历（江苏省无锡市锡山区安镇畜牧兽医站，江苏无锡214191）摘要：本文通过对一株禽流感病毒样本进行HA和HI试验，详细介绍HA和HI试验的具体步骤，旨在规范实验流程，为日常动物疫情监测提供参考。关键词：禽流感；血凝；血凝抑制DOI:10援3969/J.ISSN援1671-6027援2018援10.014