生物技术在甜瓜育种中的应用

生物技术在甜瓜育种中的应用 摘要 阐述甜瓜离体培养、单倍体育种、细胞和原生质体培养及抗病毒性等方面取得的研究进展，并对甜瓜组织培养、生物技术与育种的前景作了展望。 关键词 甜瓜；生物技术；育种 中图分类号 s652 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2013）06-0075-01 甜瓜（cucumis melo l），又名香瓜，是夏季消暑瓜果，深受人们喜爱。随着生产的发展，传统的育种技术已不能满足人们的需要。近十几年，生物技术迅速发展，可将克隆的病原生物的基因转入高等经济植物，使得高等经济植物获得对病虫害的抗性。因此，在甜瓜育种中运用生物技术逐渐被大家所重视。生物技术在甜瓜育种中有了较大的进展，大大提高了育种效率。 1 组织培养技术 1.1 离体培养的植株再生研究 离体培养是生物技术的基础，利用离体培养进行遗传改良的生物技术都必须经过植株再生的关键步骤。影响甜瓜离体培养的因素有很多，包括外植体、培养基的组成及激素。 1.1.1 外植体。研究者已成功从愈伤组织、子叶、下胚轴、真叶及卷须等外植体获得不定芽，进而获得植株。目前，最适宜的外植体被认为是子叶，甜瓜不定芽发生主要集中在子叶近胚轴端，表 现出明显的极性。如用幼苗子叶作为外植体，应从苗龄3～7 d的无菌苗上获取子叶。adelberg et al[1]的研究表明，未成熟胚子叶是理想的甜瓜不定芽再生外植体。 1.1.2 基本培养基及激素。离体培养研究的重要内容是寻找合适的培养基，其中最主要的是生长调节剂的组成及比例。绝大多数研究者均采用ms基本培养基进行甜瓜不定芽再生，并认为ms培养基为最合适的甜瓜离体培养的基本培养基。有关甜瓜离体培养激素方面研究很多，但只有细胞分裂素类生长调节剂促进细胞的生长和代谢向着不定芽方向分化。目前，普遍认为最佳不定芽再生条件是加入1～2 mg/l ba作为唯一的生长调节剂。甜瓜不定芽和侧芽诱导生根比诱导不定芽发生容易。当将其不定芽或侧芽转入含有生长素类生长调节剂的培养基时均可诱导生根。 1.2 单倍体育种 将具有单个或多个优良性状的材料进行杂交是甜瓜育种的重要手段，而单倍体育种是其中的重要方法之一。 1.2.1 花药培养。花药培养是瓜类单倍体育种技术应用的基础和重要环节。陶正南[2]首次成功通过花药培养获得再生植株，目前甜瓜花药培养存在的主要问题有4个：基因型对花药培养反应不同、花粉愈伤组织诱导率低、绿苗分化频率低、染色体加倍技术不过关。通过花药培养甜瓜单倍体诱导率很低，难以在育种上应用。 1.2.2 子房培养和胚珠离体培养。通过花药和小孢子培养单倍 体诱导率太低，难以在育种中应用，很多研究者开始通过未授粉子房和胚珠培养来诱导甜瓜单倍体植株。子房培养的目的在于通过诱导大孢子分裂形成愈伤组织，再从愈伤组织诱导单倍体芽和小植株。除需选用授粉前直径4～8 mm的子房作为外植体外，其他步骤方法及培养条件与花药培养相同。许多研究表明，从子房培养诱导甜瓜单倍体要比从花药培养诱导单倍体相对容易。 ficcadenti et al[3]首次对甜瓜未授粉胚珠进行诱导，得到了单倍体；lotei et al[4]在γ射线源下以30 000 rad的剂量和85 rad/min的剂量率照射花粉，经射线照射而将生殖细胞杀死的花粉授粉，诱导孤雌生殖形成单倍体植株。韩丽华[5]对甜瓜处于接近成熟胚囊状态开花前14 h的厚皮甜瓜未授粉子房，采用剥胚珠的方法，接种于预培养基上，在35 ℃恒温箱中黑暗热激4 d；而后在25 ℃光下，含有agno3处理的诱导培养基上诱导2周，得到了由胚状体萌发的再生植株。探索出一条通过离体雌核发育诱导单倍体的途径。 1.3 细胞和原生质体培养 原生质体培养是指将细胞用酶解的方法脱去细胞壁而获得原生质体，再在离体培养条件下诱导原生质体再生壁，进而诱导细胞分裂形成愈伤组织，然后从愈伤组织经无性胚发生或芽器官发生而获得小植株的整个离体培养过程。 实现2个种间的无性杂交是许多研究小组进行甜瓜原生质培养 的主要目的。moreno et al[6]从悬浮培养甜瓜细胞的原生质体获得了愈伤组织，后来又从无菌苗叶片原生质体获得愈伤组织和胚状体。接着又从无菌苗真叶和子叶原生质体获得胚状体、芽及小植株。matstumoto et al[7]在甜瓜子叶原生质体培养中得到愈伤组织并诱导出根。bokelman et al[8]从9个甜瓜基因型的无菌苗子叶原生质体获得植株。fellner et al[9]以10日龄甜瓜无菌苗下胚轴、子叶、真叶产生的愈伤组织和细胞团，然后得到原生质体，经过液体培养证明，子叶是较好的外植体，孙勇如等[10]从甜瓜无菌苗子叶的原生质体培养中获得再生植株。周小梅等[11]观察到由原生质体直接产生的胚性细胞团和球形胚、心形胚并由此而分化出根。 原生质体与完整的细胞一样具有全能性，由于没有细胞壁，可以较容易地摄取外源遗传物质如染色体、细胞器、dna、病毒等，为高等植物分子水平与细胞水平的遗传操作提供理想的实验体系。利用原生质体培养技术可直接将外源基因导入甜瓜遗传基因组，在电激或peg处理的条件下外源dna可穿过原生质体膜进入细胞，到达细胞核从而有机会被整合到植物细胞基因组，实现基因转移，形成新遗传重组，为植株品种改良和创建新种质开辟新的技术途径。 2 利用转基因提高抗病毒性 甜瓜生产中严重影响产量和品质的因素是病毒感染，目前研究者已将病毒本身基因导入植物，获得了抗病毒的工程植物，如外壳蛋白（cp）基因。 fang et al[12]首次报道了利用根癌农杆菌改造株系成功地将nptⅱ基因转入甜瓜品种；dong et al报道了他们利用农杆菌将抗性筛选基因（nptl）和标记基因（gus）转入甜瓜。yoshioka et al[13]报道了用根癌农杆菌将有经济价值的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因（cmv-cp）成功地转入甜瓜，fang et al[12]将他们克隆的西葫芦黄化花叶病毒外壳蛋白基因（zymv-cp）用农杆菌介导转入甜瓜后，其转基因植株表现出对zymv的抗性。george et al[14]将wmv和zymv的cp基因整合到一个质粒载体导入甜瓜，转化甜瓜植株对相应的病毒都有抗性。王慧中等[15]将西瓜花叶病毒1号外壳蛋白基因wmv-1cp基因和2号外壳蛋白基因wmv-2cp分别感染甜瓜子叶外植体，获得了可育的转基因甜瓜植株。 目前，普遍用于植物遗传转化的2种体系——农杆菌介导的基因生物插入法和“基因枪”基因机械导入法都可用于甜瓜的遗传转化。多数已发表的甜瓜遗传转化研究均采用以根癌农杆菌为介导的遗传转化法。 3 展望 离体培养和生物技术已广泛应用于甜瓜的快速繁殖、品种改良以及遗传转化研究。离体培养获得再生植株，为通过农杆菌介导和基因枪法的转基因遗传改良打下了良好的基础。随着甜瓜离体培养研究的深入，生物技术必将在遗传育种中的应用得到更快的发展，更上一个新的台阶。 4 参考文献 [1] adelberg j w，rhodes b b，skorupska h t.generating tetraploid melons in tissue culture[j].acta hort，1993，336（9）：373-380. [2] 陶正南.甜瓜花药培养诱导成植株[j].植物生理学通讯，1987（5）：43. [3] ficcadenti n，sestili s，annibali s，et al.in vitro gynogenesis to induce haploid plants in melon（cucumis melo l）[j].j g enet breed，1999，53（3）：255-257. [4] lotfi m.production of haploid and doubled haploid plants of melon（cucumis melo l.）for use in breeding for multiple virus resistance[j].plant cell rep，2003，21（11）：1121-1128. [5] 韩丽华.厚皮甜瓜未受精胚珠离体培养技术[d].保定：河北农业大学，2004. [6] moreno v.a method for obtaining callus cultures from mesophyll protoplasts of（cucumls melo l.）[j].plant sci lett，1984，34（1-2）：195-201. [7] matstumoto s，takebe i.callus formation and root differentiation by cotyledon protoplasts of melon（cucumis melo l.）[j].plant tissue letters，1987：18-21. [8] bokelmann g s，jarl c i，kool a j.plant regeneration of protop-lasts from different cultivars of melon（cucumis melo）[j].genet coop，1991，14（78-80）：78-80. [9] fellner m，lebeda a.callus induction and protoplast isolation from tissues of cucumis sativus l. and c. melo l. seedlings[j].biologia plantarum，1998，41（1）：11-24. [10] 孙勇如，李仁敬.新疆甜瓜子叶原生质体的培养和植株再生[j].植物学报，1989，31（12）：918-922. [11] 周小梅，刘少翔，赵军良.甜瓜原生质体培养及胚状体发生的初步探讨[j].山西大学学报：自然科学版，1992，15（1）：61-65. [12] fang g w，grumet g.agrobacterium tumefaciens mediated transf-ormation and regeneration of muskmelon plants[j].plant cell rep，1990，9（3）：160-164. [13] yoshioka k k.successful tranfer of the cumcumer mosatic virus coat gene to cucumis melo l[j].jpnj breeding，1992，42（2）：278-285. [14] clough g h，hamm p b.coat protein transgenic resistance to water-melon mosaic and zucchini yellows mosaic virus in squash and cantaloupe[j].plant disease，1995（79）：1107-1109. [15] 王慧中，李亚南，赵培洁.根癌农杆菌介导的甜瓜基因转