牛支原体PepO原核表达及功能验证
牛γ-干扰素在大肠杆菌中的表达及抗原性鉴定
【 摘要 】 目的
在大肠杆 菌 中高效 表达 牛 一 干扰素 （ ｏｉｅｉｔ ｆ ｏ 一 ＢｖＦ ． ） 并 对其 生物活 性进行 初 ｂｖ ｎ ｒ ｒｎ ， ｏＩＮ ， ｎ ｅｅ
步鉴定 。方法 依据 Ｇ ｎ ａｋ上 基因序列人工合成 Ｂ ｖＦ 一 因 ，Ｃ ｅＢｎ ｏＩＮ 基 Ｐ Ｒ方法 扩增该基 因， 将其插入 Ｐ Ｔ２ ａ载体 Ｅ 一８
ＭＡ ｎ ｙ ｎ ，ＣＡＯ ｅ ， ＴＩ Ｙｏ ｇ．ｉ ｇ Ｚｈ ｎ ＡＮ ． ｏ ｇ Ｋｅ ｇ ｎ ，ＣＨＥＮ ．ｈ ｏ ＇ Ｘｉｚ ａ
（ ．Ｂ ｉ ｎ ｈ ａ ａ ｏａｏｉｓＣｏ ｔ １ ｅｊ ｇＡｎ ｅ ｌＬ ｂ ｒｔｒ ．Ｌｄ，Ｂｅｊ ｇ１ ０ ８ ｉ ｅ ｉｎ ０ ０ ５，Ｃ ｉａ ｉ ｈｎ ； ２ ｈｎ ｉ ｌ ｓａｅＣ ｎｒｌ ｎｅ ，Ｂ ｉｎ ０ ０ ４ ．Ｃ ｉａＡｎｍａ ｅ ｓ ｏ ｔ ｔｒ ｅｊ ｇ １０ ９ ） Ｄｉ ｏ Ｃｅ ｉ
ｄ ｉ ０ ３ ６ ／ ． ｓｎ １ ７ ． ８ ６ ２ １ ． ２ ０ ９ ｏ ：１ ． ９ ９ ｊ ｉｓ ． ６ １ ７ ５ ． ０ ２ ０ ． ０
Ｅ ｐ ｅｓ ｎｏ ｏ ｉｅＩ ｔｒｅｏ ・ （ ｏ Ｉ Ｎ－ ｎＥ．ｃ ｌ ｘ ｒｓｉ ｆＢ ｖｎ ｎｅｆｒｎ Ｂ ｖＦ ）ｉ ｏ ｏｉ
刘 巧 荣 孙 明 乔 明 ， 杨 璐 申屠 芬 琴 马 永 缨 ， 曹 振 明 ， 田克 恭 பைடு நூலகம்陈 ， ， ， ， ，
西 钊 ，
（ ．北 京 世 纪 元 亨 动 物 防 疫 技 术 有 限 公 司 ， 京 １ 北 １０ ８ ；．中 国 动 物疫 病 预 防控 制 中 心 ， 京 ０ ０５ ２ 北 １０ ９ ） ０ ０ ４
ａ ｄｅ ｔｆｃ ｔｏ ｆｉｓ Ａｎ ｉ ｅ ｉ ｉｙ ｎｄ Ｉ ｎ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｔ ｔｇ ｎ ｃｔ ｉ
牛支原体肺炎流行RT-PCR方法的初步诊断
支原体和无乳 支原体核 酸序 列都具有很 高的 同源性 。对核 酸序 列进行遗传进化树分析表 明， 相对于无乳 支原体 而言， 所测核酸序
２ ３ 序 列 比对 结果 ．
天气 、 通风 不 良、 度拥 挤 、 输 等将加 剧病 情 ［ 过 运 习 。 患 有 牛支 原 体 的病 牛 可 通 过鼻 腔 分 泌 物排 出牛
支原体，健康牛可通过近距离接触病牛而感染发病。
牛支 原体 在环 境 中存活 力差 ， 但在 无 阳光情 况 下可 存 活 数天 ，如 ４℃下可 在海 绵 中或 牛奶 中存 活 ２个 月 ， 或 水 中存 活 ２周 以上 ；０℃存 活 ｌ２周 ， 或 ３ ２ ￣ ７℃存
１ ３ 方 法 ．
ｐ ， Ｖ ０ ５ｐ ， Ｌ ＭＬ ． Ｌ 上游 引物 （ Ｍ） Ｌ 下游 引物 ２ ２ｐ １ ， ０
（０ ｐ ２ Ｍ）１ｐ Ｒｎ ｓ ｒｅＨＥ １ ．５ｐ Ｌ， ａ ｅｆｅ Ｏ ４ １ Ｌ。
反应程序 ： 首先 ４ ２℃ ４ ｉ； ０ｍｎ 接着 ９ ５℃变性 ３ ｍｉ；然后 ９ ｎ ４℃ ３ ，５℃ ４ ，２℃ ４ ３ 个循 ０ ５ ｓ ０ｓ７ ０ ，５ ｓ
１ ３ ２ Ｉ Ａ 提 取 ．．
主要特征的呼吸道传染病， 病牛出现咳嗽， 食欲不振， 消瘦 等 症状 ，有 的病牛 出现 继发 性 关节 炎或 腹 泻［］ １。 － ２
本 实 验 室对 山东 某 一 牛交 易 市 场 部分 牛 群 进 行 鼻 腔 棉拭 子 采样 ，采 用 Ｐ Ｒ方 法 对 引起 牛发 生 类似 症 状 Ｃ 的主要 支 原体 进行 了检 测 。
牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
中国畜牧兽医 2022,49(8):3131-3139C h i n aA n i m a lH u s b a nd r y &Ve t e r i n a r y Me d i c i n e 牛病毒性腹泻病毒E 0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备王 炜,韩慧慧,丁乃峥,何成强(山东师范大学生命科学学院,山东省动物抗性重点实验室,济南250014)摘 要:ʌ目的ɔ应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(B V D V )E 0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E 0蛋白多克隆抗体用于B V D V 的检测技术研究㊂ʌ方法ɔ采用P C R 扩增B V D V 的E 0基因,将其连接至p E T -28a (+)构建重组表达载体p E T 28a -E 0㊂将重组质粒转化大肠杆菌B L 21感受态细胞,经I P T G 诱导㊁亲和层析纯化后,通过S D S -P A G E 和W e s t e r nb l o t t i n g 鉴定E 0蛋白的表达情况㊂将纯化的E 0蛋白免疫小鼠制备B V D VE 0多克隆抗体,并通过W e s t e r nb l o t t i n g ㊁细胞免疫荧光试验㊁E L I S A 等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在B V D V 检测中的应用㊂ʌ结果ɔ成功构建原核表达载体p E T 28a -E 0,表达并纯化E 0蛋白,制备的B V D V E 0多克隆抗体可特异性识别纯化的E 0蛋白及p E T 28a -E 0在B L 21中表达的总蛋白㊂进一步W e s t e r nb l o t t i n g ㊁细胞免疫荧光试验㊁双抗夹心法E L I S A 证明制备的E 0多克隆抗体可用于B V D V 的检测㊂间接E L I S A 结果表明,E 0多克隆抗体效价高于1ʒ64000㊂ʌ结论ɔ制备的B V D V E 0多克隆抗体效价高㊁抗原结合特异性强,为B V D V E 0蛋白的生物学功能研究及B V D V 的检测提供了材料支持㊂关键词:牛病毒性腹泻病毒(B V D V );E 0基因;原核表达;多克隆抗体中图分类号:S 852.65+3文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.08.029 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2022-01-29基金项目:山东省重点研发项目(2017G N C 10125㊁2019G S F 107020)联系方式:王炜,E -m a i l :471654737@q q .c o m ㊂通信作者何成强,E -m a i l :h c q i a n g@s d n u .e d u .c n P r o k a r y o t i cE x pr e s s i o no fB o v i n eV i r a l D i a r r h e aV i r u sE 0P r o t e i n a n dP r e p a r a t i o no f P o l y c l o n a l A n t i b o d yWA N G W e i ,H A N H u i h u i ,D I N G N a i z h e n g ,H EC h e n g q i a n g(S h a n d o n g K e y L a b o r a t o r y o f A n i m a lR e s i s t a n c e ,C o l l e g e o f L i feS c i e n c e s ,S h a n d o n g N o r m a lU n i v e r s i t y ,J i n a n 250014,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h eE 0p r o t e i no fB o v i n ev i r a l d i a r r h e av i r u s (B V D V )w a se x p r e s s e db yE .c o l i ,a f t e r p u r i f i c a t i o n ,t h eE 0p r o t e i n p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s p r e p a r e db y i m m u n i z i n g mi c e ,w h i c hw a s t h e nu s e d f o rB V D Vd e t e c t i o n .ʌM e t h o d ɔT h eB V D V E 0g e n ew a s a m p l i f i e db y PC R a n dl i g a t e di n t o p E T -28a (+)t o c o n s t r u c tr e c o m b i n a n te x pr e s s i o n v e c t o r p E T 28a -E 0.T h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d w a st r a n s f o r m e di n t o E .c o l i B L 21c o m pe t e n tc e l l s .Af t e rI P T Gi n d u c t i o n a n da f f i n i t y c h r o m a t og r a ph yp u ri f i c a t i o n ,t h ee x p r e s s i o no fE 0p r o t e i n w a si d e n t i f i e db y S D S -P A G Ea n d W e s t e r nb l o t t i n g .T h e p u r i f i e dE 0p r o t e i nw a s i m m u n i z e d i n t om i c e t o p r e pa r eB V D V E 0p o l y c l o n a l a n t ib o d i e s ,a n d t h e s p ec i f i c i t y a nd t i te r of t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d i e sw e r e d e t e c t e d b y W e s t e r nb l o t t i ng ,c e l l i m m u n o f l u o r e s c e n c e ,E L I S Aa n do th e r t e s t s ,a sw e l l a s t h ea p pl i c a t i o ni n B V D Vv i r u sd e t e c t i o n .ʌR e s u l t ɔT h e p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r p E T 28a -E 0w a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t ed ,a n dt h eE 0p r o te i n w a se x p r e s s e da n d p u r if i e d .T h e p r e p a r e dB V D V E 0p o l y c l o n a l a n t i b o d y c o u l ds p e c i f i c a l l y r e c og n i z eth e p u ri f i e dE 0p r o t e i na n dt h et o t a l p r o t e i ne x p r e s s e db y中国畜牧兽医49卷p E T28a-E0i nB L21.F u r t h e r,W e s t e r nb l o t t i n g,c e l l u l a r i m m u n o f l u o r e s c e n c e a n dd o u b l e a n t i b o d y s a n d w i c hE L I S A p r o v e d t h a t t h e p r e p a r e dE0p o l y c l o n a l a n t i b o d y c o u l db e u s e d f o r t h e d e t e c t i o n o fB V D V.T h er e s u l t so f i n d i r e c tE L I S A s h o w e dt h a tt h et i t e ro fE0p o l y c l o n a la n t i b o d y w a s h i g h e r t h a n1ʒ64000.ʌC o n c l u s i o nɔT h e p r e p a r e dB V D VE0p o l y c l o n a l a n t i b o d y h a d a h i g h t i t e r a n d s t r o n g a n t i g e n-b i n d i n g s p e c i f i c i t y,w h i c h p r o v i d e d m a t e r i a l s u p p o r t f o r t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o n a l s t u d y o f B V D V E0p r o t e i na n d t h e d e t e c t i o no f B V D V.K e y w o r d s:B o v i n ev i r a ld i a r r h e av i r u s(B V D V);E0g e n e;p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n;p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s牛病毒性腹泻病毒(B o v i n e v i r a ld i a r r h e a v i r u s,B V D V)作为牛病毒性腹泻(b o v i n e v i r a l d i a r r h e a,B V D)的病原体,可引起牛腹泻㊁胃肠道炎症㊁呼吸系统疾病㊁生殖障碍等一系列临床症状[1],对畜牧养殖业造成严重的经济损失[2]㊂在中国, B V D作为一种瘟疫性传染病,被列为三类动物疫病中的牛病之一[3]㊂B V D V可以感染野生及家养动物[4],尤其是被感染的妊娠母牛产下的持续性感染(p e r s i s t e n t i n f e c t i o n,P I)小牛,能不断从鼻眼部分泌物及排泄物中排出具有传染性的B V D V,这种持续性病毒来源,成为驱动B V D V流行的关键因素,使得B V D V的清除具有较高难度[5-6]㊂B V D V属于黄病毒科中的瘟病毒属[7],长度约12.3k b,是正义R N A病毒,主要分B V D V-1和B V D V-2[8-9]㊂B V D V具有较高的流行率,牛群中抗体阳性率较高[10-11]㊂B V D V感染后,糖蛋白E2作为B V D V感染后免疫反应的主要目标之一,被广泛应用于B V D V疫苗的研制[12-13]㊂但E2蛋白的突变率高,往往导致免疫的失败[14-15]㊂B V D V的包膜蛋白E0(E r n s)由约228个氨基酸组成,大小约26k u,具有R N A酶活性,可降解B V D V R N A[16],是瘟病毒编码蛋白中保守性相对较高㊁参与病毒摄取细胞及感染性病毒粒子有效组装的重要结构蛋白[17],较E2抗原多样性少,也是宿主抗体应答的主要靶标之一[18-19]㊂E0作为B V D V免疫原性蛋白具有很高的抗原保守性[20],对于阻断宿主对病毒感染的反应较为重要[21],通过阻断干扰素(I F N)的合成来颉颃宿主的先天免疫防御,从而建立长期感染[22]㊂针对B V D V E0的抗体能有效结合细胞及其培养物中的B V D V㊂目前,E0蛋白因其独特的免疫学特点逐渐成为抗原蛋白免疫法制备相应抗体的候选抗原㊂本研究通过P C R扩增E0基因,构建p E T28a-E0原核表达载体,通过大肠杆菌表达系统诱导表达E0蛋白,采用亲和层析纯化E0蛋白,将其免疫小鼠收集血清制备B V D V E0多克隆抗体㊂然后通过W e s t e r nb l o t t i n g㊁细胞免疫荧光试验㊁E L I S A等试验检测多克隆抗体的特异性,为B V D V E0蛋白的结构和功能研究及B V D V的检测提供了理论依据㊂1材料与方法1.1材料B V D V S i n g e r_A r g株(G e n B a n k登录号: D Q088995.2)㊁大肠杆菌D H5α感受态细胞㊁大肠杆菌B L21(D E3)感受态细胞㊁乳仓鼠肾细胞系B H K-21㊁牛肾细胞系M D B K㊁B V D V感染性R N A表达载体p M C18-B V D V和p E T-28a(+)均由山东师范大学生命科学学院动物生殖发育与疾病实验室保存;6~8周龄IC R小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司㊂1.2主要试剂D ME M㊁P B S㊁F B S(V i v a C e l l)均购自上海逍鹏生物科技有限公司;限制性内切酶㊁T4D N A L i g a s e (2011A)均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;A p e x H F H S D N A P o l y m e r a s e F S M a s t e r M i x (A D12202)购自湖南艾科瑞生物工程有限公司; P A G E凝胶快速制备试剂盒12.5%(P G113)购自上海雅酶生物医药科技有限公司;H i s标签鼠单克隆抗体(A B0002)㊁b e t a-A c t i nA n t i b o d y(A B0035)㊁辣根过氧化物酶(H R P)标记的羊抗鼠I g G (A B0102)㊁H R P标记的羊抗兔I g G(A B0101)和A l e x a荧光488标记的羊抗鼠I g G(A B0142)均购自泊湾生物科技有限公司;弗氏佐剂(F5881/F5506)购自上海懋康生物科技有限公司;N iN T A b e a d s (S A004100)购自常州天地人和生物科技有限公司;全自动倒置荧光显微成像系统(型号D M i8)购自徕卡仪器有限公司;酶标仪(型号S p e c t r a M a x M5)购自M o l e c u l a rD e v i c e s美谷分子仪器(上海)有限公司㊂1.3方法1.3.1引物设计与合成根据B V D V S i n g e r_A r g株(G e nB a n k登录号:D Q088995.2)的E0基因序列,利用D N AMA N软件设计E0基因的上㊁下游23138期王炜等:牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备引物:B V D V-E0-F:5'-C G G A A T T C A T A A C A C A G T G G A A C C T A C A A G A C-3'(下划线处为E c o RⅠ识别位点);B V D V-E0-R:5'-A A T C T C G A G C T A G G G G G A A G C C G C G T A T-3'(下划线处为X h oⅠ识别位点),预期扩增片段大小为684b p㊂引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成㊂1.3.2原核表达载体p E T28a-E0的构建以实验室保存的p M C18-B V D V质粒为模板,P C R扩增E0基因片段㊂P C R反应体系25μL:A p e x H F H S D N AP o l y m e r a s eF S M a s t e r M i x12.5μL,上㊁下游引物各1μL,模板1μL,灭菌d d H2O9.5μL㊂P C R 反应程序:98ħ预变性5m i n;98ħ变性30s,65ħ退火30s,72ħ延伸45s,共30个循环;72ħ延伸8m i n;4ħ保存㊂P C R产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,回收目的产物并纯化,将E0片段和p E T-28a(+)载体经E c o RⅠ和X h oⅠ37ħ水浴酶切2.5h,然后使用T4D N A L i g a s e16ħ连接过夜,将连接产物转化大肠杆菌D H5α感受态细胞,经菌落P C R筛选阳性克隆,提取重组质粒经E c o RⅠ和X h oⅠ双酶切鉴定后,由青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序㊂1.3.3原核表达载体p E T28a-E0的诱导表达将测序成功的p E T28a-E0和p E T-28a(+)转化大肠杆菌B L21(D E3)感受态细胞,培养菌液D600n m为0.6~0.8时,添加1m m o l/L的I P T G在37ħ条件下诱导4h,收集菌体进行12.5%的S D S-P A G E,经考马斯亮蓝染色,脱色液脱色后观察E0蛋白的表达情况㊂因重组质粒带有H i s标签,以H i s标签鼠单克隆抗体为一抗,W e s t e r nb l o t t i n g检测诱导蛋白㊂1.3.4可溶性分析取诱导表达E0蛋白的p E T28a-E0菌体,8000r/m i n离心10m i n收集菌体沉淀,加入P B S重悬菌体沉淀,冰水浴条件下超声破碎菌体:30m i n,功率400W,开4s,关6s, 8000r/m i n离心2m i n取上清和沉淀,通过12.5%的S D S-P A G E分析E0蛋白的可溶性㊂1.3.5 E0蛋白的纯化及鉴定依据步骤1.3.3和1.3.4大量诱导p E T28a-E0重组菌体,超声破碎后离心收集沉淀,采用N iN T A b e a d s亲和层析纯化蛋白,经上柱结合㊁洗涤缓冲液洗涤杂蛋白㊁洗脱缓冲液洗脱目的蛋白等步骤纯化E0蛋白,将纯化后的E0蛋白处理后通过12.5%的S D S-P A G E分析蛋白纯化情况㊂以H i s标签鼠单克隆抗体(1ʒ2000)为一抗,1ʒ5000稀释的H R P标记的羊抗鼠I g G为二抗,W e s t e r nb l o t t i n g检测蛋白纯化结果㊂1.3.6免疫小鼠将纯化的E0蛋白使用B C A 蛋白浓度测定试剂盒测定浓度后与弗氏佐剂等体积混合超声乳化成油乳状,背部皮下多点注射免疫4只6~8周龄I C R小鼠(50~100μg/只)㊂免疫前鼠尾采血收集血清备用,每次免疫间隔2周进行㊂第1次使用弗氏完全佐剂,第2㊁3次免疫使用弗氏不完全佐剂,3次免疫后均采血收集血清备用㊂1.3.7 B V D V E0多克隆抗体特异性检测将纯化的E0蛋白与蛋白上样缓冲液按4ʒ1的比例混合后沸水煮8m i n,将其作为抗原通过W e s t e r n b l o t t i n g检测B V D VE0多克隆抗体与E0蛋白的特异性结合㊂蛋白样先经12.5%的S D S-P A G E分离,然后转移至P V D F膜,将P V D F膜用封闭液封闭2h,将4只小鼠的B V D V-E0多克隆抗体和免疫前血清以1ʒ1000比例稀释分别作为一抗,4ħ孵育过夜,T B S T清洗后以1ʒ5000稀释的H R P标记的羊抗鼠I g G为二抗,室温孵育2h,T B S T清洗后显色并拍照㊂将p E T28a-E0质粒转化大肠杆菌B L21感受态细胞,收集菌体细胞裂解提取蛋白,如上述处理后作为抗原,将B V D V-E0多克隆抗体和免疫前血清1ʒ1000稀释作为一抗,通过W e s t e r nb l o t t i n g检测B V D V E0多克隆抗体的特异性㊂1.3.8 B V D V检测将B H K-21细胞铺于6孔细胞培养板,待细胞长至75%时,将B V D V感染性R N A表达载体p M C18-B V D V转染至B H K-21细胞,48h后收集包装的病毒上清并感染M D B K细胞,培养48h后,收集细胞裂解提取蛋白,以制备的B V D V E0多克隆抗体(1ʒ1000)为一抗,1ʒ5000稀释的H R P标记的羊抗鼠为二抗,W e s t e r n b l o t t i n g检测B V D V感染性R N A表达载体p M C18-B V D V在B H K-21细胞内的表达和包装病毒在M D B K细胞内的复制,其中试验组和B H K-21/M D B K空白细胞阴性对照组分别做2个重复㊂通过细胞免疫荧光检测多克隆抗体的应用效果,将M D B K细胞爬片并培养至贴壁状态㊁将B V D V病毒液接种细胞,感染培养24h,P B S清洗3次后用4%的多聚甲醛固定8m i n,P B S清洗3次,透膜液37ħ透膜30m i n,P B S清洗3次后用5%的B S A室温封闭1h,然后将B V D V E0多克隆抗体稀释400倍作为一抗,37ħ孵育1h,P B S再次清洗后以1ʒ200稀释的A l e x a荧光488标记的羊抗鼠I g G为二抗,37ħ孵育1h,P B S清洗3次,D A P I染核液染核5m i n,最后P B S清洗3次后封片,然后镜检并拍照㊂通过双抗夹心法E L I S A检测B V D V,将免疫前3313中国畜牧兽医49卷小鼠血清和B V D V E0多克隆抗体倍比稀释后4ħ过夜包被酶标板,P B S T清洗3次后用10%的马血清37ħ封闭2h,P B S T清洗3次,然后滴加病毒感染复数(MO I)为0.1~0.5的B V D V病毒液,37ħ孵育2h,再次P B S T清洗3次后加入H R P标记的羊抗鼠I g G(1ʒ5000),37ħ孵育2h,P B S T清洗3次后每孔加入100μL的T M B显色液,室温避光显色10m i n,最后每孔加入100μL终止液终止反应,用酶标仪测定D450n m值并分析结果,以阳性血清D450n m值/阴性血清D450n m值(P/N值)>2的抗体稀释度定义为抗血清效价㊂1.3.9 B V D V E0多克隆抗体效价测定通过E L I S A法检测4只小鼠的抗血清效价,将纯化的E0蛋白稀释至4μg/m L后包被酶标板,用10%的马血清37ħ封闭2h,T B S T清洗3次后以4只小鼠免疫前血清(阴性对照)和B V D V E0多克隆抗体分别倍比稀释为一抗,37ħ孵育2h,P B S T清洗3次后,以1ʒ5000稀释的H R P标记的羊抗鼠I g G为二抗,37ħ孵育2h,P B S T清洗3次后每孔加入100μL的T M B显色液,室温避光显色10m i n,终止反应后用酶标仪测定D450n m值并进行结果分析㊂2结果2.1p E T28a-E0载体的构建使用E c o RⅠ和X h oⅠ对p E T28a-E0重组质粒进行双酶切鉴定(图1),在5369和684b p处出现与预期相符的载体条带和目的条带,经测序比对分析,原核表达载体p E T28a-E0构建成功㊂M,D L10000D N A M a r k e r;1,空载质粒双酶切;2,p E T28a-E0重组质粒;3,p E T28a-E0重组质粒双酶切M,D L10000D N A M a r k e r;1,D o u b l e d i g e s t i o n o fe m p t y v e c t o r p l a s m i d;2,R e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T28a-E0; 3,D o u b l e d i g e s t i o no f r e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T28a-E0图1重组质粒的双酶切鉴定F i g.1D o u b l e d i g e s t i o n i d e n t i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d 2.2E0蛋白的表达㊁可溶性分析㊁纯化及鉴定通过12.5%的S D S-P A G E观察发现,经1m m o l/L的I P T G在37ħ条件下诱导的p E T28a-E0重组质粒在26k u处出现B V D V E0目的条带,而p E T-28a(+)空载质粒和未诱导的重组质粒处未出现(图2A)㊂可溶性分析发现,E0蛋白主要存在于沉淀中,即其在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在(图2A)㊂取诱导表达E0蛋白的p E T28a-E0菌体,超声破碎离心后通过N iN T Ab r e a d s亲和层析纯化目的蛋白,经12.5%的S D S-P A G E分析发现纯化出杂蛋白较少㊁浓度较高的E0蛋白(图2A)㊂以H i s标签鼠单克隆抗体为一抗,H R P标记的羊抗鼠I g G为二抗,经W e s t e r nb l o t t i n g检测,诱导蛋白(图2B)和纯化蛋白(图2C)在26k u处均出现目的条带,表明B V D V E0蛋白已成功诱导纯化,且纯化蛋白特异性良好,可用于后期免疫试验㊂2.3B V D VE0多克隆抗体特异性检测如图3所示,E0纯化蛋白免疫前采集的4只小鼠血清(免疫前血清)均未能检测出目的条带(图3A),而E0纯化蛋白免疫后采集的小鼠血清(B V D V E0多克隆抗体)则能特异性检测出纯化后的E0蛋白(图3B);免疫前血清在p E T-28a(+)和p E T28a-E0均未检测出目的条带(图3C)㊂B V D V E0多克隆抗体在p E T28a-E0检测出目的条带(图3D),而在p E T-28a(+)未检测出㊂证明B V D V E0多克隆抗体具有良好的免疫特异性,可特异性识别B V D V E0蛋白㊂2.4B V D V检测W e s t e r nb l o t t i n g检测B V D V感染性R N A表达载体p M C18-B V D V在B H K-21细胞内的表达和包装病毒在M D B K细胞内的复制,结果显示均在26k u处出现目的条带(图4A和4B),即为B V D V E0蛋白大小,证明该多克隆抗体可特异性识别细胞表达的E0蛋白㊂通过细胞免疫荧光检测B V D V,结果如图4C所示,E0多克隆抗体组出现荧光,而免疫前血清对照组未出现荧光,表明本试验制备的多克隆抗体可用于B V D V的免疫荧光检测㊂通过双抗夹心法E L I S A检测B V D V,结果如图4D所示,在1ʒ500至1ʒ32000抗血清稀释比范围内, B V D V检测均为阳性,且随着稀释比的升高,P/N 值呈上升趋势㊂以上结果表明,本试验制备的B V D V E0多克隆抗体可特异性识别B V D V E0蛋白,用于B V D V的检测㊂43138期王 炜等:牛病毒性腹泻病毒E 0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备①A ,S D S -P A G E 检测诱导和纯化蛋白;B ㊁C ,W e s t e r nb l o t t i n g 检测诱导和纯化蛋白㊂②M ,蛋白质分子质量标准;1,pE T -28a (+)未经I P T G 诱导;2,p E T -28a (+)经I P T G 诱导4h ;3,p E T 28a -E 0未经I P T G 诱导;4,p E T 28a -E 0经I P T G 诱导4h ;5,上清;6,沉淀;7,流出液;8,洗脱液;9,E 0纯化蛋白;10,E 0诱导蛋白;11,E 0纯化蛋白①A ,D e t e c t i o no f i n d u c e da n d p u r i f i e d p r o t e i n sb y S D S -P A G E ;Ba n dC ,D e t e c t i o no f i n d u c e da n d p u r i f i e d p r o t e i n sb y We s t e r n b l o t t i n g .②M ,P r o t e i n M a r k e r ;1,p E T -28a (+)w a sn o t i n d u c e db y I P T G ;2,p E T -28a (+)w a s i n d u c e db y IP T Gf o r4h ;3,p E T 28a -E 0w a s n o ti n d u c e d b y I P T G ;4,p E T 28a -E 0w a si n d u c e d b y I P T G f o r4h ;5,S u p e r n a t a n t ;6,P r e c i p i t a t i o n ;7,E f f l u e n t ;8,E l u e n t ;9,E 0p u r i f i e d p r o t e i n ;10,E 0i n d u c e d p r o t e i n ;11,E 0p u r i f i e d p r o t e i n 图2 E 0蛋白的表达㊁可溶性分析㊁纯化及鉴定F i g .2 E x p r e s s i o n ,s o l u b i l i t y a n a l y s i s ,pu r i f i c a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no fE 0p r o t e in ①A ㊁B ,分别为免疫前血清和B V D V E 0多克隆抗体作为一抗W e s t e r nb l o t t i n g 检测E0纯化蛋白;C ㊁D ,分别为免疫前血清和B V D VE 0多克隆抗体作为一抗W e s t e r nb l o t t i n g 检测大肠杆菌B L 21表达的总蛋白㊂②M ,蛋白质分子质量标准;1~4,耳标号A 851㊁A 852㊁A 853㊁A 795小鼠免疫前血清;5~8,耳标号A 851㊁A 852㊁A 853㊁A 795小鼠免疫后血清㊂9㊁11,p E T -28a (+)诱导蛋白;10㊁12,pE T 28a -E 0诱导蛋白①Aa n dB ,P r e -i m m u n e s e r u ma n dB V D V E 0p o l y c l o n a l a n t i b o d y w e r e u s e d a s p r i m a r y an t i b o d i e s t od e t e c tE 0p u r i f i e d p r o t e i n b y W e s t e r n b l o t t i n g ,r e s p e c t i v e l y ;C a n d D ,P r e -i m m u n es e r u m a n d B V D V E 0p o l y c l o n a la n t i b o d y w e r eu s e da s p r i m a r ya n t ib o d i e s t od e t ec t t h e t o t a l p r o t e i n e x p r e s s ed b y E .c o l i B L 21b y We s t e r n b l o t t i n g ,r e s p e c t i v e l y.②M ,P r o t e i nM a r k e r ;1-4,P r e -i m m u n e s e r u mo fm i c ew i t he a rn u m b e rA 851,A 852,A 853,A 795;5-8,P o s t -i m m u n es e r u m o fm i c ew i t he a rn u m b e rA 851,A 852,A 853,A 795;9a n d11,p E T -28a (+)i n d u c e d p r o t e i n ;10a n d12,p E T 28a -E 0i n d u c e d p r o t e i n 图3 B V D VE 0多克隆抗体特异性检测F i g .3 S p e c i f i c d e t e c t i o no fB V D VE 0p o l y c l o n a l a n t i b o d y5313中 国 畜 牧 兽 医49卷①A ㊁B ,W e s t e r nb l o t t i n g 检测BV D V E 0分别在B H K -21和M D B K 细胞中的表达;C ,细胞免疫荧光检测被B V D V 感染的M D B K 细胞(100ˑ);D ,双抗夹心法E L I S A 检测B V D V ㊂②M ,蛋白质分子质量标准;1~3,转染p M C 18-B V D V 质粒的B H K -21细胞;4,空白B H K -21细胞,5~7,包装病毒感染的M D B K 细胞;8,空白M D B K 细胞①Aa n dB ,T h ee x p r e s s i o no fB V D V E 0i nB H K -21a n d M D B K c e l l sb y W e s t e r nb l o t t i n g;C ,C e l l u l a r i m m u n o f l u o r e s c e n c e d e t e c t i o no f M D B Kc e l l s i n f e c t e d w i t hB V D V (100ˑ);D ,D e t e c t i o no fB V D V b y d o u b l ea n t i b o d y s a n d w i c h E L I S A .②M ,P r o t e i n M a r k e r ;1-3,B H K -21c e l l s t r a n s f e c t e dw i t h p M C 18-B V D V p l a s m i d ;4,B l a n kB H K -21c e l l s ;5-7,M D B Kc e l l s i n f e c t e d w i t h p a c k a g i n g v i r u s ;8,B l a n k M D B Kc e l l s 图4 B V D VE 0多克隆抗体检测B V D VF i g .4 D e t e c t i o no fB V D Vb y B V D VE 0p o l y c l o n a l a n t i b o d y2.5 B V D VE 0多克隆抗体效价测定利用E L I S A 法检测制备的B V D V E 0多克隆抗体的效价,如图5所示,A 851小鼠免疫后血清(B V D V E 0多克隆抗体)以1ʒ64000比例稀释时P /N 值仍在2倍以上,并且检测发现4只免疫小鼠抗血清效价均高于1ʒ32000㊂结果证明,本试验制备的B V D V E 0多克隆抗体效价较高㊂63138期王 炜等:牛病毒性腹泻病毒E 0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备图5 B V D VE 0多克隆抗体效价测定F i g .5 T i t e r d e t e r m i n a t i o no fB V D VE 0p o l y c l o n a l a n t i b o d y3 讨 论B V D V 在世界范围内被称为感染反刍动物的非典型瘟病[23],可引起牛慢性持续性感染和急性致死性疾病,死亡率较高[24],对畜牧养殖业造成巨大的经济损失㊂因此快速准确的诊断方法是防控B V D V 的关键㊂B V D V 抗原E L I S A 和实时荧光定量P C R 是检测感染动物的两种最可靠㊁最灵敏的方法,实时荧光定量P C R 在转录水平检测目的基因,涉及R N A 合成过程,操作较复杂;E L I S A 作为蛋白的定量检测,灵敏度高,操作方式灵活,是检测B V D V 最具成本效益的方法[25]㊂在准确检测B V D V 的基础上,研发易于制备且高效价的检测抗体尤为重要㊂B V D V 疫苗和检测抗体研究的主要靶点为E 0和E 2蛋白,B V D V 的包膜蛋白E 0作为宿主抗体应答的主要靶标之一,已逐渐成为抗原蛋白免疫法制备E L I S A 检测等抗体的候选抗原蛋白[18-19]㊂B V D V E 0蛋白是病毒颗粒的重要组成部分,表现出R N a s e 活性,是B V D V 毒力因子形成的关键[26]㊂E 0蛋白通过长的两性螺旋附着在膜上,属于膜锚定的,但没有跨膜肽[17],因此在B V D V 各结构蛋白中,E 0蛋白具有较高的保守性[20]㊂E 0蛋白大小约为26k u ,突变率低,结构稳定,较易表达和纯化,是E L I S A 检测中理想的包被抗原蛋白㊂目前原核表达系统广泛应用于各类病原微生物蛋白的表达[27-28],操作简单且高效,多克隆抗体制备简单㊁成本低㊁应用广泛,已有B V D V E 2等蛋白多克隆抗体的制备㊂但对于B V D V E 0蛋白相关抗体的制备报道较少,因此,本研究选用B V D V E 0蛋白,将其在原核表达系统中表达纯化,免疫小鼠制备B V D V E 0多克隆抗体㊂以纯化的E 0蛋白作为包被抗原,该多克隆抗体可用于B V D V 的E L I S A 检测,同时也可应用于组织及细胞培养中B V D V 感染的检测㊂B V D V E 0多克隆抗体虽然没有单克隆抗体的特异性好,但能与多株B V D V 发生结合反应,在一定程度上克服了B V D V 不同毒株之间抗原多样性问题,检测范围更广㊂本研究首先利用P C R 技术扩增出B V D V E 0基因片段,将其克隆至p E T -28a (+)载体,成功构建pE T 28a -E 0原核表达载体,然后将p E T 28a -E 0转化至大肠杆菌表达菌株B L 21(D E 3),并成功诱导表达E 0蛋白,大小约26k u ,与制备兔抗B V D V E 0多克隆抗体研究中[29]表达出大小约30k u 的B V D V E 0蛋白的结果基本符合㊂经可溶性分析发现,B V D VE 0蛋白主要以包涵体的形式存在㊂采用N iN T Ab e a d s 亲和层析纯化E 0蛋白,并将纯化的E 0蛋白与弗氏佐剂混合乳化后免疫小鼠,结果表明,制备的B V D V E 0多克隆抗体具有良好的免疫特异性,可用于W e s t e r nb l o t t i n g ㊁免疫荧光试验㊁E L I S A 等试验检测B V D V ,为后期研制B V D V E L I S A 检测试剂盒提供了抗体㊂并且在双抗夹心法E L I S A 检测B V D V 时发现,B V D V MO I 在0.2~0.4范围内检测效果较好,推测MO I =0.1时病毒粒子较少,而MO I =0.5时病毒粒子已经过饱和㊂值得注意的是,现如今中国的B V D V 防控状况仍十分艰巨,需要高效的疫苗免疫和有效的检测抗体㊂本研究制备的B V D V E 0多克隆抗体为B V D V 的检测奠定了基础,但该多克隆抗体还未进行临床应用,具体使用情况还需进一步研究㊂7313中国畜牧兽医49卷4结论本研究利用原核表达系统在37ħ,1m m o l/L I P T G条件下成功诱导表达B V D V E0蛋白,纯化蛋白免疫小鼠制备出B V D V E0多克隆抗体,该多克隆抗体能特异性识别B V D V及其在细胞内表达的E0蛋白,免疫特异性良好且效价较高,为研究B V D V E0蛋白的结构和功能及B V D V的检测提供了抗体㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]J O K A R M,R A HM A N I A N V,F A R H O O D I M,e ta l.S e r o p r e v a l e n c e o f B o v i n e v i r a l d i a r r h e a v i r u s(B V D V)i n f e c t i o ni n c a t t l e p o p u l a t i o ni nI r a n:A s y s t e m a t i cr e v i e w a n d m e t a-a n a l y s i s[J].T r o p i c a l A n i m a lH e a l t h&P r o d u c t i o n,2021,53(5):449.[2] M E RWA I S SF,C Z I B E N E R C,A L V A R E ZD E.C e l l-t o-c e l l t r a n s m i s s i o n i s t h em a i nm e c h a n i s ms u p p o r t i n gB o v i n e v i r a l d i a r r h e av i r u ss p r e a di nc e l l c u l t u r e[J].J o u r n a l o f V i r o l o g y,2019,93(3):e01776-18. 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牛支原体(新疆株)灭活疫苗的制备及犊牛免疫保护性评价
牛支原体(新疆株)灭活疫苗的制备及犊牛免疫保护性评价杨铭伟;剡根强;王静梅;王树杰;王学【摘要】为研发用于预防犊牛支原体肺炎及关节炎灭活油佐剂疫苗并评价其免疫效果,本研究采用牛支原体(Mycoplasmabovis,M.bovis)新疆分离株做为制苗菌株,经牛支原体专用液体扩大培养基培养后进行膜分离浓缩、甲醛灭活,加入油佐剂乳化制备牛支原体灭活疫苗,经无菌检验、实验动物安全性检验及乳化效果检测后进行犊牛免疫效果测定.结果显示,免疫组犊牛在二免后14 d,血清中M.bovis抗体达到0.465(OD450),3头攻毒犊牛均保持良好的精神状态且体温变化不明显,临床症状综合评分为3,肺脏解剖学及病理组织学观察无异常,肺脏病变指数为2且肺脏中未分离回收到M.bovis;未免疫对照组犊牛同期血清M.bo vis抗体为0.142(OD450),3头攻毒犊牛均先后出现体温升高、轻度咳喘、脓性鼻液、明显消瘦等症状,临床症状综合评分为11,肺脏病变指数为17,肺脏尖叶、心叶及部分膈叶均表现明显肝变,2头犊牛表现胸膜与肺脏黏连,1头犊牛整个尖叶广泛分布黄白色蚕豆状大小坏死性结节,与自然感染病例相同,病理组织学观察显示肺泡腔和支气管中有大量中性粒细胞浸润,支气管管壁充血、水肿,肺脏部分坏死灶呈均质红染,为典型的化脓性及坏死性肺炎变化,从病变肺组织中均分离回收到M.bovis.结果表明,本研究制备的牛支原体灭活疫苗给犊牛免疫后能产生良好的免疫应答反应,并能抵抗M.bo vi感染所致的肺脏病变作用.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2016(024)004【总页数】7页(P52-58)【关键词】牛支原体;疫苗;犊牛;免疫保护;病理学【作者】杨铭伟;剡根强;王静梅;王树杰;王学【作者单位】石河子大学动物科技学院,石河子832003;石河子大学动物科技学院,石河子832003;石河子大学动物科技学院,石河子832003;新疆西部牧业股份有限公司中心牛场,石河子832000;新疆西部牧业股份有限公司中心牛场,石河子832000【正文语种】中文【中图分类】S852.62牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）是引起犊牛肺炎、关节炎和成年牛乳房炎的主要病原体之一。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达步骤
3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
CCＹ的IPＴG是1M的,用时进行１０00倍稀释。ﻫ二、操作步骤ﻫ（一)获得目的基因
1、通过PCＲ方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PＣR循环获得所需基因片段。ﻫ2、通过RT-ＰCR方法:用TＲIｚoｌ法从细胞或组织中提取总ＲNA，以mＲNA为模板，逆转录形成cDNＡ第一链,以逆转录产物为模板进行PＣＲ循环获得产物。
1２、用３mｌ 含40０ｍM咪唑洗脱目的蛋白。
１3、镍柱用20%的乙醇适量，4℃保存。
1４、SDS-ＰAGＥ电泳检测蛋白纯化效果（上柱前样本,上柱后样本，杂蛋白，目的蛋白，未诱导蛋白）
附相关试剂配制：
50mＭ ＰBS
NａＨ2PO4.2H2O 1．48g
Na2ＨＰO４.１2Ｈ２Ｏ 14.５046g
NａＣL 29.3g
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件:ﻫ(1）选择标志的编码序列；
(2）可控转录的启动子；ﻫ（3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);
(４）一个多限制酶切位点接头;ﻫ(5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中(测序验证）-转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测,其中包括：ﻫ一、试剂准备ﻫ(1）ＬB培养基。ﻫ(2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）:2.３8g ＩPTG溶于１０ml ｄｄH2Ｏ中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。
鸡毒支原体VLHA3.03蛋白的原核表达及免疫原性分析
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报鸡毒支原体VLHA3.03蛋白的原核表达及免疫原性分析摘 要：为研究鸡毒支原体（MG ）的可变脂蛋白血凝素（VLHA ）的生物学功能，对VLHA 3.03蛋白进行原核表达，然后进行了免疫原性和免疫反应性分析。
通过Overlap PCR 方法对MG Rlow 株的vlha 3.03基因进行点突变扩增，将突变成功的vlha 3.03基因全长与原核表达载体pCold Ⅰ连接，连接产物转入大肠杆菌BL21进行诱导表达和纯化。
用纯化后的重组蛋白rVLHA3.03免疫新西兰大白兔，制备兔多克隆抗体，并用ELISA 检测抗体效价，再用制备的兔多克隆抗体、MG 不同分离株阳性鸡血清及MS 标准阳性血清分别与rVLHA3.03蛋白进行Western blot 反应，分析rVLHA3.03蛋白的免疫原性和免疫反应性。
结果表明，在大肠杆菌BL21中成功表达rVLHA3.03蛋白，且该蛋白具有较好的免疫原性和免疫反应性。
关键词：鸡毒支原体；VLHA ；原核表达；免疫原性；免疫反应性中图分类号：S858.31文献标志码：A文章编号：1674-6422（2022）02-0134-08Prokaryotic Expression and Immunogenicity Analysis of VLHA3.03 Protein inMycoplasma gallisepticumCHEN Yuetong 1,2, QI Jingjing 2, HU Zengjin 2,3, ZHAO Yuxin 2, LI Haoran 2,3, LIU Xiaohan 2,WANG Shaohui 2, TIAN Mingxing 2, GUO Ling 1, YU Shengqing 2, ZHOU Tiezhong 1(1. College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Jinzhou Medicine University, Jinzhou 121000, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 3. College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei230036, China)收稿日期：2021-11-10基金项目：国家自然科学基金（31902244）；国家重点研发项目（2017YFD0500705）；辽宁省科学技术计划项目（2021JH2/10200009）作者简介：陈玥彤，女，硕士研究生，兽医学专业通信作者：周铁忠，E-mail：***************；于圣青，E-mail：************.cn；祁晶晶，E-mail：****************2022,30(2): 134-141陈玥彤1,2，祁晶晶2，胡增金2,3，赵宇馨2，李浩然2,3，刘晓涵2，王少辉2，田明星2，郭 伶1，于圣青2，周铁忠1（1.锦州医科大学畜牧兽医学院，锦州121000；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；3.安徽农业大学动物科技学院，合肥230036）Abstract: In order to investigate the biological function of the variable lipoprotein hemagglutinin (VLHA) of Mycoplasma gallisepticum (MG), the recombinant VLHA3.03 protein was prokaryotically expressed for its immunogenicity and immunoreactivity analysis. Thevlha 3.03 gene of MG Rlow strain was amplifi ed by overlap PCR to obtain point mutations, then the mutant vlha 3.03 gene was ligated to the expression vector pCold I and then transformed into E. coli BL21. The rabbit antiserum against rVLHA3.03 was prepared by immunizing New Zealand white rabbits with purifi ed rVLHA3.03 protein and the antibody titer was detected in ELISA. The rVLHA3.03 protein was recognized in Western blot by rabbit anti-rVLHA3.03 serum, the positive chicken sera of different MG isolates and MS-positive serum, suggesting its good immunogenicity and immunoreactivity.Key words: Mycoplasma galliscepticum ; VLHA; prokaryotic expression; immunogenicity; immunoreactivity· 135 ·陈玥彤等：鸡毒支原体VLHA3.03蛋白的原核表达及免疫原性分析第30卷第2期鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum , MG ）是鸡慢性呼吸道疾病和火鸡传染性鼻窦炎的病原[1]，受感染的鸡会出现流鼻涕、面部肿胀、咳嗽，严重时张口呼吸或呼吸困难，有的可明显地听到湿啰音[2]。
《基于CRISPR-Cas系统建立牛呼吸道疾病病原的快速检测方法》范文
《基于CRISPR-Cas系统建立牛呼吸道疾病病原的快速检测方法》篇一基于CRISPR-Cas系统建立牛呼吸道疾病病原的快速检测方法一、引言牛呼吸道疾病（Bovine Respiratory Disease，BRD）是一种常见的动物疾病，其病原包括病毒、细菌等众多病原体。
随着全球养殖业的不断发展，对牛呼吸道疾病病原的快速、准确检测变得尤为重要。
近年来，CRISPR/Cas系统在生物医学领域的应用逐渐增多，其高特异性、高灵敏度的特点使其在病原检测方面具有巨大潜力。
本文旨在探讨基于CRISPR/Cas系统建立牛呼吸道疾病病原的快速检测方法。
二、CRISPR/Cas系统简介CRISPR/Cas系统是一种细菌中的适应性免疫系统，可以提供抵御外来遗传元件如病毒、质粒等的能力。
这一系统包含两种核心组成部分：CRISPR簇（重复序列间短的DNA片段）和Cas蛋白家族（执行与这一免疫反应相关功能的蛋白）。
CRISPR/Cas系统的原理在于对目标序列的识别与剪切，可以精准地对病原DNA 或RNA进行切割。
三、方法本研究的目的是开发一种基于CRISPR/Cas系统的牛呼吸道疾病病原快速检测方法。
具体步骤如下：1. 针对牛呼吸道疾病常见的病原体，设计并构建合适的CRISPR簇和Cas蛋白表达载体。
2. 利用这些表达载体构建重组的CRISPR/Cas系统，并在体外或体内对病原体的特定序列进行识别与切割。
3. 通过对切割产物的检测，快速确定病原体的存在及类型。
四、实验设计与实施实验设计主要围绕CRISPR簇和Cas蛋白的表达与纯化、与病原体的相互作用以及切割产物的检测等几个方面展开。
具体实施步骤如下：1. 构建表达载体：根据牛呼吸道疾病常见病原体的基因序列信息，设计并构建合适的CRISPR簇和Cas蛋白表达载体。
2. 表达与纯化：将构建好的表达载体转入适当的宿主细胞中，进行表达与纯化，获得足够的CRISPR簇和Cas蛋白。
牛布鲁氏菌OMP25的原核表达及表达产物的免疫学特性
．
４ ． ４．
中国动物检疫 ２ １ 年第２ 卷第 ６ ０１ ８ 期
牛布鲁 氏菌 Ｏ Ｐ ５的原核表达及 Ｍ２ 表达产物 的免疫 学特性
刘艳 琴 海 岩 吴树 清 ’ ， ，
（． １ 内蒙古农业大学兽 医学院， 呼和浩特
摘
００ １；． １ ０８２ 内蒙古疾病预防控制 中心， 呼和浩特
布鲁 氏菌 （ ｒｃｌ） Ｂ ｕｅｌ 是革 兰 氏阴性 兼性 细 胞 内寄 ａ 生菌 ， 能引起 多种 家 畜 的流 产 、 育 ， 不 引起 人 的 以发热 和不 育 为特 征 的布鲁 氏菌病 ， 畜牧 业 发展 和人 的健 给 康 造 成 极 大 的危 害 。 最 早 于 １８ ８７年 ， ｒｃ 死 于 Ｂ ｕｅ从 “ 马尔 他 热 ” 的英 国 士兵 脾 脏 中分 离 出来 ［ 目前世 界 １ １ ， 各 国布鲁 氏菌 病 普 查及 贸 易 检 疫最 常用 的方 法 是 检 测 抗 菌 体 表 面 脂 多 糖 （Ｐ ） 体 的血 清 学 方 法 ， 由 Ｌ Ｓ抗
＾ｌ ｃ ： 。 舶 Ｔ ｌ ｅａ ｄ ｅ ｐ ｅｓ ｈ ｒ ｃ ｌ ｕｅ ｍｂ ａ ｅｐ ｏｅ ， 曲 Ｉ ａ ｜ ｉ ｏ ｃ ｎ ｎ ｘ ｒｓ ｔ ｅｂｕ ｅ ａ ｏ ｔ ｍｅ ｒｎ ｒｔｉ ＯＭＰ ５ ａ ｄ ｔｅ ｅｅｔ ｔ ｒａｔ ｉ ｅＢ ｅ ａ ｏ ｌ ｒ ｎ ２ ｎ ｎ ｄ ｔ ｓ ｅ ｃ ｖ ｔ ｔ ｍｃ ｌ ｈ ｃ ｉ ｉ ｔ ｏｈ ｙ ｌ ｉ ｍｍｕ ｉ ｄｒｂ ｉ ｓｒ ｍ． ｎ ｚ ｂ ｔ ｅｕ ｅ ａ 岫 Ｔ ｅＢ ａ ｏｔｓ ５ ４ ｇ ｎ ａ Ｃ ｍｐｉｅ ｎ ｅ ｕ ｎ ｅ ，ａ ｄｔｅ ｒｋ ｒｏｉ ｅ ｐｅ ｓ ｎｐａｍｉ ｈ ． ｒ ４ ｅ ｅｗ ｓ Ｒ ａ ｌ ｄ ａ ｄｓｑ ｅ ｃ ｄ ｎ ｏ ａ ｔ ｘ ｒｓｉ ｌ ｄ ｂ ｕ Ａ Ｐ ｉ ｆ ｈ ｐ ｙ ｅ ｏ ｓ
原核表达重组牛凝乳酶原及重组牛凝乳酶酶学特性
原核表达重组牛凝乳酶原及重组牛凝乳酶酶学特性普燕;李轶杰;张富春【摘要】凝乳酶能够专一性裂解κ-酪蛋白,是制造干酪的关键酶.运用大肠杆菌表达系统对牛凝乳酶原进行了原核表达和初步纯化,活化重组凝乳酶原及测定凝乳活性,对重组凝乳酶的酶学特性进行分析.结果表明:大肠杆菌表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的66.3％,每升培养液可纯化约200 mg的重组凝乳酶原,活化后的凝乳酶活力可达600 000 SU/g.经测定凝乳酶最适作用温度为57 ～62℃,并在pH 2～7、低于40℃的温度范围内稳定.金属离子中A13+,Fe3和Cu2能显著增强酶活；胃蛋白酶抑制剂pepstatin A对酶有明显的抑制作用.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2013(039)008【总页数】7页(P13-19)【关键词】牛凝乳酶原;凝乳酶;原核表达;凝乳酶活力;酶学特性【作者】普燕;李轶杰;张富春【作者单位】新疆生物资源基因工程重点实验室,新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐,830046;新疆生物资源基因工程重点实验室,新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐,830046;新疆生物资源基因工程重点实验室,新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐,830046【正文语种】中文凝乳酶是制造干酪过程中起凝乳作用的关键性酶，对干酪的质构及干酪特有风味的形成有非常重要的作用。
它存在于未断奶的哺乳动物胃中，能够专一性裂解κ-酪蛋白多肽链105～106位的苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键［1－3］，使得酪蛋白沉淀凝聚，乳清排出。
凝乳酶的传统来源是吃奶的小牛皱胃(第四胃)，可用来制作各种类型的干酪，也是衡量其他凝乳酶代用品的标准。
随着世界范围内干酪市场需求的日益增长，来源于小牛皱胃的凝乳酶制剂难以满足干酪制作的需求量，人们开始寻找小牛凝乳酶替代品。
凝乳酶按来源分为动物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶以及基因工程凝乳酶。
但植物蛋白酶受到时间与地域限制，不能大规模获得;微生物凝乳酶对蛋白质分解能力比皱胃酶高，干酪得率低，成熟后味苦，耐热性高，给乳清的利用带来不便;其他动物来源的凝乳酶虽能替代部分小牛凝乳酶制作干酪，但也存在来源不稳定，酶稳定性差或凝乳活性低等问题。
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SCIENCE & RESEARCH1科学研究２０１８·８
牛支原体PepO原核表达及功能验证董亚旗１，２，３，朱习芳２，３，陈颖钰２，３，索朗斯珠１，郭爱珍２，３（１．西藏农牧学院动物科学学院，林芝 ８６００００；２．华中农业大学动物医学院，武汉 ４３００７０；３．华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 ４３００７０）
中图分类号：Ｓ８５８．２３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４－４２６４（２０１８）０８－０００１－０６ＤＯＩ： １０．１９３０５／ｊ．ｃｎｋｉ．１１－３００９／ｓ．２０１８．０８．００１摘 要：牛支原体是严重危害养牛业的重要病原体，阐明其毒力因子和致病机制有助于防控技术的研发。内
肽酶O（PepO）参与肺炎链球菌在猪体的致病过程，本研究旨在探讨PepO在牛支原体中是否具有毒力相关功能。利用巢式PCR将牛支原体PepO中的色氨酸密码子TGA突变为大肠杆菌的色氨酸密码子TGG，进一步克隆至大肠杆菌原核表达载体，成功表达重组蛋白PepO。利用重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备针对PepO的高免血清，经Western-blot 分析显示出多抗血清结合，可激活PLG的结构域，从而发挥降解特异性底物S-2251的纤溶酶功能。比较分析牛支原体PepO突变菌株T5.37与野毒株HB0801的生长及对牛肺上皮细胞EBL的黏附特性，其结果显示PepO缺失显著降低牛支原体对EBL的黏附。本研究证实了牛支原体PepO具有活性，参与宿主细胞黏附过程，是一个潜在的毒力相关因子，为进一步研究阐明牛支原体致病机制奠定了基础。关键词：牛支原体；ＰｅｐＯ；纤溶酶原；黏附
牛支原体病由牛支原体引起，包括多种疾病，主要为肺炎、乳腺炎、关节炎等.[1~3]，严重危害养牛业发展。目前，牛支原体病尚无特效治疗药物和疫苗，.牛支原体致病机制不清晰是阻碍防控技术和产品研发的重要原因。近年来，与定植、黏附、侵袭等感染有关的牛支原体蛋白逐步被发掘，如Vsp、a-Enolase、.VpmaX、.NADH.oxidase、TrmFO[4~8]等，为牛支原体致病机制的研究提供了依据。内肽酶O（pneumococcal.endopeptidase.O,.PepO）是一种金属内肽酶，与.M13.肽酶家族具有同源性，能够参与调节机体的多种生理和病理过程。有研究显示，在肺炎链球菌感染过程中，PepO能够与A549细胞互作，从而促进肺炎链球菌的定植、黏附、侵袭，通过与宿主蛋白互作来躲避机体的免疫清除，为其成功入侵A549细胞和血管内皮细胞提供了条件[9,10]。PepO蛋白也具有一定的酶活作用，主要表现在与纤溶酶原结合后，经尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）的激活产生纤溶酶，从而降解C3b等补体成分，进而辅助补体调节蛋白发挥作用，并通过TLR-2和TLR-4等信号通路调节宿主的天然免疫[10,11]。因此，在部分研究中，PepO也被
作为猪、人肺炎链球菌疫苗研发的候选蛋白。本实验室前期的研究中发现，牛支原体中也含有PepO蛋白，为了阐明其在牛支原体中的功能，本研究克隆表达了牛支原体PepO蛋白，制备了该蛋白的多克隆抗体，进一步对其酶活作用及其黏附作用进行了研究，以期为进一步揭示牛支原体的致病机制提供依据。
１ 材料与方法1.1 试验材料1.1.1.主要菌株、细胞以及培养条件牛支原体野毒株HB0801（GenBank.accession.No..NC-018077.1），由本实验室分离保存；牛支原
收稿日期：2018-03-30基金项目： 武汉市国际科技合作计划(2017030209020258)，现代农业(肉牛/牦牛)产业技术体系专项经费(CARS-37)。作者简介：董亚旗（1990-），男，硕士研究生。通讯作者：郭爱珍（1965-），女，博士，教授，从事兽医传染病防控理论和技术研究工作。SCIENCE & RESEARCH2科学研究２０１８·８
体突变库由本实验室构建，其中：M.bovis.T5.37.是PepO缺失株，37℃、5%CO2条件下培养于PPLO培养
基；胎牛肺上皮细胞（EBL），培养于含10%胎牛血清（Gibco）.的MEM培养基中（Hyclone），于37℃、5%.CO2条件下培养。待细胞长至单层时，用含0.25%.
EDTA的胰酶37℃消化处理3min，按照1:3的比例进行传代培养。1.1.2.试验动物选取5只5周龄SPF级健康雌性BALB/C小鼠，体重在16~18g，购自三峡大学实验动物中心（No.42010200000993），用于制备重组蛋白rPepO的多克隆抗体。试验动物操作严格遵守华中农业大学试验动物使用及伦理原则。1.1.3.主要试剂PPLO、酵母粉、琼脂粉，购自美国BD公司；胎牛血清，购自美国Gibco公司；MEM细胞基础培养基、马血清，购自美国Hyclone公司；细菌基因组提取试剂盒，限制性内切酶NcoI、XhoI，购自大连宝生物TaKaRa有限公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、T4.DNA连接酶，购自北京天根生物科技有限公司；PVDF膜，购自GE公司；超滤离心管，购自美国Merck.Millipore；BCA蛋白浓度检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体，购自美国伯明翰Southern.Biotech。1.2 试验方法1.2.1.牛支原体PepO基因克隆提取牛支原体HB0801基因组DNA，运用巢氏PCR将牛支原体PepO的色氨酸密码子TGA突变为TGG（引物序列见表1），利用限制性内切酶NcoI、XhoI将目的基因和已提取好的质粒pET-30a置于37℃酶切3h，利用胶回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化，用T4.DNA连接酶将酶切产物置于16℃连接过夜；将连接产物转化至感受态细胞DH5α中，37℃培养过夜，挑取3~5个菌落进行摇菌，并采用菌落PCR及测序方法对所挑的菌落进行筛选、鉴定，最后将筛选出来的阳性重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中。1.2.2.PepO蛋白的表达与纯化将成功构建的BL21表达菌株，按1:1.000接种于含卡那抗性的LB液体培养基中，37℃、200r/min摇菌
3h，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导剂，37℃、200r/min诱导表达2.5h，4℃离心收集菌体沉淀，液压破碎之后，4℃、12.000r/min.离心30min。将经0.22μm滤器过滤的上清通过Ni柱和超滤管，对所得蛋白进行纯化、浓缩。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度之后，加入50％的甘油，于-80℃保存。1.2.3.PepO多克隆抗体的制备（1）小鼠免疫：将纯化的PepO蛋白分三次免疫3只BALB/C雌性小鼠，另外2只作为阴性对照。首次免疫，取150μg蛋白与相同体积的弗氏完全佐剂进行充分乳化，采用颈背部皮下多点注射对每只小鼠进行免疫；间隔2周之后进行第二次免疫，采用150μg蛋白与相同体积的弗氏不完全佐剂混匀并乳化；再间隔1周以后进行第三次免疫，具体剂量方法均同第二次免疫。第三次免疫一周后进行小鼠眼球采血，37℃恒温箱中放置1h后，4℃过夜，让血清自然析出，4℃、4.000r/min离心10min，收集血清，待测定效价之后，于-20℃保存。（2）血清抗体效价检测：取纯化的蛋白加入包被液中，按每孔100ng包被ELISA板子，4℃包被过夜。然后PBST洗涤3次，每次3min，5%脱脂奶粉室温封闭3h，PBST洗涤3次。用PBS将抗血清从1:100稀释到1:204.800倍。以每孔100μL的量加到包被好的ELISA板中，37℃孵育1h后，PBST洗涤3次，同时PBS组血清为
表1 牛支原体PepO定点突变引物序列引物名称引物序列突变片段（bp）0428A含同源臂GACGACGACGACAAGGCCATGGCTATGAATGAAAAAATAAGATTAGAAGACGANcoI同源臂序列
0428AATGAATGAAAAAATAAGATTAGAAGACGATTTTTATGAAAGTGTTAATGGCGAGTGGCTAGAAAA0-65
0428 B1TGGCGAGTGGCTAGAAAAAG55-8600428 B2TGTTTTTAAAAACATCCATGACTTAATATTTTCAA0428C1TTGAAAATATTAAGTCATGGATGTTTTTAAAAACA850-11320428C2TTAGTGCTTTTACTTAACCAGTCATTTT0428D1AAAATGACTGGTTAAGTAAAAGCACTAA1120-13100428D2TAAATTCCCATGTGTTTTTAACAACTGT
0428EAAAAACACATGGGAATTTAATCAATATTTAAAGCCTATTAACAGAAACTACTGGAGTATGTCTCC1300-1365
0428F1ACTACTGGAGTATGTCTCCTGC1355-15650428F2CTTTATAGTCTTTAGAACTCCACCATAAGT0428G1ACTTATGGTGGAGTTCTAAAGACTATAAAG1555-17800428G2CAGGCTTATATTTGCTTTTCCATATTACT0428H1AGTAATATGGAAAAGCAAATATAAGCCTG1770-19200428H2CTTGTTTTTAGGTAACCACATTTTGTCA
0428IGACAAAATGTGGTTACCTAAAAACAAGCGTGTAAAAATTTGGTAG1903-1948
0428I含同源臂ACGGAGCTCGAATTCGGATCCCTACCAAATTTTTACACGCTTGXhoI同源臂序列