红三叶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

第３５卷第２期　草原与草坪２０１５年　２１　红三叶ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应　体系的建立与优化　孟丽娟，赵桂琴　（甘肃农业大学草业学院／草业生态系统教育部重点实验室／甘肃省草业工程实验室／中一美草地畜牧业　可持续发展研究中心，甘肃兰州　７３００７０）　

摘要：采用正交试验设计，对影响红三叶ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应较大的４个因素（Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、　Ｍｇ抖、ｄＮＴＰ及引物）在４个水平上进行筛选，建立并优化了适合红三叶ＩＳＳＲ分析的最佳反应体系。　在２５　Ｌ反应体系中各反应物的最适含量为４０　ｎｇ模板ＤＮＡ，１０×ＰＣＲ－ｂｕｆｆｅｒ　２．５　Ｌ，２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ抖，２．５　Ｕ　口ＤＮＡ聚合酶，引物１￣ｍｏｌ／Ｌ，０．２　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ。反应程序为：９４℃预变性５　ｍｉｎ；　９４℃变性３０　Ｓ，引物退火３０　Ｓ，７２℃延伸１　ｒａｉｎ，循环３５次；７２℃延伸７　ｍｉｎ，４℃保存。优化体系的建　立为采用ＩＳＳＲ分子标记技术进行红三叶种质资源遗传多样性分析提供了技术参考。　关键词：红三叶；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ；正交优化　中图分类号：Ｓ　５４１；Ｑ　７５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００９—５５００（２０１５）０２—００２１—０６　

红三叶（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｐｒａｔｅｎｓｅ）为豆科三叶草属多　年生草本植物，生存５～８年。中国新疆、吉林、云贵高　原、湖北鄂西山地都有野生分布，江淮流域、华南、西南　和西北等地均有栽培，是长江流域以南及甘肃二阴区　优良的豆科牧草　］。红三叶生长速度快、再生力强、　产草量高、草质柔嫩多汁、适口性好、营养价值高，各种　畜禽和鱼类均喜食［３］。目前，三叶草遗传多样性研究　主要采用ＲＡＰＤ［　，　、ＳＲＡＰ［　、ＳＳＲ［　等技术，而且大　多集中于白三叶。对红三叶种质资源的研究主要集中　在栽培技术　引，株型结构　，营养价值　］，转基因［ｕ］，　异黄酮Ｌ１。］等方面，利用ＩＳＳＲ标记研究红三叶遗传多　样性具有实际价值。　ＩＳＳＲ标记是在微卫星分子标记基础上发展起来　的一种分子标记口　。该技术利用简单重复序列（ｓＳＲ）　来设计引物，无需预先克隆和测序，操作简单易行。　ＩＳＳＲ引物序列长、退火温度高、特异性和稳定性增强，　可检测到更丰富的遗传变异［１　。ＩＳＳＲ标记结合了　收稿日期：２０１４—１０—１５；修回日期：２０１５—０３—２３　基金项目：农业部牧草种质资源保护项目（２０１３０１４）和甘　肃高校基本科研业务费项目（２０１２００９）资助　作者简介：孟丽娟（１９９０－），女，甘肃镇原人，在读硕士。　Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｅｎｇｌｉｊｕａｎ０１１８００２６＠１６３．ｃｏｒｎ　赵桂琴为通讯作者。　ＲＡＰＤ和ＳＳＲ的优点，具有模板需要量少，多态性丰　富，无需试剂盒，结果记录方便，试验成本低，操作简　单，试验稳定性高等优点而倍受青睐Ｌ１引，广泛应用于　生物研究的各个领域。近年来，ＩＳＳＲ分子标记技术已　开始应用于草种质资源遗传多样性研究，在早熟禾　（Ｐｏａ口　ｎ）［　、鹅观草（Ｒｏｅｇｎｅｒｉａ　ｋａｍｏｊｉ）［”］、燕麦　（Ａｒｅｎａ　ｓａｔｉｖａ）　、披碱草（Ｅｌｙｍｕｓ　ｎｕｔａｎｓ）［　、紫花　苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ）［２。。、昆仑锦鸡儿（Ｃａｒａｇａｎａ　ｐｏｌｏｕｒｅｎｓｉｓ）［ｎ］、小花棘豆（Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａ）［船］和扁　蓄豆（Ｒｕｔｈｅｎｉａｎ　ｍｅｄｉｃ）［２　３］等牧草上均有报道。但由　于ＩＳＳＲ－ＰＣＲ是基于ＰＣＲ的一种标记，其反应条件易　受到各因素浓度的影响，反应体系不同也可产生不同　的结果。为了确保ＩＳＳＲ分析结果的可靠性和重复　性，进行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的优化非常必要。利用　ＩＳＳＲ分子标记技术，以国外引进的１０份红三叶种质　为材料，以红三叶基因组ＤＮＡ为模板，采用正交实验　设计［２　］对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系进行优化，探讨反应体　系中随机引物、ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｍｇ　等的浓　度以及反应的退火温度和循环次数等因子对红三叶基　因组的ＩＳＳＲ扩增效果的影响，旨在建立一种用于红　三叶的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，为进一步开展红三叶遗　传多样性研究奠定基础。　２２　ＧＲＡＳＳＬＡＮＤ　ＡＮＤ　ＴＵＲＦ（２０１５）　Ｖｏ１．３５　ＮＯ．２　１材料和方法　１．１试验材料　供试的１Ｏ份红三叶材料（表１），均种植于甘肃省　中部的榆中县良种场，在生长期采集新鲜叶片，置于　

一８０℃冰箱保存备用。　表１试验材料及来源　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　ｓｏｕｒｃｅ　

１．２试剂　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、引物、　ＭｇＣ１　、Ｍａｋｅｒ均来自上海生工。ＩＳＳＲ引物参照加拿　大哥伦比亚大学（ＵＢＣ）提供的ＩＳＳＲ引物序列，由上　海生物工程有限公司合成。　１．３基因组ＤＮＡ的提取与检测　采用改良的ＣＴＡＢ法＿２　］提取红三叶叶片总　ＤＮＡ，用ｌ　的琼脂糖凝胶电泳检测质量，并用Ｇｅｎｅ　Ｓｐｅｃ核酸检测仪检测ＤＮＡ质量浓度。最后将样品稀　释为２０　ｎｇ／ｐ．Ｌ，一２Ｏ℃保存备用。　１．４　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交试验设计　在ＰＣＲ反应体系建立过程中，ｄＮＴＰ浓度、引物　浓度、Ｍｇ。　浓度以及Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量、退火温　度和循环次数等均影响ＰＣＲ扩增结果。针对Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量、Ｍｇ。　浓度、ｄＮＴＰ浓度、引物浓度　等４个主要因素，选用Ｌ。　（４　）正交表［２　，设计ＰＣＲ各　反应成分的因素水平（表２）及正交试验（表３）。反应　体系总体积为２５　Ｌ，除上述４个变化因素外，每管包　括１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５　Ｌ，模板ＤＮＡ　２　Ｌ。采用筛　选的最佳引物ＵＢＣ８４１作为固定引物，用１号红三叶　种质的ＤＮＡ作为固定模板，进行ＰＣＲ扩增条件的优　化，初始反应程序为：９４℃预变性５　ｍｉｎ；９４℃变性３Ｏ　Ｓ，引物退火３０　Ｓ，７２℃延伸１　ｍｉｎ，循环３５次；７２℃延　

伸７　ｒａｉｎ，４℃保存。ＰＣＲ扩增完成后，取８　Ｌ扩增产　物在１．７　的琼脂糖凝胶上电泳，在１×ＴＢＥ缓冲液　中电泳约１　ｈ（电压为１００　Ｖ），检测后置于ＵＶＰ紫外　凝胶成像系统中观察拍照。　表２　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的因素与水平　Ｔａｂｌｅ　２　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＩＳＳＲ—ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　

１．５退火温度和循环次数的确定　根据正交试验结果找出最佳处理，应用最佳处理　从２Ｏ条引物中筛选出多态性丰富的引物。根据所选　引物的理论退火温度Ｔｍ［Ｔｍ一４（Ｇ＋ｃ）＋２（Ａ＋　Ｔ）］，对每个引物的退火温度进行梯度试验，设定退火　温度为４７～５７℃，由ＰＣＲ扩增仪自动生成８个温度　梯度。即４７．０、４７．７、４８．９、５０．７、５３．０、５４．９、５６．２、　５７．０℃。用基础反应程序筛选引物的最佳退火温度。　根据最佳反应体系和最适退火温度对循环次数进行３　个梯度试验。即３Ｏ、３５、４０次，每个梯度设２个重复。　１．６优化体系稳定性检测　随机筛选其他ＩＳＳＲ引物，对优化确定的红三叶　ＩＳＳＲ—ＰＣＲ反应体系、退火温度及循环次数进行扩增，　对优化体系的稳定性进行检测。　表３　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交试验设计方案　Ｔａｂｌｅ　３　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ［Ｌ１６（４　）］ｆｏｒ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　编　ｕ　Ｔ　ａｑＤ　ＮＡ　Ｍ。ｇ

。

。０　ｉ　

０．５Ｏ　０．２５　０．７５　１．Ｏ　０．７５　１．Ｏ　Ｏ．２５　Ｏ．５Ｏ　ｌ＿Ｏ　Ｏ．７５　０．５０　Ｏ．２５　

ｌ　Ｏ　０　Ｏ　１　Ｏ　２　ｌ　第３５卷第２期　草原与草坪２０１５年　２５　ｄＮＴＰｓ，使ｄＮＴＰｓ消耗殆尽，无延伸反应，造成扩增失　败。此外，Ｍｇ　还影响引物与模板的结合，从而导致　ＰＣＲ结果的改变口　。试验优化的Ｍｇ　浓度为２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ。ｄＮＴＰｓ是ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的基本原料，　ｄＮＴＰｓ浓度过高，会导致ＰＣＲ错配，从而出现非特异　性扩增；过高会导致扩增不完全，条带少，产物弱。根　据试验结果可知，最为理想的ｄＮＴＰ浓度是０．２　ｍｍｏｌ／Ｌ。引物是ＰＣＲ特异性反应的关键，引物浓度　要适量，浓度过低时扩增产物少、条带弱，过高会出现　非特异性条带。结果表明，在２５　Ｌ的反应体系中，引　物浓度为１／ｌｍｏｌ／Ｌ时扩增效果最好。虽然模板ＤＮＡ　浓度是ＩＳＳＲ—ＰＣＲ反应体系的影响因素之一，但ＩＳＳＲ－　ＰＣＲ反应对ＤＮＡ模板浓度的要求范围较宽，相关试　验［３　也证明了模板浓度对ＰＣＲ扩增结果影响不敏　感。因此，未对模板ＤＮＡ的浓度进行梯度试验，直接　采用模板ＤＮＡ的浓度为４０　ｎｇ／￣Ｌ，取得了较为理想　的结果。　ＰＣＲ反应中，退火温度和循环次数对扩增结果都　有一定的影响。退火温度的高低直接影响引物与模板　的特异性结合。退火温度较低时虽然能保证模板与引　物稳定结合，但也会产生错误扩增［３　。退火温度过高　时，引物与模板结合差，ＰＣＲ产物少。由于不同的引　物有其适宜的退火温度，若选用不同的引物还需通过　试验进行优化［２　。因此，对筛选出的５条引物逐个进　行退火温度梯度试验，确定每个引物的最适退火温度。　该试验所用引物ＵＢＣ８４１和ＵＢＣ８５１的最适退火温度　分别为５０．７℃和５４．９℃。循环次数直接影响到　ＰＣＲ反应产量的多少。从理论原则上，循环次数与扩　增产物量成正比关系，但实际上循环次数过多会增加　非特异扩增产物的数量和复杂性，从而导致条带弥散、　带间模糊＿３　。采用３５个循环就能达到良好的扩增效　果，在一定程度上节约了试验时间。　

４　结论　对ＩＳＳＲ反应影响较大的４个因素进行了优化，建　立了红三叶ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的最优反应体系。在２５“Ｌ体　系中，包含４０　ｎｇ模板ＤＮＡ，１０×ＰＣＲ－ｂｕｆｆｅｒ　２．５　Ｌ，　２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ抖，２．５　Ｕ　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，引物１　ｕｍｏｌ／Ｌ，０．２　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ。反应程序为：９４℃预变　性５　ｍｉｎ；９４℃变性３０　Ｓ，引物退火３０　Ｓ，７２℃延伸　１　ｍｉｎ，循环３５次；７２℃延伸７　ｍｉｎ，４℃保存。　

参考文献：　［１］王建丽，申忠宝，潘多锋，等．红三叶种质资源农艺性状的　综合评价及聚类分析［Ｊ］．草原与草坪，２０１３（２）：３３—３７．　［２］刘宁芳，徐庆国，杨知建，等．不同三叶草品种的农艺性状　与营养特性比较口］．Ｃｒｏｐ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７（２）：１２８—１３０．　［３］贾慎修．中国饲用植物志［Ｍ］．北京：农业出版社，１９８７：　３３２—３３７．　［４１　Ｓｈａｒｍａｓ　Ｔ　Ｒ，Ｓｉｎｇｈ　Ｒ　Ｋ，Ｃｈａｈｏｔａ　Ｒ，ｅｔａｌ，Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅ—　ｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ｗｈｉｔｅ　ｃｌｏｖｅｒ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｒｅｐｅｎｓ　Ｌ．）ａｅ—　ｃｅｓｓｉｏｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｇｒｏ—ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ＲＡＰＤ　ｍａｒｋｅｒｓ　［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００５，５９：３—４．　［５］张贤，张英俊，吴维群．白三叶ＲＡＰＤ分析条件优化［Ｊ］．　草地学报，２００６，１４（３）：２１９—２２２．　［６］张婧源，彭燕，罗燕，等．不同产地白三叶种质遗传多样性　的ＳＲＡＰ分析［Ｊ］．草地学报，２０１０，１９（５）：１３Ｏ一１３８．　［７］　Ｇｅｏｒｇｅ　Ｊ，Ｄｏｂｒｏｗｏｌｓｋｉ　Ｍ　Ｐ，Ｖａｎ－Ｚｉｊｌｌ—ｄｅ—Ｊｏｎｇ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ｏｆ　ｗｈｉｔｅ　ｃｌｏ—　ｖｅｒ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｒｅｐｅｎｓ　Ｌ．）ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＳＳＲ　ｐｏｌｙｍｏｒ—　ｐｈｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，２００６，４９：８．　［８］　杜诗平，段友海．红三叶栽培技术［Ｊ］．湘西科技，２００３（４）：　５—６．　［９１孔令慧，赵桂琴．红三叶株型结构与草产量的相关性研究　［Ｊ１．草原与草坪，２０１３，３３（３）：１１—１５．　［１Ｏ］赵娜，赵桂琴，胡凯军．不同生长年限红三叶生产性能与　营养价值比较［Ｊ］．草地学报，２０１１，１９（３）：４６８—４７２．　［１１］赵桂琴，ＫａｌｌａＲ．ＡＭＶ和ＷＣＭＶ在转基因红三叶中的　基因累集［Ｊ］．草业学报，２００３，１２（２）：１０６—１１１．　［１２］赵娜，赵桂琴，刘欢．基因型对红三叶异黄酮含量的影响　［Ｊ１．草原与草坪，２０１１（１）：６６—６９．　［１３１　Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ　Ｅ，Ｒａｆａｌｓｋｉ　Ａ，Ｌａｂｕｄａｄ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ—　ｉｎｇ　ｂｙ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）一ａｎｃｈｏｒｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒ—　ａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｅｓ，１９９４，２０：　１７６—１８３．　［１４］刘海龙，马锦林．１１份山茶属植物亲缘关系的ＩＳＳＲ分析　［Ｊ１．经济林研究，２０１２，３０（４）：８７—９Ｏ．　［１５］刘美，赵桂琴，刘欢，等．早熟禾ＩＳＳＲ反应体系的优化　［Ｊ］．中国草地学报，２００９，３１（５）：１０７—１ｌ１．　［１６１赵桂琴，刘欢，刘美．ＩＳＳＲ标记的早熟禾遗传多样性分析　［Ｊ］．草地学报，２０１１，１９（５）：７８１—７８６．　［１７］　肖海峻，徐柱．利用ＩＳＳＲ标记研究鹅观草属种质资源的　遗传多样性［Ｊ１．华北农学报，２００７，２２（４）：１４６—１５０．　［１８］刘欢，慕平，赵桂琴，等．燕麦ＩＳＳＲ反应体系的建立与优　化［Ｊ１．中国草地学报，２０１０，３２（４）：８ｏ一８５．　［１９１李永祥，李斯深，李立会，等．披碱草属１２个物种遗传多