了解琼脂糖凝胶电泳的不同类型与特点
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
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电泳技术
电泳技术介绍几种常用电泳1．醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维素薄膜为支持物醋酸纤维素薄膜是一种细密而薄的微孔膜。
特点：（1）电泳后区带界限清晰；（2）通电时间较短；（3）它对各种蛋白质几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；（4）灵敏度高，样品用量少。
（5）对染料也没有吸附。
2．琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，由D-半乳糖和3，6－脱水－L半乳糖连接而成的一种线性多糖。
它具有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
优点：1.操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳2.琼脂糖凝胶结构均匀，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好3.琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量测定4.电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。
琼脂糖凝胶电泳主要用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等，为DNA分子及其片段分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。
3．聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。
它是由单体丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）聚合而成，这一聚合通常需要有自由基催化完成。
PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等（1）优点①几乎无电渗作用。
②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。
对pH和温度变化较稳定。
③在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，机械性能好，易观察。
④凝胶孔径可调。
⑤分辨率高，尤其在不连续不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。
（2）聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成，Acr和Bis无论单独存在或混合在一起时都是稳定的，出现自由基团时，就会发生聚合反应，自由基团的引发有化学和光学两种方法，通常我们使用化学聚合，如催化系统：过硫酸铵――TEMED（四甲基乙二胺），过硫酸铵产生游离氧原子，使单体成为具有游离基状态，从而发生聚合，TEMED的作用是加速剂。
实验七---DNA的琼脂糖凝胶电泳
实验七---DNA的琼脂糖凝胶电泳实验七DNA的琼脂糖凝胶电泳（4学时）实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。
本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
实验原理琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。
这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。
不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。
在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。
影响核酸分子泳动率的因素主要是：1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。
一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。
但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。
琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳实验技巧核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液(pH8.0-8.3)中，基其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。
琼脂糖主要多海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分了，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。
琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速、通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多实验的要求。
因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。
一、操作过程中要注意以下一些问题。
1、凝胶制作1.1 凝胶浓度凝胶的浓度据实验需要而变，一般在1.8%-2.0%之间，没有用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定。
补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充水分到原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。
粗略一点的办法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值，以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。
如果条带要回收最好不要用回收胶。
1.2 梳板的选用一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板。
梳齿宽厚，形成的点样孔容积较大，用于DNA片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孔容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。
回收的话还可以将几个齿用透明胶带粘起来，形成一个窄而长的大孔以加大点样量提高回收率。
梳板的选择主要是看上样量的多少而定。
一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。
另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孔底层，导致点样后样品渗漏。
当然，点样孔的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30min以上方可拔出梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块入4度冰箱中冷却15min左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孔。
琼脂糖凝胶电泳
• 上样缓冲液
• 甘油可增加样品密度，使其 比重增加，以确保DNA均匀 沉入加样孔内
• 在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速 度和位置
• 使样品呈色，使加样操作更 方便
琼脂糖凝胶电泳
• 电压1-5V/cm • 电泳时间大约1小时 • 最前缘至胶全长3/4时停止
+
溴化乙锭( EB)染色
– 迁移距离相同的两 条带，大小相同
Log MW
Distance
注意事项
• 一定要等凝胶冷却至60℃时再入加溴化乙 锭
• 切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负)
• 加完样品后最好先观察一段时间 • 插电极或拔电极时必须将仪器电源关掉 • 不要使样品跑出凝胶
琼脂糖凝胶电泳应用
• PCR产物鉴
溴化乙锭是一种荧光染 料,可嵌入核酸双链的 碱基对之间，在紫外 线激发下，发出红色 荧光，常用 0.5mg/ml
+
+
EB堆砌在DNA双螺旋 的碱基对之间
DNA 分子越小,结合的 EB 越少,染色越淡
DNA的琼脂糖凝胶电泳照片
琼脂糖凝胶电泳
• 结果
片段大小的鉴定分析
– 通过marker比较不 同条带的迁移率
DNA的琼脂糖凝胶电泳
DNA的琼脂糖凝胶电泳自1937年瑞典的Tiselius创造纸电泳以来，人们又创造了许多新的支持电泳的介质，其中较为常见的是琼脂糖及聚丙烯酰胺。
普通琼脂糖凝胶制胶容易，能分离的核酸片段长度范围广（0.2-50kb）,可以区分相差约100bp的DNA片段；聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率（5bp）要高于琼脂糖，但它能分离的核酸分子通常<1kb，且制胶等的操作远比制备琼脂糖凝胶来得麻烦。
当DNA分子相当大，其双螺旋的半径超出凝胶的孔径时，如果还用普通琼脂糖凝胶电泳进行分离，则DNA可能跑不出胶孔。
在这种情况下，应选用脉冲凝胶电泳。
脉冲凝胶电泳可以区分相差几百kb的DNA片段。
在本节中，我们主要介绍DNA的琼脂糖凝胶电泳。
用于分离RNA的琼脂糖凝胶电泳，在胶的制备及所使用的缓冲液等方面与DNA有所不同，请参见相关的章节。
琼脂糖是从海藻中提取的线状多聚物。
加热到90ºC左右，琼脂糖即可熔化形成清亮透明的液体，浇在模板上冷却后固化形成凝胶，其凝固点为40-45ºC。
琼脂糖凝胶电泳是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应达到分离DNA混合物的目的。
DNA 分子在碱性条件下（pH8.0-8.3），碱基几乎不解离，而链上的磷酸基团解离，所以整个DNA分子带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子迁移速度取决于分子本身的大小和构型，DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。
在碱性条件下，单链DNA与等长的双链 DNA的泳动率大致相同。
电泳装置琼脂糖凝胶电泳现大多使用水平电泳槽。
较之早先的垂直电泳槽，水平电泳槽在凝胶的制备上比较灵活，且可使用低浓度的凝胶。
由于水平电泳槽的两极是相通的，这样正负极的缓冲液也不会因为电泳时间久了而产生太大的差异。
电泳缓冲液在电泳的过程中，HO被解离，在阳极产生H+,而在阴极产生OH-，即阴极逐渐变碱2而阳极逐渐变酸。
琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理
琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理)聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。
琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。
琼脂糖凝胶分离dna度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的dna段。
琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。
聚丙烯酰胺分离小片段dna（5-500bp）效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的dna段就能分开。
聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的dna,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。
聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。
目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行dna电泳。
琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由d-半乳糖和3,6脱水l-半乳糖连接而成的一种线性多糖。
琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。
琼脂糖主要在dna制备电泳中作为一种固体支持基质。
琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。
琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。
尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。
琼脂糖凝胶可以用作蛋白质和核酸的电泳积极支持介质，尤其适合于核酸的纯化、分析。
例如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说就是比较小的，对蛋白质的制约促进作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率为的影响相对较小，所以适用于于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷去展开拆分的电泳技术，例如免疫电泳、平板等电著眼电泳等。
琼脂糖凝胶电泳在蛋白质分离与检测中的应用
琼脂糖凝胶电泳在蛋白质分离与检测中的应用在生物科学领域中，蛋白质分离与检测是一项重要的实验技术，而琼脂糖凝胶电泳作为常用的方法之一，被广泛应用于蛋白质的分离与检测。
本文将介绍琼脂糖凝胶电泳的原理和应用，以及其在蛋白质研究中的重要性。
1. 琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳是一种基于凝胶介质进行分离的电泳技术。
它利用琼脂糖在制备过程中形成的三维网状凝胶，通过凝胶孔隙大小的差异，使得不同大小的蛋白质能够在电场中移动，并在凝胶中分离。
2. 琼脂糖凝胶电泳的操作步骤（1）制备琼脂糖凝胶：首先，按照配方将琼脂糖和缓冲液混合，然后进行加热搅拌，使其完全溶解。
接着，将溶液倒入凝胶板中，并插入电泳仓。
等待凝胶固化后，准备进行电泳操作。
（2）样品加载：将待分离的蛋白质样品与加载缓冲液混合，并进行加热处理，使其完全溶解。
然后，将样品缓冲液慢慢地加载到凝胶板上的孔洞中。
（3）电泳操作：在已经装载好凝胶板的电泳仓中，连接正负电极，分别接入电源。
然后，设置适当的电流和电压，开始电泳过程。
等待一定时间后，关闭电源，取出凝胶板。
（4）染色与检测：将凝胶板浸泡在染色液中，使蛋白质分子可见。
然后，用适当的方法进行定量检测。
3. 琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳作为一种常用的蛋白质分离与检测技术，在科学研究和生物医学领域有着广泛的应用。
（1）分子量测定：琼脂糖凝胶电泳可用于分析蛋白质样品中不同分子量的成分，并通过与已知分子量的标准物质进行比较，确定待测蛋白质的分子量。
（2）蛋白质分离：琼脂糖凝胶电泳的凝胶孔隙大小可以调节，可以根据蛋白质的大小范围进行选择，从而使得不同大小的蛋白质能够在凝胶中分离。
这为蛋白质组分的分析和研究提供了便利。
（3）多蛋白质复合体分析：琼脂糖凝胶电泳也可以用于研究多蛋白质复合体的组成和大小，通过凝胶孔隙的选择，可以分离出不同组分的复合体，并通过染色和检测，得到有关复合体的相关信息。
（4）疾病诊断：琼脂糖凝胶电泳在临床诊断中也有一定的应用，特别是对于一些蛋白质异常变化与疾病相关的情况。
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了解琼脂糖凝胶电泳的不同类型与特点
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和检测生物大分子（如蛋白质和
核酸）的技术。
它基于琼脂糖在适当的缓冲溶液中形成凝胶的特性，
通过电场作用使待测大分子在凝胶中进行迁移分离的过程。
琼脂糖凝
胶电泳可以分为几种不同类型，每一种都有其特点和应用领域。
一、水平琼脂糖凝胶电泳
水平琼脂糖凝胶电泳是最早应用于大分子分离的技术之一。
它通过
在平板的琼脂糖凝胶上进行电泳，使待测样品在水平方向上进行迁移。
由于凝胶厚度有限，水平琼脂糖凝胶电泳适用于分离较小的生物大分子。
其优点是操作简单，分离速度较快，但由于凝胶曲线存在较大的
热效应，会导致样品的横向扩散，限制了其分辨率。
二、垂直琼脂糖凝胶电泳
垂直琼脂糖凝胶电泳是目前最常用的琼脂糖凝胶电泳技术。
它通过
将琼脂糖溶解在缓冲液中，并在垂直的平板上形成等浓度的凝胶。
待
测样品经过凝胶进行迁移分离时，受到凝胶微孔的筛选作用，使分离
结果更为准确。
垂直琼脂糖凝胶电泳分辨率高，适用于分离和鉴定大
小较为接近的蛋白质和核酸。
此外，可以根据需要选择不同浓度的琼
脂糖凝胶，以实现对分子大小范围的调控。
三、双向琼脂糖凝胶电泳
双向琼脂糖凝胶电泳是在垂直琼脂糖凝胶电泳的基础上发展而来的
一种技术。
它通过改变缓冲液的电场方向以及凝胶孔道大小，使待测
样品在垂直方向上进行双向迁移分离。
双向琼脂糖凝胶电泳具有更高
的分离能力和分辨率，在分离和鉴定蛋白质和核酸复杂混合物时表现
出优势。
然而，双向琼脂糖凝胶电泳的操作相对复杂，需要更多的实
验条件和设备支持。
综上所述，琼脂糖凝胶电泳作为一种常用的生物大分子分离和检测
技术，具有多种类型和特点可供选择。
水平琼脂糖凝胶电泳操作简单，分离速度较快，适用于较小的大分子；垂直琼脂糖凝胶电泳分辨率高，适用于分离更接近大小的生物大分子；双向琼脂糖凝胶电泳具有更高
的分离能力和分辨率，适用于复杂样品的分析。
根据实验需求和目标，合适的琼脂糖凝胶电泳技术可以有效提高分离和鉴定的准确性和可靠性，为生物研究提供有力的支持。