碱性磷酸酶ELISA方法
elisa优点及用途
elisa优点及用途Elisa是一种常用的免疫学实验方法，它可以检测样本中特定抗原或抗体的存在。
Elisa具有许多优点，包括高灵敏度、高特异性、简单易操作、快速结果等。
因此，Elisa被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
一、Elisa的基本原理1.1 免疫反应Elisa是一种免疫学实验方法，其基本原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合来检测样品中特定抗原或抗体的存在。
在免疫反应中，抗原与相应的抗体结合后形成不溶性复合物，这种复合物可以通过各种方式进行检测。
1.2 酶标记技术为了增强检测信号，常采用酶标记技术。
在酶标记技术中，将酶与抗体或抗原结合，并通过加入底物使其产生可检测的信号。
例如，在ELISA中常使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。
二、Elisa的优点2.1 高灵敏度Elisa具有高灵敏度，可以检测到非常低浓度的抗原或抗体。
这使得Elisa成为许多疾病的早期诊断工具，例如艾滋病、乙肝和结核病等。
2.2 高特异性Elisa具有高特异性，可以区分不同种类的抗原或抗体。
这使得Elisa 成为一种非常可靠的检测方法，可以避免假阳性或假阴性结果。
2.3 简单易操作Elisa操作简单易学，不需要复杂的仪器和技术。
因此，即使是没有专业实验室背景的人也可以进行该实验，并获得准确可靠的结果。
2.4 快速结果Elisa通常可以在几小时内完成，并且可以同时处理多个样品。
这使得它成为一种快速而高效的检测方法。
三、Elisa的应用领域3.1 生物医学研究在生物医学研究中，Elisa被广泛应用于检测各种生物分子，如蛋白质、激素、细胞因子和药物等。
通过使用不同的抗体或抗原对进行标记，可以定量分析这些生物分子的含量，以及它们在不同疾病状态下的变化。
3.2 临床诊断Elisa被广泛应用于临床诊断中，例如检测传染病、肿瘤标志物、自身免疫性疾病等。
通过检测血液、尿液或其他体液中的特定抗原或抗体，可以帮助医生诊断和治疗各种疾病。
ELISA原理、方法、操作及注意事项解析
双抗原夹心法测抗体
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竞争法检测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去 ，或不易得到足够的纯化抗原时，可 用竞争法检测特异性抗体。
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竞争法测抗体
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竞争法测抗体
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竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可 作夹心法的两个以上的位点，因此 不能用双抗体夹心法进行测定，可 以采用竞争法模式。小分子激素 、 药物等ELISA测定多用此法。
（1） 标本 可用作ELISA测定的标本十分 广泛，大部分ELISA检测均以血清 为标本。血清标本按常规方法采集， 应注意避免溶血，红细胞溶解时会 释放出具有过氧化物酶活性的物质， 以HRP为标记的ELISA测定中， 溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体 中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如 在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA中可使本底加深。 一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃， 超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白 质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气 泡，可上下颠倒混和 ，不要在混匀器上强烈振荡。 混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再 检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血 清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存 血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐 剂。
ABS-ELISA法
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3. ELISA的操作
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制 血清 （定量测定中）； （5）标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
ELISA包被指南
ELISA包被指南如果做ELISA完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液。
1、免疫吸附剂已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2~8℃）干燥的条件下一般可保存6个月。
有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。
以下简述固相载体和包被过程。
1.1固相载体固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。
可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。
聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。
聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。
ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。
以微量滴定板最为常用，专用于EILSA 的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。
为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。
ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。
现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。
聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。
聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。
常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。
ELISA试验中所用物品及试剂详解
ELISA试验中所用物品及试剂详解在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。
前文（2.2）已述，ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物等。
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5）酶联物（结合物）及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液。
3.1免疫吸附剂已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2~8℃）干燥的条件下一般可保存6个月以上。
有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。
以下简述固相载体和包被过程。
3.1.1固相载体固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。
可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。
聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。
聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。
ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。
以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。
为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。
ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。
现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。
聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。
elisa底物显色原理
elisa底物显色原理
Elisa（酶联免疫吸附法）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和定量分析目标物质，如蛋白质、抗体或其他生物分子的存在和浓度。
Elisa的底物显色原理是基于酶反应产生可观
察的颜色变化。
Elisa实验通常包括以下步骤：涂布、固定、阻化、标记、洗涤、显色和读取。
在涂布步骤中，目标物质被吸附到微孔板表面。
在固定步骤中，一些化学药剂被添加以固定目标物质。
在阻化步骤中，孔洞被加入一些对非特异性中和抗体的溶液，以减少非特异性反应。
在标记步骤中，标记物质通常是酶与次级抗体结合。
在洗涤步骤中，通过洗涤孔洞，清除未结合的物质。
在显色步骤中，添加显色底物，而所示的颜色取决于酶的类型。
最后，在读取步骤中，使用光谱计或Elisa阅读器测量反应物
质的吸光度。
底物显色原理是基于酶反应中产生的彩色产物。
常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
这些酶会催
化底物的反应，产生可见的颜色变化。
例如，HRP通常使用TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二胺）作为底物，会在酶反应中转
变为蓝色产物。
在加入停止液之后，产生的酸性条件会使颜色变成黄色。
而AP则通常使用BCIP（5-溴化-4-氯-3-吲哚磷酸盐）和NBT（硝基蓝。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
竞争法
此法可用于小分子抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。被 结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如 果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就 减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点 在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；小分子 激素、药物等ELISA测定多用此法。
掌握免疫标记技术的基本原理。 掌握三大免疫标记技术的工作原理及主要实验类型的
原理和方法。 熟悉ELISA试验的实验设计原理。 了解免疫标记技术的应用与发展。
酶免疫测定类型
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定 液相酶免疫测定
酶联免疫吸附试验
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫 测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。
HRP催化过氧化物的氧化反应。
供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波 长为492nm
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后， 由蓝色呈黄色，最适吸收波长为450nm .TMB性质较稳定，可 配成溶液试剂，只需与H2O2溶液进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需 稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝 标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原 的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
捕获法 测IgM抗体
简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤
简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析样本中的特定抗原或抗体。
ELISA的原理是利用抗原与抗体的特异性结合来检测和测量样本中的目标物质。
ELISA通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等几种类型，但它们的基本原理相似。
一般来说，ELISA的基本步骤包括以下几个方面：1. 涂层：将特异性抗体固定在试验板的表面上，通常是通过将抗体溶液加入试验板孔中，然后在适当条件下进行孵育。
固定在试验板上的抗体将被用于捕获待检测的抗原或抗体。
2. 绑定：将待检测的样本加入试验板中，样本中的抗原或抗体与固定在试验板上的抗体发生特异性结合。
样本中的目标物质与固定在试验板上的抗体形成抗原-抗体复合物。
3. 洗涤：洗涤试验板以去除未结合的样品成分。
这一步骤的目的是去除非特异性结合的物质，以减少背景干扰。
4. 检测：加入辅助抗体(常为酶标记的抗体)，该抗体能够与已结合在试验板上的抗原-抗体复合物发生特异性结合。
这些酶标记的抗体可以是与抗体结合的酶，如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)。
然后，添加适当的底物使酶产生可检测的信号。
5. 信号检测：通过所使用酶催化的底物的反应产生的颜色或荧光等信号，可以对样品中目标物质的含量进行定量测量。
这一步骤可以使用吸光度计或荧光分析仪进行信号的测量和记录。
ELISA具有高灵敏度和特异性，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域，用于检测病原体、抗体、激素、药物等物质的存在和浓度。
它不仅可以用于疾病的诊断和监测，还可以用于药物筛选、生物分子的定量分析和研究等。
几种常用生物活性测试方法简介
通过使用供体和受体荧光团标记，
TR-FRET 检测将时间分辨 (TR) 和 荧光共振能量转移 (FRET) 原理的 优势结合到了一起。
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET)
镧 系 元 素 （ 铕 Eu 和 铽 Tb ） 半 衰 期 长 (us-ms) ， 将 Eu 纳入立体笼中， 形成稳固复合体， 笼收集光将能量 转移到Eu上。
(如酶活力（Kcat）、酶促反应米氏常数(Km)) 。
可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、 酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋 白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞 相互作用等方面。
15~40℃
2~80℃
溶剂
非强有机溶剂
无限制
耗材
芯片
试剂
药物筛选
适用
不适用
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) FRET原理
传统FRET技术容易受样品组分(缓冲液，蛋白， 化学物质及细胞裂解产物等)背景荧光信号的 影响。
时间分辨通过去除寿命较短的背景，分辨目的 荧光。
先将化合物用dmso溶解成10mm储存液并用dmso3倍梯度稀释成10个浓度梯度成1000化合物系列浓度储存液再转移至化合物转移cellcountingkit8cck8bdr4相关化合物抗癌细胞活性体外筛选方法检测方法mtt法xtt法wst1法cck8法甲臢产物的水溶性差需加有机溶剂溶解产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度很高很高检测时间较长较短较短最短检测波长560600nm420480nm420480nm430490nm细胞毒性高细胞形态完全消失很低细胞形态不变很低细胞形态不变很低细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷细胞水平活性测试方法检测细胞增殖毒性测试方法比较sulforhodaminebsrbsrb即磺酰罗丹明bsulforhodamineb是一种粉红色阴离子染料易溶于水在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合
elisa的原理和其应用
Elisa的原理和其应用1. Elisa的原理简介ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay），即酶联免疫吸附测定法，是一种常用于检测特定蛋白质、抗原或抗体的实验方法。
它基于免疫学原理，通过酶标记的抗体或抗原与待测物相互作用，再经过特定的酶促反应，最终通过颜色变化的测量来定量或定性目标物质。
1.1. Elisa的基本步骤ELISA实验通常包括以下几个步骤：1.涂布（Coating）：将待测物（例如抗原）固定在微孔板上的底部。
通常使用高结合力的表面来保证待测物的吸附。
2.阻断（Blocking）：将未被固定的孔位用非特异蛋白质（如牛血清蛋白、鱼胶）进行封闭，以防止非特异结合的干扰。
3.探针结合（Probing）：在固相的抗原或抗体上加入特异性的酶标记抗体或抗原，与待测物发生特异性结合。
4.反应（Reaction）：将孔位中非特异性结合的抗体或抗原洗掉，通过适当的酶促反应体系，如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）或碱性磷酸酶（alkaline phosphatase），产生显色反应。
5.检测（Detection）：通过加入合适的底物，使酶催化反应可见，测量反应产物的吸光度或荧光强度。
1.2. Elisa的特点和优势•高灵敏度：ELISA的灵敏度在ng/mL的量级，可以检测低浓度蛋白质、抗原或抗体。
•高选择性：通过特异性抗体的结合，可以准确检测目标物质。
•高通量：ELISA可以同时检测多个样品，适用于大规模实验。
•简单易行：ELISA实验步骤相对简单，操作方便。
•广泛应用：ELISA广泛应用于医学、生物学、食品安全等领域，用于诊断、监测和研究目标物质。
2. Elisa的应用场景2.1. 医学领域•临床诊断：ELISA在临床诊断中常用于检测病原微生物、肿瘤标志物、激素以及各种抗体和免疫相关的蛋白质。
•药物研发：ELISA用于药物研发中的生物样品分析，例如药物代谢产物的检测和药物浓度监测。
ELISA试验中所用物品及试剂详解
ELISA 试验中所用物品及试剂详解ELISA试验中所用物品及试剂详解在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。
前文(2.2)已述，ELISA中有三个必要的试剂:免疫吸附剂、结合物和酶的底物等。
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:(1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);(2)酶标记的抗原或抗体(结合物);(3)酶的底物;(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)，参考标准品和控制血清(定量测定中);(5)酶联物(结合物)及标本的稀释液;(6)洗涤液;(7)酶反应终止液。
3.1免疫吸附剂已包被抗原或抗体的固相载体在低温(2~8℃)干燥的条件下一般可保存6个月以上。
有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。
以下简述固相载体和包被过程。
3.1.1固相载体固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。
可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。
聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。
聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。
ELISA载体的形状主要有三种:微量滴定板、小珠和小试管。
以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。
为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。
ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。
现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。
聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。
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碱性磷酸酶ELISA方法
实验原理：
1. 在ELISA测定中，碱性磷酸酶的色原底物是对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny-phosate，
pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对硝基酚(pNP)，其在入＝405 nm处有最大
吸收。
2. 由于较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性，所以用TBS体系，不能用
含磷酸根丰富的PBS体系，否则会造成本底偏高。
3. 由于碱性条件下pNP的光吸收增强，并可使碱性磷酸酶失活，因而可使用氢氧化钠作
为终止剂。
试剂：
ELISA溶液体系：
1XTBS 1L体系
H2O 定容至1000ml
Tris-HCl 6.06g 50mM 盐酸调 PH 7.5
NaCl 8.76g 150mM
包被液：
0.1M NaHCO3 (pH9.6)。过滤除菌，4℃贮存。
显色液：
1. 0.1M glycine pH 10.4 + 1mM MgCl2 + 1mM ZnCl2
配方：7.51g glycine + 203 mg MgCl2 + 136 mg ZnCl2 + 980 ml H2O，用浓NaOH溶液调至
pH10.4，补水定容到1L。
2. 1 M diethanolamine（二乙醇胺）pH 9.8+ 0.5mM MgCl2
配方：97 ml of diethanolamine +100 mg MgCl2 + 800 ml H2O，用浓HCl溶液调至pH9.8，
补水定容到1L。
显色液中pNPP终浓度为1mg/ml。
终止液：
配方：3M NaOH。
实验步骤：
1. 包被：用包被液稀释靶分子，4℃过夜或者37℃ 1h。TBS洗3次。
2. 封闭：2%M-TBS 37℃ 1h。TBS洗3次。
3. 结合：将表达菌用TBS重悬，超声后加入到孔中，37℃ 1h。0.5%TBST洗3次。
4. 显色：将显色液加入到孔中，3M NaOH终止（100ul显色液+25ul终止液）
实验结论：
两种显色液显色时间有区别，显色液1显色较慢，适合检测表达量较高或结合活性高的样
本，同时实验平行性较好；显色液2显色较快，灵敏度较高。
Troubleshooting
If the background is too high:
1. Use a blocking step prior to the application of the primary antibody. Normal Serum (5%
v/v) from the same species as the host of the second antibody generally produces the
best results.
2. Additional blocking agents for an ELISA are:
a. 0.05% TWEENÒ 20 in 50mM TBS, pH 8.0.
b. 1% BSA containing 0.05% TWEEN 20 in 50mM TBS, pH 8.0.
c. 3% nonfat-dried milk in 0.01 M TBS. Do not use milk as a blocking agent when using
avidin-biotin systems.
3. Use 0.05% TWEEN 20 in all washing and antibody diluent buffers.
4. Run control wells without the primary antibody to check for non-specific reactivity of the
secondary antibody/alkaline phosphatase conjugate.
5. Adjust the titer of the primary antibody and/or the alkaline phosphatase conjugate to
determine the optimal working dilutions.
If no color develops or color is too faint:
1. Adjust the concentration of the primary antibody.
2. Adjust the concentration of the secondary antibody/alkaline phosphatase conjugate.
3. Determine if the enzyme conjugate is active by mixing a small sample of substrate and
conjugate together in a test tube.
4. Increase the substrate incubation time or temperature.
5. Adjust the concentration of the coating antigen.
6. Consider using an amplification system such as avidin-biotin