矢车菊素-3-O-葡萄糖苷进入巨噬细胞的荧光检测

１９８　２ｏ１６，ＶｏＬ３７，Ｎｏ．０９　良晶科学　※营养卫生　矢车菊素．３．　葡萄糖苷进入巨噬细胞的荧光检测　张英慧　，王丙云　，黄剑波　，计慧琴　，马艳玲　，钟希琼　，董华强　（１．佛山科学技术学院北院食品安全系，广东南海　５２８２３１；２．佛山科学技术学院北院动物医学系，广东南海　５２８２３１）　

摘要：利用荧光技术探索矢车菊素．３．Ｏ　葡萄糖苷（ｃｙａｎｉｄｉｎ　３－Ｏ—ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ，Ｃ３Ｇ）在体外培养的巨噬细胞中的分　布。首先采用荧光分光光度法扫描Ｃ３Ｇ的特异激发波长和发射波长，再利用激光共聚焦技术探讨Ｃ３Ｇ进入小鼠和　人巨噬细胞的过程以及Ｃ３Ｇ在细胞中的定位，并分析Ｃ３Ｇ孵育时间对细胞内荧光强度变化的影响。结果表明：在　４８８　ａｍ和５２０　ｎｍ的激发波长下，Ｃ３Ｇ孵育１５　ｍｉｎ的细胞质内开始呈现绿色和红色荧光，并且随着孵育时间的变化，　细胞内荧光强度逐渐增强，其中孵育６０　ｍｉｎ可观察到荧光布满细胞核，其荧光强度是孵育前的６．４５倍。研究表明采　用特异波长的激光共聚焦断层扫描技术可示踪到花色苷在干预细胞内的分布，结果显示花色苷Ｃ３Ｇ可快速穿过巨噬　细胞的细胞膜和核膜，直达细胞核。　关键词：矢车菊素一３一Ｏ－葡萄糖苷；巨噬细胞；激光共聚焦显微技术；荧光分光光度法　

Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｔｒｙ　ｏｆ　Ｃｙａｎｉｄｉｎ－－３－－Ｏ－－Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ　ｉｎｔｏ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｙｉｎｇｈｕｉ　，ＷＡＮＧ　Ｂｉｎｇｙｕｎ　，ＨＵＡＮＧ　Ｊｉａｎｂｏ　，ＪＩ　Ｈｕｉｑｉｎ　，ＭＡ　Ｙａｎｌｉｎｇ　，ＺＨＯＮＧ　Ｘｉｑｉｏｎｇ。，ＤＯＮＧ　Ｈｕａｑｉａｎｇ　

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＦｏｏｄ　Ｓａｆｅｔｙ，Ｆｏｓｈａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｃａｍｐｕｓ），Ｎａｎｈａｉ　５２８２３１，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｏｓｈａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｃａｍｐｕｓ），Ｎａｎｈａｉ　５２８２３　１，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙａｎｉｄｉｎ－３一Ｏ—ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（Ｃ３Ｇ）ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍｏｕｓｅ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｆｉｒｓｔ，ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ａｎｄ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　Ｃ３Ｇ　ｗｅｒｅ　ｓｃａｎｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ．Ｔｈｅｎ，ａ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｌａｓｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｗａｓ　ｕｔｉｌｉｚｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｎｔｒｙ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ｃ３Ｇ　ｉｎｔｏ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍｏｕｓｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ＴＨＰ一１　ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ　ｔｏ　ｔｒａｃｅ　ｔｈｅ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ３Ｇ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　ｒｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ａｆｔｅｒ　１５　ｍｉｎ　Ｃ３Ｇ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｉｇｈｔ　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ　ａｔ　４８８　ｎｎｌ　ａｎｄ　５２０　ｎｍ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ｔｈｅ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ．Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉａｌ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｐｐｅａｒｅｄ　ｉｎ　ｎｕｃｌｅｉ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｃ３Ｇ　ｆｏｒ　６０　ｍｉｎ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｗａｓ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｂｙ　６．４５　ｆｏｌｄｓ　ｗｈｅｎ　Ｃ３Ｇ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｕｐ　ｔｏ　６０　ｍｉｎ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ３Ｇ　ｉｎ　ｃｅｌｌｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｔｒａｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌａｓｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ａｓｓａｙ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ　ｔｈａｔ　Ｃ３Ｇ　ｃｏｕｌｄ　ｐａｓｓ　ｒａｐｉｄｌｙ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ａｎｄ　ｅｎｔｅｒｅｄ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅｕｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｙａｎｉｄｉｎ－·３·－Ｏ－·ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ；ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ；ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｌａｓｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ　ＤＯＩ：１０．７５０６／ｓｐｋｘ１００２－６６３０—２０１６０９０３７　中图分类号：ＴＳ２０１．４　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—６６３０（２０１６）０９．０１９８—０５　引文格式：　张英慧，王丙云，黄剑波，等．矢车菊素一３一Ｏ一葡萄糖苷进入巨噬细胞的荧光检测【Ｊ】．食品科学，２０１６，３７（９）：１９８—２０２．　ＤＯＩ：１０．７５０６／ｓｐｋｘ１００２—６６３０—２０１６０９０３７．ｈｔｔｐ：＃ｗｗｗ．ｓｐｋｘ．ｎｅｔ．ｃｎ　ＺＨＡＮＧ　Ｙｉｎｇｈｕｉ，ＷＡＮＧ　Ｂｉｎｇｙｕｎ，ＨＵＡＮＧ　Ｊｉａｎｂｏ，ｅｔ　ａ１．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｔｒｙ　ｏｆ　ｃｙａｎｉｄｉｎ一３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ　ｉｎｔｏ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６，３７（９）：１９８—２０２．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）ＤＯＩ：１０．７５０６／ｓｐｋｘ１００２—６６３０—　２０１６０９０３７．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｐｋｘ．ｎｅｔ．ｃｎ　

矢车菊素。３．Ｏ．葡萄糖苷（ｃｙａｎｉｄｉｎ　３一Ｏ—ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ，　Ｃ３Ｇ）类属于植物中的花青素类，为呈色物质，其天然提　取物粉末为紫红色，是自然界分布最广的花色苷。尽管大　

量的研究证实Ｃ３Ｇ具有抗氧化　“、降血脂　“、抗肿瘤　、抗　

收稿日期：２０１５－０７－２４　基金项目：国家自然科学基金项目面上项目（３１０７１５３７）；广东省科技计划项目（２０１１Ａ０３０１０００１８）；　

佛山市科技创新专项资金项目（２０１４ＧＡ０００４２５）　作者简介：张英慧（１９７４一），女，副教授，博士，研究方向为食品营养与安全。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇ＿ｙｉｎｇ—ｈｕｉ＠１６３·ｃｏｒｎ　※营养卫生　良晶科学　２ｏ１６，Ｖｏ１．３７，Ｎｏ．０９　１９９　炎症口　、抑制血小板凝集　、预防糖尿病　、减肥嘲、保护　视力　和保护神经元细胞Ｉ酗等诸多生理活性，但其在机体　细胞中的存在部位和结合位点目前尚无定论。　高效液相色谱是目前普遍应用的检测Ｃ３Ｇ的方法，　血液中Ｃ３Ｇ的含量可采用高效液相色谱的方法检测　，　但是这种方法应用于体外培养细胞中Ｃ３Ｇ的检测有一定　的难度，由于细胞培养的数量有限，干预后进入细胞　内的Ｃ３Ｇ有限，Ｃ３Ｇ的丰度往往低于仪器的灵敏度。另　外，高效液相色谱也很难检测到Ｃ３Ｇ在细胞中的定位。　再加上细胞膜、细胞浆、细胞核的分离过程必然增加了　Ｃ３Ｇ的损失。Ａｇａｔｉ等ｎ　报道花青素为植物细胞中的荧光物　质，具有特定的吸收波长和发射波长，例如葡萄中花青　素的特异吸收波长为５４０栅，最大发射波长为６８５　ｎｎｌ，并　利用这一特性建立了植物活体中该类色素的检测方法；　Ｌｉｎ　Ｙａｋａｎｇ　利用包括花青素在内的类黄酮物质的荧光　研究了植物化学物在玉米细胞中的合成与转运。　激光共聚焦显微镜作为近年来发展起来的大型生　物学分析仪器，它借助荧光标记方法，采用激光作为光　源，使激光经过照明针孔后形成点光源，对焦平面每一　点进行扫描，并在共焦针孔处成像，大大提高了图像分　辨率和检测灵敏度，具有活细胞动态监测、断层扫描及　三维图像重建等功能，可对所观察细胞内荧光标记的物　质进行定量、定性、定位和时空监测［１　¨】。　本实验综合借鉴以上方法，首先扫描了Ｃ３Ｇ特异的　荧光波长，并根据特征波长进行激光共聚焦断层扫描，　尝试观察Ｃ３Ｇ是否可以进入小鼠和人的巨噬细胞中。　１　材料与方法　１．１　材料、培养基与试剂　ｌ５只ＳＰＦ级Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性小鼠（动物合格证号：　ＳＣＸＫ（粤）２０１３．０００２），体质量为１８￣２２　ｇ，由广东省　医学实验动物中心提供；ＴＨＰ．１细胞株　美国培养物典　藏中心（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）。　ＲＰＭＩ１６４０培养基　美国Ｇｉｂｃｏ公司。　Ｃ３Ｇ　挪威Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ＡＳ公司；豆　蔻酰佛波醇乙酯（ｐｈｏｒｂｏ１．１２．ｍｙｒｉｓｔａｔｅ．１３．ａｃｅｔａｔｅ，　ＰＭＡ）、台盼蓝、多聚甲醛　美国Ｓｉｇｍａ公司；抗生　素（青霉素和链霉素）　美［￣Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２～７．４磷酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）　福州迈新生物技术开发有限公司；胎牛血清（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）　美国Ｇｉｂｃｏ公司；细胞培养板　美国　Ｃｏｍｉｎｇ公司；玻璃底细胞培养皿　美国ＭａｔＴｅｋ公司。　１．２　仪器与设备　ＣＯ２培养箱　美国Ｈａｒａｅｕｓ公司；荧光分光光度计　美国Ｖａｒｉａｎ公司；倒置显微镜　重庆光学仪器厂；冷冻　离心机　德ｍＥｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；ＦＶ５００．ＩＸ８１　ＯＬＹＭＰＵＳ　激光共聚焦显微镜　日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司。　１＿３　方法　１．３．１　Ｃ３Ｇ荧光波长的扫描　将Ｃ３Ｇ溶解￣ＵＰＢＳ中，配成终浓度为Ｉ　ｍｍｏｌ／Ｌ的溶　液，利用荧光分光光度计进行发射波长和激发波长的扫　描，确定Ｃ３Ｇ特异的激发波长和发射波长。对照组为ＰＢＳ　溶液。　１．３．２　激光共聚焦显微镜扫描Ｃ３Ｇ在巨噬细胞中的分布　１．３．２．１　检测Ｃ３Ｇ在小鼠腹腔巨噬细胞中的分布　１）小鼠腹腔注射１　ｍＬ无菌液体石蜡，３　ｄ后收集腹　部巨噬细胞。具体方法为：小鼠腹部消毒，沿中线注入　３～４　ｍＬ冰中预冷的无菌ＰＢＳ，轻轻按摩腹部５　ｍｉｎ。无菌　剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样体积的预冷的　ＰＢＳ冲洗腹腔２～３次，合并渗出液于离心管中，４℃、　８００　ｒ／ｍｉｎ条件下离　６，５　ｍｉｎ，去上清液。用预冷的ＲＰＭＩ一１６４０　培养液洗涤细胞２～３次，每次４℃、８００　ｒ／ｍｉｎ离心　５　ｍｉｎ，去上清液，用预冷的适量ＲＰＭＩ．１６４０培养液悬浮　细胞，台盼蓝染色计数，调整细胞浓度为１．０Ｘ　１０　／ｍＬ，　加于含盖玻片的６孔培养板中，于玻片上爬壁４　ｈ。　２）弃去未贴壁细胞，加含５０　ｐｍｏｌ／Ｌ　Ｃ３Ｇ的体积分　数１０％ＦＢＳ．ＲＰＭＩ１６４０完全培养基培养０～１　ｈ。分别取　０、１５、３０、４５、６０　ｍｉｎ各时段进行体积分数４％多聚甲　醛固定５　ｍｉｎ。每次实验设３个重复孔，独立重复３次。　３）以ＦＶ５００．ＩＸ８１　ＯＬＹＭＰＵＳ激光共聚焦显微镜　６００倍水镜断层扫描固定后的细胞，激发波长分别设置　为４８８　ａｍ和５２０　ｎｍ。操作设置为：ＰｍＴ１　８８１，Ｇａｉｎ　２．４，　Ｃ．Ａ　７１５，ＭＡｒ２　２０．５％；ＰｍＴ２　７９１，Ｇａｉｎ　２．０，ｏｆｆｓｅｔ　５％，　Ｃ．Ａ　５８０　ｎｍ，Ｈｅ　５０．０％。图像生成采用ＦｌｕｏＶｉｅｗ软件。　１－３．２．２　检测Ｃ３Ｇ在人巨噬细胞株ＴＨＰ．１中的分布　１）将人ＴＨＰ．１单核／巨噬细胞以２．０×１０　／孑Ｌ接种于６　孔玻璃底细胞培养皿，以含１００　ｎｇ／ｍＬ　ＰＭＡ、体积分数　１０％ＦＢＳ、２　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ一谷氨酰胺、１００　Ｕ／ｍＬ青霉素和　１００　ｐｇ／ｍＬ链霉素的ＲＰＭＩ　１６４０在体积分数５％ＣＯ：的培养　箱中３７℃条件下诱导分化贴壁４８　ｈ。　２）ＰＢＳ洗３次，加含５０　ｇｍｏｌ／Ｌ　Ｃ３Ｇ的１０％ＦＢＳ－　ＲＰＭ１１６４０完全培养基培养０～１　ｈ。每次实验设３个重复　孔，独立重复３次。　３）以ＦＶ５００．ＩＸ８１　ＯＬＹＭＰＵＳ激光共聚焦显微镜　６００倍水镜断层扫描干预后的细胞，激发波长分别设　置为４８８　ｎｍ￥１５２０　ａｍ。操作设置同１．３．２．１节３），利用　ＦｌｕｏＶｉｅｗ软件合成图像并计算平均荧光强度。　１．４　数据分析　采用ＳＰＳＳ１３．０软件包建立数据库，并进行统计分　析。结果以　±　表示。多组均数进行单因素方差分析，　各组间的两两比较采用Ｔｕｋｅｙ’Ｓ　ｈｏｎｅｓｔｌｙ法，Ｐ＜０．０５为差　异显著。