冷冻干燥制剂的稳定性研究进展

冷冻干燥制剂的稳定性研究进展

武华丽,胡一桥(中国药科大学药剂教研室,江苏南京210009)

摘要:目的介绍冷冻干燥制剂在生产和贮运过程中影响药物稳定性的因素及冻干保护机制的研究进展。方法综述冻干制剂在生产(分装、冷冻、干燥)和储存过程中影响药物稳定的因素;介绍了冻干保护剂的几种保护机制。结果与结论研究冻干制剂稳定性对于生物技术药物制剂的开发有重要意义。

关键词:冷冻干燥;稳定性;蛋白质;玻璃化

中图分类号:R94文献标识码:A文章编号:1001-2494(2001)07-0436-03

随着生物技术的高速发展,多肽蛋白质类药物不断涌现,可应用于临床的多肽、蛋白酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等成为开发重点,目前已有35种重要治疗药物上市。生物技术药物的基本剂型是冻干剂。冷冻干燥技术早期主要用于生物材料的保存,其原理是利用冷冻的溶液在低温低压条件下,从冻结状态不经过液态直接升华除去水分完成干燥。冷冻干燥技术可以使药物保持原有的理化性质和生理活性,且有效成分损失极少。此外,冻干制剂特有的疏松多孔结构,可以使药物易于重新复水而恢复活性,而且冻干制剂含水量低,易长期稳定保存。冻干制剂的低共熔态多孔结构在口腔内可迅速溶化释出药物,因此该技术现在也用于口服速溶制剂[1]。尽管与液体制剂相比冻干制剂稳定,但是冷冻干燥是一个非常复杂的过程,在预冷第一、第二干燥阶段和储存过程中,药物的结构可能受其中的物理化学变化影响而发生变化,特别是蛋白质多肽类药物的二、三级结构易受破坏,失去活性而影响药效。本文对近年来国内外学者对冻干过程中药物稳定性问题的研究进展进行了综述。1水分含量

严格控制水分含量是保证冻干制剂质量的关键。水分含量对冻干制剂质量的一个重要指标)))玻璃转化温度(Tg)有影响,即药品的水分含量越低,其Tg越高,药品越能长期稳定地储存。通常冻干制剂的水分含量要求控制在1% ~3%之间,以保持稳定。在水分含量较低时,药物的溶剂降解反应呈零级动力学模式[2]。用动力学方程计算可以选择控制适宜的水分含量,既能满足药品在保存期稳定的要求,又避免在生产中因过度干燥而引起能源浪费,还可以为选择成品保存允许的环境湿度提供依据。除了必要的环境条件,包装材料的选择也很关键。有研究表明氯丁基橡胶塞对水分的透过率比溴丁基橡胶塞高[3]。

2辅料的影响

在储存过程中,偶然发生的辅料结晶现象极不利于冻干制品的长期保存。在冻干制剂中,无定型状态的甘露醇可以处于亚稳态的玻璃态,其Tg约为45e。如果保存不当,样品温度达到此点,甘露醇开始由玻璃态转变到晶态,其无水结晶的形成使基质中水分分布发生变化,水分从无定型状态的甘露醇中转移到剩余的基质中,导致基质的Tg下降,引起冻干制品的团块萎缩现象[4],影响产品外观;同时,由于药物周围环境中水分含量增加,药物稳定性也受到严重影响。

有人研究了甘露醇和乳糖作为赋形剂时,对琥钠甲泼尼龙冻干制剂稳定性的影响。其冻干固体保存在40e时,药物会部分水解,研究发现含甘露醇组的药物水解速率明显高于含乳糖组。用热分析和X衍射法分析发现,甘露醇在冻干过程和贮藏期间均有结晶现象,使冻干固体中的水分分布改变,导致药物所处微环境中的水分含量增加,无定型相基质的Tg下降,且药物降解反应速率也因此而加快。乳糖在这两个过程中物理状态不变,基质中的水分分布不会发生变化,而且乳糖在无定型状态时有吸水性,使它在一定程度上起到内部干燥剂的作用[5]。这一实验结果与Zografi的观点一致,水分对无定型药物稳定性的影响不仅与水分含量有关,而且与这些水分的分布有关[6]。因此,含有这类结晶辅料的制剂干燥过程中应有升温后缓慢降温过程,升高温度使结晶完全或通过其它成分的加入帮助稳定。

辅料的结晶性质可通过加入某些辅助剂而改变。例如,在保证磷酸钾与甘露醇的比例较高时,加入磷酸钾可以使甘露醇保持无定型状态[7]。表面活性剂聚山梨酯80对冷冻干燥过程中甘露醇的结晶性质也有影响,甘露醇的结晶度随聚山梨酯80的用量增加而增加[8]。制剂中还有一种可能影响辅料结晶或保持无定型状态的成分就是蛋白质。最近研究发现牛生长激素可抑制冷冻干燥制剂中蔗糖的结晶[9]。因此,为提高冻干制剂中药物稳定性,可选择保持无定型状态的辅料。如,麦芽糊精的冻干制品为无定型物,在合适的浓度下麦芽糊精作为冻干保护剂可以比蔗糖和麦芽糖更好[10]。

辅料中的杂质也会对冻干制剂的稳定性产生影响。如,甘露醇中的还原糖杂质有氧化作用,产生的席夫氏碱加合物可以使环状七肽发生互变异构和水解反应[11]。又有PEG通过自由基反应产生的降解产物可以使溶菌酶的稳定性变差[12]。

3工艺条件的影响

3.1分装阶段在冷冻干燥以前,药物须经过配液滤过灌装的工序,在这段时间里,药物处于水溶液中这一相对不稳定的状态,即使是相对较短时间,也可能发生降解反应。对

#

436

#Chin Pharm J,2001July,Vol.36No.7中国药学杂志2001年7月第36卷第7期

于一些水溶性差的药物常通过调节适当pH值来增加药物溶解度,但在这样的pH值环境,药物通常不稳定。使用有机复合溶剂增加药物溶解度,可以不改变溶液p H值,使药物相对稳定。Pharmacia&Upjoihn公司成功研制的前列腺素E1 (prostaglandin E-1)就是在20%的特丁醇(ter-t bu tyl alcohol)TB A 和水复合溶媒体系冻干的。使用这种复合溶媒体系不仅可缩短冻干时间,还可减少产品的污染机会,成品的水溶性也很好。但是此法还存在有机溶剂残留量问题,Sakchai发现TBA残留量与其初始浓度无关,减慢冷冻速度和提高二次干燥的温度有助于降低有机溶剂残留量[13]。

3.2冷冻在冷冻过程中,温度低于热力学冰点时,随着纯冰晶从溶液中析出,溶液中的组分浓度开始增大,饱和后,各组分就可能析出晶体或无定型物,或者依然保持过饱和状态,当溶液浓度达到最大冻结浓缩状态时,玻璃态转化发生,此时的温度即为玻璃转化温度,在冰晶的间隙中就形成了一个玻璃态的基质。在此过程中,冷冻浓集使制剂中的缓冲盐浓度迅速增加,对药物特别是蛋白质肽类生物制品的结构影响很大。如氯化钠等渗溶液的浓度可从冷冻前的100mmol# L-1上升至3.6mol#L[14]。除了高浓度盐溶液,盐析引起的溶液p H值变化也会影响对p H值敏感药物的稳定性,例如磷酸盐缓冲液溶液中磷酸氢二钠最低共熔点为-2e,在冷冻过程中先从溶液中析出,使溶液pH值下降至3.6[15],酸性溶液中不稳定的药物就可能发生降解。加入适当的辅料可以阻止盐的结晶,如,浓度为15mg#mL-1的一些糖类(葡萄糖,乳糖,蔗糖等)就可以阻止100mmol#L-1NaCl溶液的结晶。对于聚合物如相对分子质量(M r)为95~115的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG),M r为11000的葡聚糖Dextran和M r 为40000聚乙稀吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)就需要更高一些的浓度(20~30mg#mL-1)才能达到同样的抑晶效果[16]。

在冷冻过程中,表面诱导破坏和低温对蛋白质肽类稳定性也有影响。表面诱导破坏主要与大量冰水界面的形成,或小瓶壁与蛋白质的相互作用有关[17],添加非离子表面活性剂可以消除这种破坏作用。低温对蛋白质结构的影响已有文献报道[18~19]。甘油或多羟基化合物是常用的冷冻保护剂,可以减轻低温对蛋白质结构的破坏作用。Timasheff提出一种优先水化作用机制,认为冷冻保护剂在蛋白质表面形成的一种负吸附状态,使其能够排除在蛋白质表面而被优先水化,从而减轻溶剂对蛋白质结构的诱导破坏作用。因此能够高度排除在蛋白质表面的聚合物辅料常用作蛋白质的冷冻保护剂。如PEG就是很好的冻干保护剂[20]。类似作用的冻干保护剂还有糖类,多羟基化合物,氨基酸和盐析的无机盐[21]。

3.3干燥干燥过程中,环境条件对蛋白质结构的稳定非常不利。近年来,玻璃化及玻璃化转变理论逐渐应用于干燥过程中药品稳定性的研究。玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种状态。玻璃化转变是在一定温度范围内发生的二级相变。玻璃化药物与晶态药物不同,它具有液体性质,且黏度极大,流动性差。保持玻璃化的保护剂能在冷冻干燥过程中防止药品的损伤和变性[22]。如,保持玻璃化的甘露醇在冷冻干燥过程中能够保护蛋白质的活性,而结晶的甘露醇则对蛋白质不能起保护作用。有人认为,这种保护作用是通过将蛋白质固定在玻璃化固体中实现的[14],玻璃化固体中很高的黏度可以完全固定蛋白质,阻碍其转变运动和分散过程,以防止凝聚、解开折叠和一些化学降解反应的发生。

干燥过程中,随着水分的离开,药物中的氢键就直接暴露在周围环境中,容易造成蛋白质肽类药物及脂质体的损伤变性和凝聚,因此干燥保护剂除了能够形成玻璃化,还要能与药物表面的极性基团形成氢键。这类保护剂主要有糖类及多羟基化合物[23]。

在干燥过程中,无论是玻璃态固定机制还是水分取代假说的保护机制都需要辅料分子与蛋白质分子保持紧密接触,这样的要求与冷冻过程所要求的恰好相反,冷冻保护剂需要完全从蛋白质表面排除。因此可预料,一个好的冷冻保护剂,如PEG,在干燥过程中可能会起不到保护作用。如1% PEG可以完全保护乳酸脱氢酶在冷冻熔融过程中不受破坏,但对于干燥引起的蛋白质失活却没有作用[24]。而一些相对分子质量低的辅料,如在冷冻和干燥过程中,二糖典型地被排除在蛋白质分子表面,却可有效的保护蛋白质在整个过程中都不受破坏,Randolph认为产生这种现象有两种解释:¹在冷冻过程中达到同样保护作用所需要的浓度水平时,二糖在蛋白质与水界面的浓度将比聚合物浓度高。º低分子量辅料与高分子量辅料相比会呈现更快的离散动力学性质,那么冷冻时被排除的二糖分子在干燥过程中仍然可以通过足够的重定向作用与蛋白质产生表面作用[14]。

冻干过程升温干燥后缓慢降温和不缓慢降温的不同工艺也对产品质量产生较大影响,尤其是对有结晶性质的药物,如萘夫西林两种工艺所得到的产品,水分吸附等温曲线图表现出不同的亲水性[25]。

4玻璃转化温度

冻干制剂在储存过程中,当环境温度超过冻干制剂的Tg 时,药品的玻璃化状态被破坏,制剂外观会出现塌陷、表面萎缩、结块、变硬、变色等问题,同时制剂的多孔结构被破坏,吸水性变差。Tg是冻干制剂特性参数中的一个重要参数,无论是生产过程中第一、第二干燥阶段,还是储存中制剂的温度都不能超过其Tg。因此,选用Tg高的辅料对保持药品玻璃化和提高药品稳定性有利。研究发现,二糖作为蛋白质的冷冻保护剂时,因为形成的固体Tg太低而无法保证蛋白质贮藏稳定性;高分子材料糊精作保护剂时,冻干后产品的Tg较高,但不能保证天然蛋白质结构不变。可用二糖与糊精的混合物作为蛋白质的冻干保护剂,优化处方可达到比单独使用更佳的效果[26]。

5小结

冷冻干燥制剂因其独特的生产工艺条件,为许多药物特别是对温度敏感的大分子药物和水溶液中不稳定的药物提供了稳定的制备方法,发展十分迅速。但冷冻干燥是一个伴

#

437

#

中国药学杂志2001年7月第36卷第7期Chin Pharm J,2001July,Vol.36No.7