汇总资料cho细胞蛋白表达系统
大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。
CHO 细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。容易发生基因突变，也较易进行基因转染，是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase）营养缺陷型突变细胞株（CHO/dhfr-）、转染谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）基因的GS-CHO 细胞。
二氢叶酸还原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二
氢叶酸还原成四氢叶酸。对于dhfr 突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养基上生长，但若在培养基中加入次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸苷
（thymidine），则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。利用dhfr 基因进行筛选时，首先将重组DNA 分子导入dhfr- 表型的受体细胞，然后撤除原培养基中的的次黄嘌呤和胸苷，即可获得dhfr+并能表达外源基因的克隆细胞系。因此在挑选表达外源基因的阳性克隆细胞时需选用不含次黄嘌呤和胸苷的培养基。另外，氨甲喋呤（MTX）选择压力可
使CHO/dhfr- 细胞的外源基因的拷贝数扩增并得到较高水平的表达。
CHO-GS 细胞是用含单抗蛋白等的目的基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因标记的表达载体，转染宿主细胞CHO，再通过L-氨基亚砜蛋氨酸(methioninesulphoximine，MSX)等化合物选择加压促使GS 基因和目的蛋白基因扩增，筛选获得重组细胞株，可在不含谷氨酰胺培养基中生长、增殖，可避免或减少细胞代谢过程中谷氨酰胺降解积累的氨对细胞的损伤、抑制作用。
近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝 试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO 细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。
与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：
(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；
(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；
(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
缺点：
CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。
Cho细胞的培养
CHO 细胞血清培养
传统上CHO 细胞的培养都是在DMEM／F12 基础培养基中添
加5~10 的小牛血清(用于重组蛋白)或胎牛血清(用于杂交瘤生产)单抗来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合
成DNA，对细胞的增殖有很大的作用。实验证明，血清在细胞的体外培养中提供了细胞增殖所必需的生长因子。但哺乳动物的血清价格昂贵，成本高不适于今天的大规模工业化生产。而且哺乳动物血清作为补加物，存在许多问题，首先血清的来源存在问题，血清来源于特定的地区，因而如果该地区发生灾荒或牛群中流行疾病，都可导致血清失去供应源。血清批量之间的差异大，重复性差，由于血清来源于动物，动物个体或群体的差异及时间上的差异都能导致每个批号的血清不完全一样。
从重组蛋白生产的角度来看，出于Q 和Qc的要求，每换一个批号的血清，都包含大量的验证工作，这就给生产带来很大的麻烦。另外血清来源于动物因此经常被污染，污染的血清往往导致细胞生长缓慢，蛋白产量下降，甚至导致细胞死亡。目前购自各大公司的血清虽能消灭细菌和所有支原体，但很难保证除去所有的病毒污染。血清的成分十分复杂，经研究表明，血清除含有促进生长的活性成分外，还含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响细胞功能的表达
血清复杂的成分也给基因工程表达产物的下游工作带来很大的困难，因此成分明确，价格经济的无血清培养基成为CHO 细胞培养的一种必然需求。
CHO 细胞的无血清培养基
由于血清的成分不清而且十分复杂，具有多种促进细胞生长和增殖的因子，因此要找到血清替代物是相当困难的。目前已经发现一些物质单独或一起使用可以替代血清。这些物质分别是微量元素、生长因子、激素、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂。微量元素是细胞代谢所必需的，是无血清培养基的主要添加物之一，铁、锌、硒等都是不可缺少的，有些资料证明还需要铜、锰、钼、钒等元素，这些元素在血清培养中由血清提供，在无血清培养中需要补加。促生长因子是无血清培养基的主要补
加物之一。
从血清、各种组织和生物成分中用生物工程的方法，制取了各种促细胞生长物，如表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板生长因子(PDGF)、生长调节素(SM)等。现已证明很多激素具有促进细胞生长的作用，胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，无血清培养基缺乏对细胞的保护，血清培养残余的胰蛋白酶对血清的损伤十分严重，因而无血清培养基必须添加酶抑制剂。另外，脂类是细胞膜的主要成分，添加脂类可以促进细胞增殖。
无血清培养的方法
细胞的无血清驯化过程如下：
取处于对数生长期的贴壁CHO细胞，活率大于95%，开始进行无血清驯化。
细胞驯化可以在方瓶（T-flask）、摇瓶（shake-flask）或转瓶（spinner-bottle）中进行。
将无血清细胞培养基和含血清培养基的按1：1（V/V）的比例进行混合，接种密度为2－4×105cells/ml的细胞，在37℃、5％CO2培养箱进行培养。
根据细胞生长和活率情况，在降血清的每一阶段可稳定传代1－3代，接种密度维持在2- 4×105cells/ml。
逐步提高无血清细胞培养基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞接种密度仍维持为2- 4×105cells/ml。
直至混合液中的血清浓度降低至0.1-0.2%，每一代的细胞活率大于90％后，此时可将细胞完全培养在CHO无血清无动物组分培养基中。
在CHO无血清无动物组分培养基中进行放大培养，建立起适应无血清无动物组分培养的CHO种子细胞库。
无血清培养试验步骤
1．实验材料
CHO细胞株购于俄罗斯Soym Agromed，无血清培养基(CHO-S-sFM1I)购于Gibeo公司。
2．实验方法
2.1 无血清培养基的配制 ' n ^1 c* Y6 n" [8 J h
用90ml 纯水溶解制备1 升量的袋装Gibeo CHO-S-sFM1I，加人2.45g NaHC03，用 1M NaOH 将pH调为8.0，再用1M HC1调回至pH7.1，定容后用0.22μm滤器过滤除菌。
2.2 CHO 细胞的适应
用含血清的常规培养基和无血清培养基1:1(v/v)悬浮细胞，接种量
为3×105 个/ml。在37℃，8％培养箱中培养，使细胞密度达5×105
个/m1。然后用等体积的CHO-S-sFM1I 将细胞稀释到3x 105 个/ml，继续培养，重复上述操作，直至血清浓度降为0.1％后，用完全无血清培养基培养到3×106 个/ml。再以3×l05个/ml 接种，传50 代，至此完成适应工作。
无血清培养基
无血清培养基的研究有两个方向：一是培养基中不含有任何动物来源的添加组分；二是培养基中不含有不明确的添加组分。依此可以将当前应用较多的无血清培养基归纳为以下四种：
(1)无血清培养基，为一般意义上无血清培养基，用各类可替代血清功能的生物材料配制细胞培养基，如牛血清白蛋白(BSA) 、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质，以及从血清中提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培养基中的蛋白含量较高,添加物质的化学成分不明确，其中含有大量的动物来源蛋白。
(2)无动物来源培养基，许多商业公司开发的无动物来源培养基是基于生产重组药物的安全考虑，培养基中的添加组分无动物来源，需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物，这些组分可以保障细胞生长及增殖的需要。
(3)无动物蛋白培养基，培养基完全不用动物来源的蛋白，但仍有部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此类培养基组分相对稳定，但必须添加类固醇激素和脂类前体，并且对培养的细胞是高度特异性的。
(4)化学组分限定培养基，此类培养基是目前最安全、最为理想的培养基，首先可以保证培养基批次间的一致性，其中所添加的少量动物来源的蛋白水解物、蛋白都是成分明确的组份。其特点是培养基的性质明确，有利于进行细胞培养的代谢研究，同时分离纯化也比较方便。
目前的无血清培养基已进入第三代，第一代无血清培养基虽然不含有血清，但含有大量的动物或植物蛋白，如BSA 或激素等，虽然它所含的总体蛋白要低于血清，但蛋白的含量依然很高，八十年代末，开发出第二代无血清培养基，它完全不用动物来源的蛋白，如 LTI 公司生产的CH0～S—SFM I，它采用悬浮的CHO 表达蛋白，培养基蛋白含量很低(少于100~g/m1)，使重组蛋白的纯化简单，目前市售的无血清培养基主要是这一类。第三代无血清培养基现在已经出现，它完全不含有蛋白或含量极低，如 LTI公司最近推出的CHO—I—PFM，培养基不含任何
蛋白质，没有任何动物、人类蛋白或多肽，为表达产品的下游处理工作提供极大方便。
成分优缺点相关产品
第一代无血清，但含有大
量的动物或植物蛋
白，如BSA 或激素
等总体蛋白要低于血清，但蛋白的含量依然很高DMEM-F12
第二代无动物来源的蛋白
培养基蛋白含量很低(少于
100~g/m1)，使重组蛋白的
纯化简单。CHO III PFM ，CH0-S-SFM II 第三代无血清，无蛋白培
养基或含量极低
化学成分确定，细胞培养及生产过程比较恒定，分离纯化简单，容易管理。CD CHO Medium
CHO 细胞悬浮培养
细胞驯化的确没什么技术含量，对于很熟练的人来说，3周左右吧。就是拿培养基来试！尽量选择CD 级别培养基，对于反应的控制和以后的纯化都有好处。
2，说来现在用的工程细胞也就以CHO ，293，杂交瘤为主了。如果你的细胞株已经是贴壁的，就尽量驯化成悬浮的。
3，过程可以直接去掉血清，直接换成无血清培养基。也可以把血清加到培养基当中，再逐步减少血清，直到完全换成无血清培养基。
4，在换成无血清培养基后，要密切观察细胞的变化。前期有20-50%的细胞死亡是正常现象。当然也有差异了。更换培养基时尽量换一半，保留一半的条件培养基（条件培养基是养2-3天细胞的培养基），里面含有细胞外泌的因子。有利于细胞的生长。
5，如果是驯化贴壁到悬浮，用CD的培养基会有细胞漂起来，但细胞不一定会死。可以收集起来继续培养。也会有细胞成团的现象，只要不是特别多的细胞聚在一起，不要紧。可以观察一下，养一阶段以后，细胞就会散开。一定浓度的Pluronic F－68、肝素钠或硫酸葡聚糖，能够改善细胞成团的现象。
6，如果前期你的细胞生长特别慢，增殖不好，可以考虑加入5-10ug/ml 的insulin胰岛素，当细胞完全适应培养基后，可以逐渐去掉胰岛素，最后完全去除。
7，前期适应时，不要急于传代，要等到活细胞密度达到10e6以上再传代，传代后接种的密度不小于1-3 x 10e5/ml。用CD培养基时，不能用胰酶消化细胞（因为CD培养基中没有蛋白，无法终止胰酶的作用），可用EDTA0.1%-0.5%都可以。
8，细胞适应培养基后，活细胞的数量每代是稳定的，达到最大细胞密度的周期是稳定的。而且细胞的状态和有血清时差别不大。细胞的表达量略低于或接近有血清培养。有的要高于有血清培养。
9，冻存：条件培养基和新鲜培养基的比例是1：1，同时加入5-10%的DMSO，活细胞数量要不低于3-5x10e6。
10，细胞完全适应以后，在进入反应器之前，是要在摇瓶或转瓶里培养，达到足够的密度和适应程度再进入反应器。
驯服CHO-K1步骤
1 5%FBS胎牛血清的培养基（14326）培养正常的CHO-K1。
2 当细胞汇合度达到80%-90%时，PBS洗涤，胰酶消化，2%FBS的培养基（14326）终止。计数并离心。
3 2%FBS的培养基（14326）重悬细胞，以1×105个细胞/毫升的密度接种细胞。
4 当细胞的汇合度达到80%-90%，保留培养基中悬浮的细胞，观察悬浮细胞的活力，如果悬浮细胞无活力，丢弃。如果有活力，保留并与胰酶消化的贴壁细胞混合。
5 消化按照步骤2进行，1%FBS的培养基（14326）终止。计数并离心。
6 1%FBS的培养基（14326）重悬细胞，以2×105个细胞/毫升的密度接
种细胞。
7 每天观察细胞，并用手掌轻拍细胞瓶让细胞悬浮，重放回培养箱直到
细胞的汇合度达到80%-90%（约4-5天）
8 一旦细胞汇合，保留悬浮的细胞并用手掌轻拍细胞瓶，避免气泡产
生。用吸管吹落瓶壁上的细胞，同时将细胞吹散。细胞计数并离心。
9 无FBS的培养基（14326）重悬细胞，以8×105个细胞/毫升的密度接种
细胞培养。直到细胞的密度达到1.5-2×106个细胞/毫升（约3-4
天）。
10 吹散细胞，计数并离心。
11无FBS的培养基（14326）重悬细胞，以8×105个细胞/毫升的密度接种细胞。直到细胞的密度达到1.5-2×106个细胞/毫升。注意细胞聚团的大小（每团细胞的个数）。
12 反复重复步骤9-11
13 以6×105个细胞/毫升的密度接种细胞，60rpm转速培养。
14 培养方法建立之后，可以进行转瓶的扩大培养。
15 按照规程和密度，可以对悬浮细胞进行规模化的培养。
备注：如果细胞聚团严重，可让大团的细胞沉到细胞瓶底部。吸取单个细胞进行培养。确定总细胞数量和单个悬浮细胞的数量，以安排合理的接种密度。
CHO细胞的转染
电穿孔法：通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内的。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。此法每次转染需要更多的细胞和DNA，因为细胞的死亡率高。每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。有文献称：280V电压电击20ms、质粒用量为
20pg时，转染细胞中蛋白的表达量最高。
脂质体法：中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。脂质体法始于1987年，此法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对不同的细胞可能会干
扰细胞的代谢。
非脂质体的脂质：新一代的脂质体技术，其与DNA结合形成胶束结构而非简单的双层膜结构，使DNA的传递更有效且细胞毒性明显降低。
活化的树状聚合物：该聚合物的高度树状分枝形成球形结构，借助每个球体无数活化的氨基末端凝聚在DNA上形成较为致密的结构，并吸附在细胞膜上，经内吞进入细胞。活化的氨基可以调节胞内溶酶体pH值，抑制降解活性，使DNA稳定存在。转染效率高，毒性低，可重复性好。血清的存在能显著提高转染效率。
CHO细胞的筛选方法
挑选高表达的单克隆细胞株一般采用两种流程：第一种方案首先通过检测外源基因的表达，逐一筛选dhfr阳性单克隆，再转到浓度持续升高的MTX之下生长，分别进行扩增；另一种方法先把dhfr阳性单克隆合并，在不断升高的MTX之下加压扩增外源基因的表达，最后挑出稳定的、高表达的单克隆细胞株。加压扩增外源基因表达，除了单纯使用dhfr扩增系统或GS扩增系统外，也可采用G418与MTX联合作用细胞，G418与MSX（methioninesulphoximine，GS抑制物）联合作用细胞，或者利用dhfr扩增系统与GS扩增系统共加压。混合克隆的表达水平远赶不上表达较高的单个克隆，这是因为转染的CHO细胞中存在不表达或低表达的非生产细胞，并可在长期生存，甚至MTX加压时占生长优势，排斥其它高表达细胞，成为细胞群体中的主要部分，导致产量严重下降，并对MTX加压无反应。当撤除MTX，会发生外源蛋白表达量下降的情况，原因也可能在此。
记忆细胞能直接产生抗体吗细胞周期能缩短吗
记忆细胞能直接产生抗体吗？细胞周期能缩短吗？ 主题：记忆细胞能直接产生抗体吗？细胞周期能缩短吗？ 2008jiaoss 第一.我们知道浆细胞能直接产生抗体，而记忆B细胞能直接产生抗体吗？还是记忆B细胞通过形成浆细胞，然后再由浆细胞产生抗体的呢？ 第二.人教版教材上描述记忆细胞产生抗体时，是这么描述的：“记忆细胞可以在抗原消失后很长时间内保持对这种抗原的 记忆，当再接触这种抗原时，能【迅速】增殖分化，快速产生大量的抗体。”——问题是：这里的“迅速”怎么理解？是指“记忆细胞”这种细胞的“细胞周期”能够缩短？还是其它呢？. 不知道各位老师是怎么理解的？欢迎提出高见，谢谢！ ty200202_0 1.记忆B细胞通过形成浆细胞，然后再由浆细胞产生抗体. 2.记忆细胞可以在抗原消失后很长时间内保持对这种抗原的记忆，当再接触这种抗原时，能迅速增殖分化成浆细胞（效应B细胞），浆细胞快速产生大量的抗体。记忆细胞和浆细 胞的细胞周期都缩短体现了迅速和高效。
2008jiaoss 谢谢答复，还是有疑问： 1、这么说，除了浆细胞和杂交瘤细胞外，没有其它细胞能直接产生抗体了？ 2、如果记忆细胞的细胞周期可以缩短，是指相对原来的B 细胞或者T细胞的细胞周期来说的？还是针对记忆细胞本身来说的呢？细胞周期到底能否变短？为什么？ lichenyun@126 细胞周期变短的说法有违定义，应细胞周期是相对于连续分裂的细胞而言。 2008jiaoss 没错，在人教版必修1中，已经定义了“细胞周期”，而且细胞的细胞周期，是不会变的，除非外来物质，导致基因突变。 各为又是怎么理解的呢？ 遗失的美好 记忆B细胞通过形成浆细胞，然后再由浆细胞产生抗体. 也就是说记忆细胞不能直接产生抗体，需要在同一抗原的刺激下进行分化形成相应的浆细胞才可以产生抗体。记住：产生抗体是浆细胞工作，不要让记忆细胞抢人家的饭碗！（开
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～ 1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
抗体
本专题以抗体为出发点，联系了高中教材中多个章节的知识点，如免疫、遗传的物质基础、生物膜系统及细胞工程、动物代谢知识等。以该知识点为专题进行复习，不仅可以进一步熟知教材中的相关知识点，加强对课本知识的横纵向联系，使知识更加系统化，而且对于培养分析、综合、应用等能力有一定的帮助。一、知识体系： 一知识解析 （一）抗体的定义： ●产生：抗体是机体受到抗原刺激后产生的 ●特性：能与该抗原发生特异性结合 ●功能：具有免疫功能 ●化学本质：球蛋白（可用双缩脲试剂进行鉴定，产生紫色反应） （二）抗体的结构： 组成抗体的基本元素是C、H、O、N等，由各种化学元素组成基本单位――氨基酸，各种氨基酸通过缩合方式形成肽链，抗体是由4条肽链构成的蛋白质，4条肽链通过一定的化学键连接，再折叠、盘曲形成的空间结构就是抗体。 （三）抗体的合成与分泌： 1．抗体是分泌蛋白，其合成及分泌是在体液免疫的反应阶段进行的，合成部位是在效应B 细胞内的粗面内质网上的核糖体上，与其合成及分泌相关的细胞器有核糖体、内质网、高尔基体、线粒体（注意掌握各细胞器所起的作用）；其合成及分泌的途径是：核糖体→内质网→高尔基体→细胞膜→胞外，分布到血清、组织液、外分泌液（如唾液、泪、尿、乳汁等）中；该物质出细胞的方式为外排作用。 2．抗体的合成要受到相应基因的控制，控制其合成的基因为真核细胞基因，其结构包括编码区和非编码区，非编码区对编码区的表达起调控作用，编码区包括内含子和外显子。3．基因控制抗体的合成包括转录和翻译过程。（场所、原料、条件、过程等） 4．人体内合成抗体所需要的原料－氨基酸的来源途径有：肠道吸收、自身蛋白质的分解、氨基转换作用（其它物质的转变）等。 （四）抗体的作用及与人体健康 抗体主要在体液免疫的效应阶段起作用，作用方式有三种：①抑制细菌繁殖和对宿主细胞的黏附；②使病毒失去，感染和破坏细胞的能力，③多数情况是与抗原作用形成沉淀或细胞集团，被吞噬细胞吞噬消化。抗体在细胞免疫的效应阶段还可以协助效应T细胞清除抗原。当免疫功能失调时，可引起各种免疫病，如： ●在过敏原的作用下产生的抗体会吸附在某些细胞的表面上，当过敏原再次侵入人体，抗体会作用于相应的细胞释放出化学物质（如组织胺），使机体产生过敏反应。体液免疫反应与过敏反应中抗体的比较如下： 比较项目体液免疫反应过敏反应 区别 分布血清（主要）、组织液和外分泌液中 吸附于皮肤、呼吸道、消化道黏膜及血液中某 些细胞的表面。 作用 机理 与抗原特异性结合，使抗原沉淀或形成细 胞集团等，消灭抗原。 过敏原与细胞表面的抗体结合，使细胞释放组 织胺等，从而引起过敏反应。 相同点都是由效应B细胞产生的，化学本质都是免疫球蛋白。 ●在某些特殊情况下，若人体的免疫系统对自身成分发生自身免疫反应，对自身的组织和器官造成损伤并出现症状，就称为自身免疫病。
杂交瘤细胞生成抗体技术
杂交瘤细胞生成抗体技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。 1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗
抗体产生的一般规律
抗原进入体内后，抗体产生的一般规律如何 （1）感应阶段：指抗原进入机体与B细胞相互作用的过程。 ①少数抗原的抗原决定簇与B细胞表面的受体分子结合，从而直接刺激B 细胞使之活化长大并迅速分裂。 ②多数抗原要先经过吞噬细胞无特异性的吞噬后，一些抗原分子穿过吞噬细胞的细胞膜而露到细胞表面，夹在吞噬细胞本身的组织相容性附合体分子的沟中。T细胞中有一类助T细胞，不同的助T细胞表面带有不同的受体，能识别不同的抗原。那些能识别吞噬细胞表面组织相容性抗原加上特异的抗原分子结合物的助T细胞，在遇到这些吞噬细胞后，就活化分裂而产生更多有同样特异性的助T细胞。B细胞表面也带有组织相容性附合体，可和特异的抗原分子结合。上述特异的助T细胞的作用是刺激已经和特异的抗原分子结合的B细胞，使之分裂分化。这一B细胞依靠助T细胞和吞噬细胞而活化的步骤，比第一个不需要助T细胞参与的步骤作用更强大。 （2）反应阶段：指B细胞接受抗原刺激后，增殖分化形成效应B细胞和记忆细胞的过程。所谓效应B细胞也称浆细胞，一般停留在各种淋巴结中，它们产生抗体的能力很强，每个效应B细胞每秒钟能产生2 000个抗体，可以说是制造特种蛋白质的机器。浆细胞的寿命很短，经过几天大量产生抗体以后就死去。抗体离开浆细胞后，随血液淋巴流到全身各部，发挥消灭抗原的作用。记忆细胞的特点是寿命长，对抗原十分敏感，能“记住”入侵的抗原。如果有同样的抗原第二次入侵时，记忆细胞比没有记忆的B细胞更快地做出反应，很快分裂产生新的效应B细胞和新的记忆细胞。 （3）效应阶段：指抗体与抗原特异性结合而发挥免疫效应的过程。在该阶段抗体的作用有以下几个方面： ①有些抗原，如病毒等，由于抗体的结合而失去对寄主细胞表面受体的结合能力，因而不能侵入细胞。 ②有些细菌产生的毒素，如白喉毒素、破伤风毒素，可因抗体的结合而不为细胞所接受，因而无效。 ③沉淀和凝集：如果抗原分子是可溶性蛋白质，抗体的结合就使抗原分子失去溶解性而沉淀；如果抗原分子是位于细胞上的，抗体的结合就使这些细胞凝集成团而失去活动能力，例如血液凝集。 ④补体反应：补体是存在于血清、体液中的蛋白质分子，在正常情况下没有活性，只有在发生了免疫后，才陆续被激活，其终产物是使细菌等抗原的外膜穿孔而死亡的破膜复合体。 ⑤K细胞（杀伤细胞）的激活：抗体可以促进血液中的另一种细胞，即杀伤细胞活跃起来，其表面受体能和抗原表面的抗体结合，将抗原杀死。除K细胞外，巨噬细胞以及中性和嗜酸性粒细胞也同样可被抗体激活，杀死抗原。
抗体产生的一般规律
一、抗体产生的一般规律 当第一次用适量抗原给动物免疫，需经一定潜伏期才能在血液中出现抗体，含量低，且维持时间短，很快下降，称这种现象为初次免疫应答。若在抗体下降期再次给以相同抗原免疫时，则发现抗体出现的潜伏期较初次应答明显缩短，抗体含量也随之上升，而且维持时间长，称这种现象为现次免疫应答或回忆应答。由于对抗体分子结构研究的进展，发现初次应答产生的抗体主要是IgM分子，对抗原结合力低，为低亲和性抗体。而再次应答则主要为IgG分子，且为高亲和性抗体。TD抗原可引起再次应答，而TI抗原只能引起初应答。对初次和再次应答现象机制的研究，对抗体特异性、多样性、免疫记忆以及对自身抗原而受性机制等问题的研究，都必须以抗体生成的细胞学为基础（图11-1，表11-2）。 图11-1初次及再次免疫应答 表11－2 初次与再次免疫应答特性 特性初次再次 抗原呈递非B细胞B细胞 抗原浓度高低 抗体产生 延迟相5～10天2～5天 Ig类别主要为IgM IgG、IgA等 亲和力低高 无关抗体多少 二、抗体产生的细胞学基础
抗体产生是由多细胞完成的，Miller等在60年代，首先证明了淋巴细胞是不均一的细胞群。他用早期摘除鸡的胸腺和法氏囊的方法证明了有二类不同的的淋巴细胞，即T和B细胞。前者与细胞免疫有关，后者与抗体形成有关（表11-3）。 表11-3 新生期摘除胸腺及法氏囊对免疫功能的影响（鸡） 全身X-线照射周围血淋巴细胞数Ig浓度抗体产生移植物排斥反应 未身X-线照射148 000 ++ +++ ++ 胸腺摘除9 000 ++ + － 法氏囊摘除13 200 －－+ +阳性反应；－阴性反应 Claman 给经X-线照射小鼠移入同系骨髓细胞（B细胞来源）和胸腺细胞（T细胞来源），然后用羊红细胞免疫，结果证明只有同时移入两种细胞才能产生抗体。因此证明了抗体产生需要T和B细胞共同参予。 Unanue等在70年代又证明了巨噬细胞在抗体形成中的重要作用。他们应用纯化细胞的体外培养技术研究这一问题。根据小鼠细胞对玻璃面或塑料面的粘附性，可将脾细胞分为二种，其一为有粘附性细胞属巨噬细胞（Mφ），另一种为非粘附性细胞属淋巴细胞，包括T和B 细胞。当将这二种细胞分别与羊红细胞（抗原）在体外培养时，皆不能产生抗体，只有在二种细胞混合培养时才能产生抗体，自此证明了Mφ也参予抗体的产生（表11-4，5）。 表11-4 T和B细胞在抗体产生中的作用 X-线照射鼠入的细胞抗体产生 脾细胞（含有T和B）++ 胸腺细胞（T细胞）± 骨髓细胞（B细胞）+ 胸腺细胞+骨髓细胞+++ 表11-5 Mφ在抗体产生中的作用 体外培养细胞抗体产生 粘附细胞+羊红细胞 非粘附细胞+羊红细胞粘附细胞 + +羊红细胞 非粘附细胞－－+++ 表11-6 促进B细胞增殖和分化的细胞因子
用细胞快速生产抗体阅读答案
用细胞快速生产抗体阅读答案 导读：我根据大家的需要整理了一份关于《用细胞快速生产抗体阅读答案》的内容，具体内容：用细胞快速生产抗体，进行这项研究的目的在于获得有效的诊断药或治疗药。以下是我为你整理的，希望能帮到你。《用细胞快速生产抗体》阅读材料在人或动物体内，针对来自体外的异物有... 用细胞快速生产抗体，进行这项研究的目的在于获得有效的诊断药或治疗药。以下是我为你整理的，希望能帮到你。 《用细胞快速生产抗体》阅读材料 在人或动物体内，针对来自体外的异物有一种保卫自己身体的免疫功能。在免疫功能中起主宰作用的就是叫做抗体的蛋白质。 具有排除体内异物功能的抗体也可作为药品使用。例如人被一种名为饭匙倩的毒蛇咬伤，这时注射解毒药的主要成分就是针对这种蛇毒的抗体。最近已开发出针对特定癌细胞的抗体。 作为药品或试剂使用的抗体是利用动物制成的。给动物注射病原体或毒素等异物(抗原)，在动物的体内就会产生针对抗原的抗体。提取出抗体并进一步提纯，就是可作为药品或试剂的抗体。针对饭匙倩蛇毒的抗体是从马身上制取的。 但利用动物制造抗体并不简单。从把抗原注射到动物身上到动物体内产生抗体需要几个月。此外，有时动物的身体不认为这是异物，从而不产生抗体，有时因抗原导致动物死亡。如果不用动物而用培养细胞的方法，可以大幅度缩短制造周期，能高效地制成所需的抗体。
以日本理化学研究所为中心的研究组使用培养细胞"DT40细胞"，成功地用一周左右的时间在试管中制成了目的抗体。该成果发表在今年5月29日美国的科学杂志《自然生物技术》的电子版上。 t 专家们使用的"DT40细胞"是来自鸡身上"B细胞"的培养细胞。B细胞是产生抗体的细胞，一个效应B细胞可以产生一种抗体。DT40细胞在分泌抗体的同时也能把同样的抗体形成在细胞的表面。 DT40细胞与抗原无关，可产生不同的抗体，所以他们先培养出无数DT40细胞。将DT40细胞注入三中脉酰胺A，这是一种新的抗癌药物。由于DT40细胞的基因频繁地重新组合，培养出的DT40细胞各自产生不同的抗体。然后，从中选出能力抗原结合并产生抗体的DT40细胞。预先使抗原与磁珠结合，然后用磁铁将抗原与细胞表面抗体结合了的DT40细胞分离出来。再将分离出来的细胞进一步培养增多，于是得到目的的抗体。 x 如果能在很短的时间内制造抗体，就可获得前所未有的、使用价值很高的药品。特别是突然收到毒性很强的人不明病毒的感染，或发生在生物恐怖袭击时，就可得到有效的诊断药 或治疗药。因此，这个成果有重要意义。 《用细胞快速生产抗体》阅读题目 小题1:下列关于DT40细胞的说法不正确的一项是 A.DT40细胞是一种培养细胞，来自鸡身上的"B细胞"。 B.DT40细胞的基因可以重新组合。 C.DT40细胞可产生不同的抗体，其中一部分能与抗原结合。 D.DT40细胞在分泌抗体后能在细胞表面形成同样的抗体。
抗体产生的一般规律
一、抗体产生的一般规律 当第一次用适量抗原给动物免疫， 需经一定潜伏期才能在血液中出现抗体， 含量低，且维持 时间短，很快下降，称这种现象为初次免疫应答。若在抗体下降期再次给以相同抗原免疫时， 则发现抗体出现的潜伏期较初次应答明显缩短， 抗体含量也随之上升， 而且维持时间长，称 这种现象为现次免疫应答或回忆应答。 由于对抗体分子结构研究的进展， 发现初次应答产生 的抗体主要是IgM 分子，对抗原结合力低，为低亲和性抗体。而再次应答则主要为IgG 分子， 且为高亲和性抗体。TD 抗原可引起再次应答，而 TI 抗原只能引起初应答。对初次和再次应 答现象机制的研究，对抗体特异性、多样性、免疫记忆以及对自身抗原而受性机制等问题的 研究，都必须以抗体生成的细胞学为基础（图 11-1，表11-2 ）。 图11-1初次及再次免疫应答 抗原浓度 抗体产生 无关抗体 二、抗体产生的细胞学基础 表 11 — 2 初次与再次免疫应答特性 特性 初次 再次 抗原呈递 非B 细胞 B 细胞 延迟相 5?10天 Ig 类别 亲和力 主要为 IgM IgG 、IgA 等 高
抗体产生是由多细胞完成的，Miller 等在60年代，首先证明了淋巴细胞是不均一的细胞群。 他用早期摘除鸡的胸腺和法氏囊的方法证明了有二类不同的的淋巴细胞， 即T 和B 细胞。前 者与细胞免疫有关，后者与抗体形成有关（表 表11-3新生期摘除胸腺及法氏囊对免疫功能的影响（鸡） Claman 给经X-线照射小鼠移入同系骨髓细胞（ 然后用羊红细胞免疫，结果证明只有同时移入两种细胞才能产生抗体。 需要T 和B 细胞共同参予。 Unanue 等在70年代又证明了巨噬细胞在抗体形成中的重要作用。 他们应用纯化细胞的体外 培养技术研究这一问题。根据小鼠细胞对玻璃面或塑料面的粘附性，可将脾细胞分为二种， 其一为有粘附性 细胞属巨噬细胞（ M0）,另一种为非粘附性细胞属淋巴细胞，包括 T 和B 细胞。当将这二种细胞分别与羊红细胞（抗原）在体外培养时，皆不能产生抗体，只有在二 种细胞混合培养 时才能产生抗体，自此证明了 M0也参予抗体的产生（表 11-4 , 5 ）。 表11-4 T 和B 细胞在抗体产生中的作用 表11-5 M 0在抗体产生中的作用 11-3 ）。 全身X-线照射 周围血淋巴细胞数Ig 浓度 抗体产生 移植物排斥反应 未身X-线照射 148 000 ++ +++ ++ 胸腺摘除 9 000 ++ 法氏囊摘除 13 200 +阳性反应; —阴性反应 B 细胞来源）和胸腺细胞（T 细胞来源）， 因此 证明了抗体产生 X-线照射鼠入的细胞 抗体产生 脾细胞（含有T 和B ） ++ 胸腺细胞 （T 细胞） 骨髓细胞 （B 细胞） 胸腺细胞 +骨髓细胞 +++ 体外培养细胞 抗体产生 粘附细胞+ 羊红细胞 非粘附细胞+羊红细胞 粘附细胞 + +羊红细胞 非粘附细胞 +++ 表11-6促进B 细胞增殖和分化的细胞因子
抗体小知识
科技名词定义 中文名称： 抗体 英文名称： antibody;Ab 定义1： 能与相应抗原(表位)特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 应用学科： 免疫学（一级学科）；免疫系统（二级学科）；免疫分子（三级学科） 定义2： 在人和动物体内，由于抗原或半抗原入侵刺激机体而在细胞中产生的免疫球蛋白。能可逆、非共价、特异地与相应抗原结合，形成抗原-抗体复合体。 应用学科： 生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科） 定义3： 机体内B细胞在抗原刺激下所产生的具特异性免疫功能的球蛋白。 应用学科： 水产学（一级学科）；水产生物病害及防治（二级学科） 定义4： 具有抗原结合部位，能与抗原分子上相应表位发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。应用学科： 细胞生物学（一级学科）；细胞免疫（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 求助编辑百科名片 Y型抗体结构示意图 抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。 目录 概念 多克隆抗体的制备 单克隆抗体的制备 概述
生物活性 抗体结构 抗体基因重排 单克隆抗体 抗体的多样性 抗体的功能 抗体规律 抗体的分类 按作用对象 按理化性质和生物学功能 按可见反应 按抗体来源 世界著名抗体公司 Santa公司 Abcam公司 Abgent公司 AbMART Proteintech Group MBL Cell Signaling Technology(CST) Zymed Laboratories公司 台湾Abnova Chemicon Pierce公司 BD PeproTech Cayman Assay Design Dynal Biotech ASA. DSL公司 罗氏公司（Roche）BioLegend公司eBioscience公司BioVision. Inc. MABTech 电影 基本信息 上映日期 剧情简介 概念 多克隆抗体的制备 单克隆抗体的制备 概述
抗体产生
抗原进入体内后，抗体的产生 （1）感应阶段：指抗原进入机体与B细胞相互作用的过程。 ①少数抗原的抗原决定簇与B细胞表面的受体分子结合，从而直接刺激B 细胞使之活化长大并迅速分裂。 ②多数抗原要先经过吞噬细胞无特异性的吞噬后，一些抗原分子穿过吞噬细胞的细胞膜而露到细胞表面，夹在吞噬细胞本身的组织相容性附合体分子的沟中。T细胞中有一类助T细胞，不同的助T细胞表面带有不同的受体，能识别不同的抗原。那些能识别吞噬细胞表面组织相容性抗原加上特异的抗原分子结合物的助T细胞，在遇到这些吞噬细胞后，就活化分裂而产生更多有同样特异性的助T细胞。B细胞表面也带有组织相容性附合体，可和特异的抗原分子结合。上述特异的助T细胞的作用是刺激已经和特异的抗原分子结合的B细胞，使之分裂分化。这一B细胞依靠助T细胞和吞噬细胞而活化的步骤，比第一个不需要助T细胞参与的步骤作用更强大。 （2）反应阶段：指B细胞接受抗原刺激后，增殖分化形成效应B细胞和记忆细胞的过程。所谓效应B细胞也称浆细胞，一般停留在各种淋巴结中，它们产生抗体的能力很强，每个效应B细胞每秒钟能产生2 000个抗体，可以说是制造特种蛋白质的机器。浆细胞的寿命很短，经过几天大量产生抗体以后就死去。抗体离开浆细胞后，随血液淋巴流到全身各部，发挥消灭抗原的作用。记忆细胞的特点是寿命长，对抗原十分敏感，能“记住”入侵的抗原。如果有同样的抗原第二次入侵时，记忆细胞比没有记忆的B细胞更快地做出反应，很快分裂产生新的效应B细胞和新的记忆细胞。 （3）效应阶段：指抗体与抗原特异性结合而发挥免疫效应的过程。在该阶段抗体的作用有以下几个方面： ①有些抗原，如病毒等，由于抗体的结合而失去对寄主细胞表面受体的结合能力，因而不能侵入细胞。 ②有些细菌产生的毒素，如白喉毒素、破伤风毒素，可因抗体的结合而不为细胞所接受，因而无效。 ③沉淀和凝集：如果抗原分子是可溶性蛋白质，抗体的结合就使抗原分子失去溶解性而沉淀；如果抗原分子是位于细胞上的，抗体的结合就使这些细胞凝集成团而失去活动能力，例如血液凝集。 ④补体反应：补体是存在于血清、体液中的蛋白质分子，在正常情况下没有活性，只有在发生了免疫后，才陆续被激活，其终产物是使细菌等抗原的外膜穿孔而死亡的破膜复合体。 ⑤K细胞（杀伤细胞）的激活：抗体可以促进血液中的另一种细胞，即杀伤细胞活跃起来，其表面受体能和抗原表面的抗体结合，将抗原杀死。除K细胞外，巨噬细胞以及中性和嗜酸性粒细胞也同样可被抗体激活，杀死抗原。