实验二 质粒DNA电泳鉴定 - 武汉大学药学院
第十一章 核酸提取与鉴定
Trizol一步法提取总RNA：
附：Trizol法步骤
1）实验前取冰，4℃离心机预冷，DEPC处理水（高压灭菌 处理）配制的75%乙醇4℃预冷； 2）1ml Trizol匀浆好的样品； 3）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀（15秒）——“慢”，氯仿使蛋
白变性
4）室温，静置3分钟； 5）离心机4℃、14000转/分，离心15分钟；静置1分钟（分
（2）体液标本
浆膜腔积液、脑脊液、尿液、关节积液等； 按水样标本方式离心，取沉淀用于核酸提取。
（二）提取用具预处理
1. DNA提取用具的处理
要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNase处理。
2. RNA提取用具的处理
要求无菌，防止二次污染。 RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温， 提取条件要求严格。
条件用-20℃、1小时，目的为了更好分层）
9）离心机4℃、14000转/分，离心10分钟 10）弃上液（移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，
沿液面吸弃约0.9ml上清；第2步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接 触到沉淀斑区）
11)沿试管内壁轻轻加入1ml 4℃预冷的75%乙醇,注意切勿 冲击到沉淀斑区 12）离心机4℃、10000转/分，离心5分钟 13）弃上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过 程中把RNA烤干），60℃恒温箱干燥5分钟（注意：打开管盖；或用
• 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA 提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药 匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。
• 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃ 处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高 压灭菌15分钟，去除残余DEPC。
高三生物一轮复习PCR知识总结
高考生物PCR的过程及应用考点归纳总结一、基础考点1.名称：多聚酶链式反应2.原理：DNA双链复制（DNA的半保留复制）、DNA的热变性原理3.前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列4.过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：会解释三个步骤①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸再耐高温的DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配原则合成新的DNA链④重复：第一轮循环的产物作为第二轮的模板：重复循环变性—复性--延伸三过程。
5.PCR反应体系的成分及作用DNA模板：从样本或细胞中提取的微量总DNA原料∶dNTP（dATP、dGTP、dCTP、TTP），提供原料和能量酶∶Taq聚合酶（热稳定DNA聚合酶，从嗜热菌中分离得到）引物∶一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸（注意：引物与目的DNA片段两条母链各自的3’端序列互补）Mg2+：维持酶活性所必需PCR缓冲液∶维持pH，保护Taq酶6.DNA在体内复制的条件模板∶DNA分子的每条链酶∶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶原料、能量∶dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物∶RNA引物，温和的反应条件7.总结：PCR与体内DNA分子复制的不同点：PCR DNA复制复制起点无有复制叉无有场所及条件体外；控制3个不同温度体内细胞核、线粒体、叶绿体；温和条件步骤变性、退火、延伸起始、延伸、终止酶Taq酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶引物2种，一小段与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链DNA；人工合成多种RNA做引物；自行合成引物是否去除否是变性的条件90℃以上的高温解旋酶结果短时间内快速扩增目的基因片段复制完整的DNA分子特点半保留复制两条链连续合成半保留复制半不连续复制8.PCR技术在基因工程中的应用：（1）特异性、快速扩增目的基因获取目的基因（2）目的基因的检测与鉴定9.用PCR技术可以扩增mRNA吗？不可以；在逆转录酶的作用下，需以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则合成cDNA再进行扩增10.提取mRNA扩增目的基因的过程：第一步：逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子第二步：核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子第四步：以双链DNA分子为模板，经过③变性、④复性、⑤延伸，循环扩增形成目的基因产物11.cDNA中缺少真核生物基因的哪些结构：启动子、内含子、终止子12.目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是：Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活13.PCR产物的影响因素：模板DNA的量、脱氧核苷酸的量、引物的量、酶的数量和活性、循环次数、Mg2+的浓度14.PCR后期，反应速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP浓度降低、反应产物增多15.变性温度过低会导致双链不能充分解开；16：PCR扩增中预变性的目的：预变性破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
基因工程实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握基因工程的基本原理和操作技术；2. 熟悉基因克隆、表达、检测等实验操作；3. 培养实验操作技能和科学思维能力。
二、实验原理基因工程是利用分子生物学和生物化学原理，通过人工手段对生物的遗传物质进行改造，以达到改变生物特性、提高生物产量、生产新生物制品等目的的技术。
实验中主要涉及以下原理：1. 限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）：能够识别特定的核苷酸序列，并在该序列的特定位置切割DNA链；2. DNA连接酶（DNA ligase）：能够将两个DNA片段连接起来；3. 转化：将外源DNA片段导入受体细胞；4. 转录和翻译：将目的基因转录成mRNA，再翻译成蛋白质。
三、实验材料1. 质粒载体：pET-28a、pUC19等；2. 限制性核酸内切酶：EcoRI、HindIII等；3. DNA连接酶：T4 DNA连接酶；4. 转化试剂：钙离子、转染试剂等；5. 实验试剂：Tris-HCl缓冲液、NaCl、KCl、MgCl2、DNA模板、引物、dNTPs、PCR试剂等；6. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、超净工作台等。
四、实验步骤1. 设计实验方案：根据实验目的，设计实验步骤，包括目的基因的克隆、表达、检测等。
2. DNA提取：采用CTAB法提取质粒DNA。
3. 限制性核酸内切酶酶切：将质粒DNA和目的基因片段分别进行EcoRI、HindIII酶切，酶切产物进行电泳鉴定。
4. DNA连接：将酶切后的质粒DNA和目的基因片段进行连接，连接产物进行电泳鉴定。
5. 转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆。
6. 阳性克隆的鉴定：通过PCR、测序等方法对阳性克隆进行鉴定。
7. 重组质粒的提取：提取重组质粒，进行电泳鉴定。
8. 重组质粒的表达：将重组质粒转化到大肠杆菌表达系统中，进行诱导表达。
9. 目的蛋白的纯化：采用离子交换层析、亲和层析等方法对目的蛋白进行纯化。
本科基因工程实验论文开题报告.
编号内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室本科基因工程实验论文开题报告论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达学生姓名：年级：专业：指导教师：年月日学生姓名民族族性别出生年月论文题目碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达开题时间年月日结题时间年月日项目来源本科生基因工程大实验课一、立论依据项目的研究意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)是一种非特异性磷酸单酯酶，能催化磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖，也能催化磷酸基团的转移反应。
AP广泛存在于微生物和动物体内，在磷生物地球化学循环过程中有重要作用，并广泛应用于诊断学、生物化学及分子生物学等领域。
1 大肠杆菌碱性磷酸酶20世纪80年代相继完成了大肠杆菌AP、人胎盘型AP、人肝/骨/肾型AP、人小肠型AP和酿酒酵母AP氨基酸序列的测定，通过序列比较发现相似性为25%~30%，活性部位高度保守，都保留了Ser102残基、Arg166及金属离子配体，这些保守的与催化活性相关的基团暗示了不同来源的AP具有相似的作用机制。
另外，功能相似的磷酸二酯酶，如蜡状芽孢杆菌中的磷脂酶C、桔青霉中核酸酶P1，它们的活性部位和金属离子结合位点与大肠杆菌AP相似。
所以，大肠杆菌AP还可作为其它磷酸酯酶和以金属离子作辅助因子的磷酸酯酶的研究模型。
AP确切的生理功能还不十分清楚，但认为它对有机体内磷代谢的调节有重要作用。
大肠杆菌AP的结构基因是phoA，它是pho调节子的一部分，pho调节子主要调节磷的转运和代谢。
Phobox是pho调节子所有基因启动子区域的共有序列，受PhoB蛋白的调控。
phoB基因产物直接激活pho调节子的转录，而PhoB蛋白又被PhoR蛋白磷酸化激活。
细胞外磷的水平是调控PhoR的信号，信号传递通过大肠杆菌Pst系统实现。
当接收到环境信号后，PhoR再去调节PhoB，而PhoB就是大肠杆菌AP结构基因phoA的直接转录调节者。
质粒的保存实验
质粒的保存实验一、实验基本流程：制备大肠杆菌感受态细胞质粒转化感受态细胞转化子的鉴定与筛选重组子的菌种保藏二、材料与方法1、材料1.1 培养基的配置（1）LB培养基：0.5%酵母抽提物；1%蛋白胨；1%NaCl；pH 7.0-7.5(固体培养基加入2%琼脂粉) （2）LB Amp平板：LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为100ug/mL,摇匀后铺板。
（3）LB Kan平板：LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Kan储存液,使终浓度为50ug/mL,摇匀后铺板。
1.2 缓冲液的配置（1）电泳缓冲液（每升）：5×TBE：Tris base 54g；硼酸27.5g；0.5M EDTA（pH 8.0）1.3 药品的配置（1）50%甘油：50mL甘油用重蒸水定容至100mL,高压灭菌。
（2）75mM CaCl2：称取1.1g CaCl2.2H2O(分析纯),溶于50mL重蒸水中,定容至100mL,高压灭菌。
（3）75mM CaCl2（15%甘油）：称取1.1 g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
（4）100mg/mL Amp母液：称取Amp粉末1g，用10mL灭过菌的重蒸水溶解定容后，分装，于-20℃保存即可。
（5）50mg/mL Kan母液：称取Amp粉末0.5g，用10mL灭过菌的重蒸水溶解定容后，分装，于-20℃保存即可。
2、方法2.1 DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备⑴接30uL DH5α甘油菌于3mL LB中，37℃，250rpm，培养过夜⑵接3mL LB培养的DH5α大肠杆菌500L于100mL LB培养基中，37℃，250rpm，1h（左右，云雾状，OD600=0.3-0.4）⑶分装3个50 mL离心管，冰浴10min⑷4℃,4000 rpm,7min离心后，弃上清⑸三管沉淀合于一管，加入30 mL（大概量）冰预冷75mM CaCl2，重悬沉淀，冰浴30min⑹4℃,4000 rpm,5min离心后，弃上清（沉淀要呈条带状）⑺加入3-6mL冰预冷75mM（含15%甘油）CaCl2，重悬沉淀⑻分装，每个ep管加200L菌悬液⑼冰上放置2-4h，-20℃冰浴，再放入-80℃冰箱保存2.2质粒的转化⑴取0.5uL质粒加入到制备好的200L感受态细胞中⑵混匀，冰浴30min⑶37℃热休克5-7min⑷冰浴3min⑸加800L LB培养基，混匀，37℃温育45-60min⑹4000rpm离心5min，去部分上清，菌体重悬，涂布含Amp/Kan的LB平板，37℃倒置培养过夜。
碱裂解法提取表达质粒载体pET
碱裂解法提取表达质粒载体pET-28a及电泳鉴定1. 实验原理可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子叫载体（vector）。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。
一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单一位点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。
常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
为表达蛋白质设计的载体称为表达载体(expression vector)。
pET系统是有史以来在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统之一，有一系列类似的表达载体。
如表达载体pET28a(见图3)，含有：T7噬菌体启动子、核糖体结合位点、乳糖操纵子、乳糖阻遏子序列（lacI）、 His6标签序列、凝血酶切割位点、多克隆位点、T7噬菌体终止子及pBR322复制子、f1噬菌体复制子、卡那霉素筛选标记序列等。
pET表达系统中的受体菌为能够产生T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)。
碱变性法抽提质粒DNA主要包括收集并悬浮细菌菌体、裂解细胞、将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA以纯化质粒DNA。
我们购买的质粒提取试剂盒的原理也是碱解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。
人教版高中生物选择性必修第3册 精品讲义 3.2 基因工程的基本操作程序(教师版)
3.2 基因工程的基本操作程序 教学目标教学重点1.基因工程基本操作程序的四个步骤。
2.DNA 片段的扩增及电泳鉴定。
教学难点1. 利用PCR 获取和扩增目的基因。
2. DNA 片段的扩增及电泳鉴定。
知识点01 第一步：目的基因的筛选与获取1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
也指能够编码特定蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用课程标准目标解读 基因工程是一种重组DNA 技术。
1. 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
1. 阐明基因工程的原理和基本操作程序。
2. 针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
3. 尝试进行PCR 的基本操作并用电泳鉴定PCR 的产物。
知识精讲目标导航的因子。
2.筛选目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一3.获取目的基因：（1）人工合成（2）基因文库中获取目的基因（3）利用PCR获取和扩增①PCR：PCR全称为聚合酶链式反应，又叫做体外DNA扩增技术。
根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因。
②PCR利用的原理：DNA半保留复制③DNA复制的基本条件：④PCR的前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
⑤PCR的条件：DNA模板（需含有目的基因）。
分别与模板DNA相结合的2种引物。
四种脱氧核苷酸（或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）。
稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。
能严格控制温度的温控设备。
⑥PCR的过程：⑦PCR的结果：以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）⑧鉴定PCR的产物：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物知识点02 第二步：基因表达载体的构建基因表达载体的组成：目的基因、标记基因、启动子、终止子基因表达载体构建过程：一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶将两者连接。
《分子生物学》实验指导书
《分子生物学》实验指导书实验学时：32学时适用专业：生物科学、生物技术实验目录实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定 (1)实验二聚合酶链式反应扩增DNA片段 (3)实验三大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化 (4)实验四植物基因组DNA提取及电泳 (6)实验五植物基因组RNA提取及电泳 (7)实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定实验项目类型：综合性一、实验目的1. 学习质粒的相关基本知识，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。
2. 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。
二、实验原理碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。
在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。
当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。
三、实验仪器与材料1. 材料：含pSV的E.coli JM109菌株、1.5ml塑料离心管、离心管架、EB、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、吸头等。
2. 溶液或试剂：LB培养基、溶液Ⅰ、溶液II（0.4mol/L NaOH、2%SDS用前等体积混合）、溶液Ⅲ、分离液：酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1、无水乙醇、70%乙醇等。
3. 仪器或其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、恒温振荡摇床、高压蒸汽灭菌锅、涡旋振荡器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温培养箱、制冰机等。
四、操作步骤质粒DNA的提取步骤：1. 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于另外已制备好的LB琼脂平板上，保存菌种，并把牙签放入盛3 ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
重组腺病毒构建_扩增及纯化基本技术操作——永诺生物
重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作——永诺生物一目的基因的克隆（以pshuttle-CMV质粒为例）1. 选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。
2. 重组质粒鉴定：酶切鉴定或测序。
3. 重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。
4. 用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。
5. 胶回收线性化质粒，以备共转化使用。
二共转化1 大肠杆菌BJ5183电转感受态制备1）从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183细菌，接种于LB培养基中，37℃振摇过夜。
2）接种25ml过夜培养物于500ml LB培养基，37℃振摇，至OD600 达到0.4。
3）迅速将培养物置于冰浴中30min，至充分冷却。
4）将菌液转移至预冷的离心管中，4℃下以2500r/min离心15 min，弃培养液，回收细胞。
5）以10ml预冷的10%甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次。
6）加约1ml（适量）预冷的10%甘油重悬沉淀，稀释悬液100倍，测量OD600，至稀释浓度为2-3×1010个细胞/ ml (1.0 OD600约2.5×1010个细胞/ml)。
分装，-80℃或液氮保存待用。
2 病毒骨架质粒转化大肠杆菌，扩增，纯化。
3 将1-5µl (约1µg) 线性化的穿梭质粒及1µl（约100ng/µl）病毒骨架质粒（如pAdEasy-1）加入至含约40µl BJ5183电转感受态的EP管中混匀,冰上冷却。
4 将混合物加入电转杯，电击（1250-1500V/mm,5ms）。
5 电击结束取出样品，加入1ml SOC或LB培养液，37℃低速振荡40min。
6 取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培养16-20hr。
7 次日挑取平板上长出的菌落（选择最小的菌落）,接种于3ml含25-50mg/ml的LB 培养基，37℃培养10-15hr。
限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒作业指导书
限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒作业指导书实验目的掌握单、双酶切的技术，理解酶切法进行重组质粒进行鉴定的原理。
实验原理(一)酶切各种限制性内切酶能专一地识别碱基顺序，例如，Eco R Ⅰ酶的识别顺序为：GAATTC；Scal I酶的识别顺序为：AGTACT，用Eco R I和Scal I同时酶解含有这两个单一酶切位点的环状双链DNA分子，就产生两条带有相应酶切位点的线性DNA分子。
当Eco R I和Scal I同时酶切一个质粒DNA时，酶切反应必须完全。
不同酶切反应都需要Mg2+并要求一定的盐离子浓度，但不同的酶达到最佳酶切效率所需的盐浓度不同。
因此生产厂商在销售酶的同时往往附带专门的缓冲液。
如果盐离子浓度使用不当，会使酶的识别位点发生改变，例如当盐离子浓度低于50mmol／L时，Eco R I内切酶的专一性就降低，只能识别中间的4个核苷酸序列(称该酶为Eco R I*)。
绝大多数酶的反应温度是在370C，酶切反应时间需30min、60min以至2h以上。
一般来说，如酶的纯度不佳，酶切时间不能太长。
终止酶切反应时，大多数可在65℃水浴中，保温10min，就可使大部分酶失活。
Eco R I酶置65℃水浴中，保温10min，丧失95％的酶活性。
内切酶一般都保存在50％甘油的缓冲液中。
当保存在10％甘油中时，酶活力丧失更快。
少数较耐热的酶，在加热前先加pH7.5的EDTA，至终浓度为10mmol／L。
EDTA螯合了反应系统中所有的二价阳离子，就更便于终止酶切反应。
酶切要完全，酶解的数量也要适当。
设计酶解DNA的数量时，除了根据连接与转化的要求外，还要按照DNA浓度的高低，酶液单位的高低等具体情况而定。
同时还要考虑到DNA每经一步处理，就得重新纯化，这样DNA浓度的损失量几乎达到50％。
并且每经一步操作后，都要取一定量的DNA样品进行电泳鉴定或作为电泳对照样品。
因此，在设计酶解数量时，不能用量太少，但是酶解数量过多，势必要消耗大量限制性内切酶和DNA，这也是不必要的。