成年大鼠心肌细胞分离方法
心肌细胞凋亡对老年大鼠心脏功能的影响
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７ ５８ ・
Ｊ Ｓ ｈ ａ ｎ ｘ ｉ Ｍｅ ｄ Ｕｎ ｉ ｖ，Ｏｃ ｔ ２ ０ １ ３，Ｖｏ ｌ ４ ４ Ｎｏ １ ０
心 肌 细 胞 凋 亡对 老年 大 鼠心脏 功 能 的影 响
改良的大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法
（ 上 海斯 莱 克 实 验 动 物 中 心 ） 。ＤＭＥ Ｍ 高 糖 培 养 基
（ Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ ， 美 国） ； 鼠尾 胶 （ 自制 ） ； 胰 蛋 白酶 （ １： ２ ５ ０ ，Ａｍｅ ｒ ｅ ｓ ｃ ｏ ， 美 国） ； 胎 牛 血清 （ Ｆ Ｂ Ｓ ， Ｇｉ ｂ ｃ ｏ ， 美 国） ； 兔抗 鼠 Ｃ Ｄ３ ４单 克 隆抗 体 、 兔抗 鼠 Ｃ Ｄ３ １单 克 隆抗 体 （ Ａｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ Ｄ ｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｔ ｉ ｃ ａ Ｉ ｎ ｃ ， 美 国） ； 兔 抗 人
比例 ： Ｃ Ｄ３ ４ 、 Ｃ Ｄ ３ １为 １： ５ ０ ０ ， ＶＩ Ｉ Ｉ因子为 １： ２ ０ ０ 。
本文 ２ Ｏ １ ２ —１ ２ 一Ｏ ８收 到 ， ２ ０ １ ３ －０ １ —１ ６修 回 ， ２ Ｏ １ ３ 一Ｏ １ —１ ８接 受
矗曩厦学 杂 志
２ ０ １ ３ 年第 ２ ３ 卷第１ 期
圜 篓 一
篓
ＶＩ Ｉ Ｉ因子 相 关 抗 原 多 克 隆 抗 体 （ ＤＡＫＯ， 丹麦） ； 抗
兔及 抗 鼠 ＡＢ Ｃ试 剂 盒 、 Ｄ ＡＢ显 色 试 剂 盒 、 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ标 记羊 抗兔 Ｉ ｇ Ｇ（ Ｂ ｅ ｙ ｏ ｔ ｉ ｍｅ ， 中 国） ； 其 余化 学试 剂 为 国 产分 析纯 商 品 。 １ ． ３ 实验 用 肝素 的配 制
ｍ饵讲学 杂 志， ２ ０ １ ３ 。 ２ ３ （ １ ） ： ３ ９ － － － ４ ０
⑥ ２ ０ １ ３ Ｃ ＨＩ Ｎ Ｅ Ｓ Ｅ Ｊ Ｏ Ｕ Ｒ Ｎ Ａ Ｌ Ｏ Ｆ ＭＩ Ｃ Ｒ Ｏ Ｃ Ｉ Ｒ Ｃ Ｕ Ｌ Ａ Ｔ Ｉ Ｏ Ｎ
慢性缺氧致大鼠右心室心肌细胞凋亡及其机制研究
（Ｄｐ ｒ ｅｔｆＰ ｄａ ｉ ， ｆ ｌ ｔ ｏ ｉ ｌｆＧ ｎｄ ｎ ｄ ａ Ｃ ｌｇ ， ｈ ｎ ａｇ５４ ０ ， ｈｎ ； ｅａｔ ｎ ｏ ｅａｔ ｎ ｏ ｅｉｔｃ Ａ ｉａｅ Ｈ ｓ ｔ ｎ ｇ ｏｇＭｅｉ ｌ ｏｅｅ Ｚ ａｊ ｎ ２ ０ １ Ｃ ｉ Ｄｐ ｒ ｔ ｆ ｍ ｒｓ ｉ ｄ ｐａ ｏ ａ ｃ ｌ ｉ ａ ｅ ｍ
Ｐ ｄ ａ ｒ ｓ Ｚｈ ｎ ｓ ａ ｍ ｎ ａ ｄ Ｃ ｉ ｒｎ Ｈｏｐ ｔｌ ｅ ｉ ｔ ， ｏ ｇ ｈ ｎ Ｗｏ ｃ ｉ ｅ ｎ ｈ ｌ ｅ ｓ ｉ ，Ｚｈ ｎ ｓ ａ ２ ４ ３，Ｃ ｉａ Ｅ—ｍａ ｌ ｓ ａ ｔ ｄ ｃ ｅｕｃ ） ｄ ａ ｏ ｇ ｈ ｎ５ ８ ０ ｈｎ ． ｉ：ｉ ｃ ＠ｇ ｍ ．ｄ ．ｎ ａ
大 鼠右心室心肌细胞凋亡和心肌肥大 ， 且大 鼠右心室心肌 细胞凋亡 和心肌 肥大程度 随着缺氧 时间 的延 长而增 加。
慢性缺氧通过抑制大 鼠右心室心肌细胞抗凋亡基因 ｂｌ ２表达 ， ｂｌ ２ ｂｄ比值 下调 ， ｃ一 使 ｃ一 ￣ａ 打破原 有的平衡 ， 导致心
肌 细胞 凋 亡 。
［ 关键词 ］ 缺氧 ； 大；细胞凋亡 ； 肥 右心室 ； ｃ 一 ； ａ Ｂ ｌ ２ Ｂｄ ［ 中图分类号 ］ Ｒ ６ ３３ ［ 文献标识码 ］ Ａ
Ｐｏ ｅ ｔａ ｅ ｈａ ｉｍ ｆｍ ｙ ｃ ｒ ｕ ｐ ｐ ｏ ｉ ｆｒｇ ｔｖ ｎ ｒｃｅｉ ａ ｎ－ ｔ ｎ ｉｌｍ ｃ ｎ ｓ ｏ ｏ ａ ｄｉ ｍ ａ ｏ ｔ ｓｓｏ ｉ ｈ ｅ ｔ ｉｌ ｎ ｒ ｔａ ｄｅ ｈｒ ｎ ｃ ｈ ｐ ｘ ａ ｒ ｃ ｏ ｙ ｏ ｉ ｉ
缺氧 １ ４ｄ组显著降低 （ Ｐ＜ ．５ 。慢性缺氧 １ 、１２ 均 ００ ） ４ ２ 、８ｄ组大 鼠右心室 ｂｄｍ Ｎ ａ Ｒ Ａ表达和 Ｂ ｄ蛋 白表达与正常 ａ 对照组 比较无 明显改变 （ Ｐ＞ ． ５ 。（ ） 均 ０ ０ ） ４ 慢性 缺氧 １ 、１２ 大 鼠右心室 ｂｌ ２ ｂｄ比值均 明显低 于正常 ４ ２ 、８ｄ组 ｃ 一 ￣ａ 对照组 （ Ｐ＜ ． ５ ， 均 Ｏ ０ ） 缺氧 ２ ｂｌ ２ ｂｄ比值较缺氧 １ ８ｄ组 ｃ 一 ￣ ａ ４ｄ组显著降低 （ ００ ） Ｐ＜ ． ５ 。结论 ： 慢性缺氧可 以诱 导
新生大鼠心肌细胞培养技术
【 ｅ Ｏｄ】 Ｃ ｌ ｕｕｅ ｅ ｎ ｕｓ Ｍｙｃ ｄ ｌ Ｒ ｔ Ｋｙ ｌ Ｗ Ｓ ｅ ｔ ｈｉ ｅ； ｌｌ ｒ ｔ ｑ ｃ ｃ ｏ ｒｉ； ａ ａ ａ ｓ
原 代培 养心 肌 细胞作 为 一种 主要 的研 究模 型 ， 被广泛 地 应 用 于心 血 管 疾 病 的研 究 中。我 们 经 过 长期 摸索 总结 出一 套 简便 、 有效 的大 鼠心肌 细胞 的
【 要】 目的 探讨新生大鼠心肌细胞的分离、 摘 培养方法。方法 取 １ 龄新生大 鼠的心室肌细胞 ， ～３ ｄ
用胶原酶 １分离心肌 细胞 ， 离心收集心肌细胞 ， 差速贴 壁法 纯化后 培养于 ＤＭＥ 培养基 。显微镜 下鉴定 心肌细 Ｍ
胞的纯度和形态结构 ， 锥虫蓝染色检查心肌细胞成 活率 。结果 出现 同簇 细胞 的同步跳动 。结论
【ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊ ｔｅ ｏ ｎ ｓ ａ ｐｒｔａｄｃｌｒ ｍ ｏａ ｉ ｌｏ ｎ ｎｔｒｓ Ｍｅ ｏｓ Ａ ｓａｔ ｂ ｃｖ Ｔ ｄ ｎｅ ｙｗ ｙ ｏ ｅａ ｅ ｎ ｔ ｅ ｙ ｒ ａｃ ｓ ｆ ｅ ａ ｔ ｒ ｅｉ ｉ ｆ ａ ａ ｔ ｓ ａ ｕ ｕ ｃ ｄ ｄ ｏ ｅ ａ ． ｔ ｄ ｌ ｈ
取一窝 １ ～３ｄ龄新 生大 鼠， 不用 麻醉和处 死 ， 用手 固
定住 四肢 ，５ ７ ％的酒精消毒皮肤 ， 无菌 眼科剪 在剑 突上一肋 处 人剪 （ 注意避免剪破消化 道预 防污 染） 。开 口 ０ ５ｃ ， ． ｒ 心 ｎ 脏 自然 跳 出 ， 心 尖 部 组 织 剪 下 迅 速 置 于 预 冷 的 不 含 将
ｗｅｅ ｕ ｉ ｙ ｃ ｒｎ ｕｌ ． ｏ ｃｕ ｉ Ｔ ｉ ｉ ａ ｆ ｔ ｅｗ ｙ ｔ ｕ ｙｍｙ ｃｒ ｉ ｅ ｓ ｒ ｊｍｐｎ ｓｎ ｈｏ ｏ ｓ Ｃ ｎ ｌ ｏ ｇ ｙ ｓｎ ｈｓ ｓｎ ｅｆ ｉ ａ ｓ ｄ ｏａｄａ ｃｌ ． ｃ ｅ ｖ ｏ ｔ ｌ ｌ
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。
在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。
本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。
BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。
因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。
近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。
BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。
细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。
其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。
本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。
具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。
细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。
细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。
细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。
通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。
通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。
经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。
在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。
这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。
乳鼠原代心肌细胞的英语
乳鼠原代心肌细胞的英语英文回答：Neonatal Rat Primary Cardiomyocytes Isolation and Culture.Neonatal rat primary cardiomyocytes (NRCMs) areisolated from the hearts of newborn rats and cultured in vitro as a model system for studying cardiac biology and function. These cells are highly differentiated and exhibit many of the characteristics of adult cardiomyocytes, including the ability to contract spontaneously and respond to pharmacological agents. NRCMs have been used extensively in research to investigate a variety of cardiovascular diseases, including heart failure, arrhythmias, and ischemic injury.Isolation of NRCMs.NRCMs are typically isolated from 1to 3-day-oldSprague-Dawley rats. The rats are euthanized and the hearts are removed and placed in sterile phosphate-buffered saline (PBS). The hearts are then minced into small pieces and digested with a collagenase solution. The resulting cell suspension is filtered and centrifuged to separate the cardiomyocytes from other cell types.Culture of NRCMs.The isolated NRCMs are resuspended in a culture medium supplemented with serum and antibiotics and plated onto culture dishes. The cells are allowed to adhere to the dishes for 24 hours, after which the medium is replaced with a serum-free medium. NRCMs can be cultured for up to 4 weeks, although they typically begin to lose their differentiated characteristics after 2-3 weeks.Characterization of NRCMs.NRCMs can be characterized by their morphology, electrophysiological properties, and contractile function. Morphologically, NRCMs are polygonal in shape and have acentral nucleus. They exhibit spontaneous contractions and respond to electrical stimulation. NRCMs express a varietyof cardiac-specific proteins, including sarcomeric proteins, ion channels, and calcium-handling proteins.Applications of NRCMs.NRCMs have been used in a wide range of research applications, including:Investigation of cardiac diseases: NRCMs have beenused to study the mechanisms underlying a variety of cardiovascular diseases, including heart failure, arrhythmias, and ischemic injury.Development of new drugs: NRCMs have been used to screen for new drugs that may be effective in treating cardiovascular diseases.Toxicology testing: NRCMs have been used to test the toxicity of new drugs and chemicals.Gene therapy: NRCMs have been used to study the effects of gene therapy on cardiac function.Advantages of NRCMs.NRCMs offer a number of advantages over other cell types for studying cardiac biology and function. These advantages include:High degree of differentiation: NRCMs are highly differentiated and exhibit many of the characteristics of adult cardiomyocytes.Spontaneous contractility: NRCMs exhibit spontaneous contractions, which makes it possible to study cardiac function without the use of electrical stimulation.Response to pharmacological agents: NRCMs respond to pharmacological agents in a manner similar to adult cardiomyocytes, which makes them a good model system for studying the effects of drugs on cardiac function.Easy to isolate and culture: NRCMs are relatively easy to isolate and culture, which makes them a cost-effective and convenient model system.Disadvantages of NRCMs.NRCMs also have some disadvantages, including:Limited lifespan: NRCMs can only be cultured for up to 4 weeks, which limits their use for long-term studies.Loss of differentiated characteristics: NRCMs begin to lose their differentiated characteristics after 2-3 weeks in culture, which limits their use for studying chronic cardiac diseases.Variability between preparations: The isolation and culture conditions can affect the properties of NRCMs, which can lead to variability between preparations.中文回答：新生大鼠原代心肌细胞——分离与培养。
乔松素对缺氧复氧诱导大鼠心肌细胞
乔松素对缺氧/复氧诱导大鼠心肌细胞焦亡的预防作用及其机制张威，卢小伟，许浩湖北医药学院附属国药东风总医院心血管内科，湖北十堰442008摘要：目的 观察乔松素（PIN）对缺氧/复氧（H/R）诱导的大鼠心肌细胞焦亡的预防作用，并探讨其预防作用机制。
方法 将大鼠心肌细胞H9c2分为PIN-H + 740-Y-P组、PIN-H组、PIN-L组、模型组、对照组。
PIN-H + 740-Y-P 组用加入25 µmol/L PIN + 50 µg/mL 740-Y-P的培养基、PIN-H组用加入25 µmol/L PIN的培养基、PIN-L组用加入12.5 µmol/L PIN的培养基、模型组用空白培养基培养1 h之后进行H/R处理。
对照组仅用空白培养基培养。
取上述各组细胞继续培养24、48、72 h，采用CCK-8法测定细胞活力；取上述各组细胞，采用碘化吡啶（PI）染色法测算各组心肌细胞焦亡比例，ELISA法测定细胞中LDH，Western blotting法检测细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、核因子-κB（NF-κB）蛋白和细胞焦亡相关蛋白（Caspase-1、ASC和NLRP3蛋白），荧光定量PCR法测定细胞中PI3K、AKT、NF-κB mRNA。
结果 与对照组相比，模型组细胞活力（48 h、72 h）下降（P均<0.05）；焦亡心肌细胞比例，LDH水平， Caspase-1、ASC和NLRP3蛋白相对表达量，PI3K、Akt、NF-κB p65蛋白的磷酸化水平及PI3K、Akt、NF-κB mRNA相对表达量升高（P均<0.05）。
与模型组相比，PIN-H组细胞活力（48 h、72 h）上升（P均<0.05）；心肌细胞焦亡比例，LDH水平， Caspase-1、ASC和NLRP3蛋白相对表达量，PI3K、Akt、NF-κB p65蛋白的磷酸化水平及PI3K、Akt、NF-κB mRNA相对表达量下降（P均<0.05）。
新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化与改进
新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化与改进摘要：目的：改良sd大鼠乳鼠心肌细胞培养的条件和方法，以分离得到更高纯度和存活率的心肌细胞。
方法：取出生1～3d内sd 大鼠的心室组织，采用胰蛋白酶和i型胶原酶多次消化心肌，差速贴壁培养2h，加brdu抑制成纤维细胞进行纯化培养，并在生物倒置显微镜下观察形态学变化，培养72h后，用免疫组化法检测纯度。
培养5、7、15、20、30d时，用台盼蓝染色法检测存活率。
结果：培养24h左右的细胞之间形成交联并有搏动，培养72h的心肌细胞的纯度为98.2%，培养15d内存活率大于95.0%。
结论：本实验应用改良并简化的心肌细胞培养方法可得到纯度和存活率较高的原代乳鼠心肌细胞，适合进一步推广。
关键词：sd大鼠乳鼠心肌细胞原代培养doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.07.023【中图分类号】r4 【文献标识码】a 【文章编号】1671-8801（2013）07-0025-02体外培养的大鼠心肌细胞保留了基本结构和功能，不受体内神经、体液等的影响，被广泛用于心血管生物学、细胞电生理、药理毒理学等研究，足够纯度和活力的心肌细胞是保证完成这些实验的基础[1]。
文献报道的心肌细胞培养的方法很多，但都较为复杂，导致培养得到的心肌细胞纯度、活力各不相同[2]。
本研究结合前人的经验，对新生sd大鼠的心肌细胞原代培养方法进行了简化，以期培养出纯度较高、活力较强的大鼠心肌细胞。
1 材料和方法1.1 材料。
1.1.1 实验动物。
出生1～3d的sd大鼠，雌雄不拘，由南昌大学实验动物科学部提供。
1.1.2 材料与试剂。
dmem/f12干粉培养基（df培养基）、小牛血清、d-hank’s液，5-溴脱氧尿嘧啶（brdu）、i型胶原酶购自sigma 公司；小鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体（α-sa），山羊抗小鼠igg购于武汉博士德微生物工程有限公司。
其余试剂均为国产分析纯。
大鼠心肌细胞内游离钙的Fura-2荧光测定
大鼠心肌细胞内游离钙的Ｆｕｒａ一２荧光测定 赵 艳 （辽宁医学院科学实验中心，辽宁锦州１２１００１）
【中图分类号】 Ｑ５ｏ３ 【文献标识码】 Ｂ Ｆｕｒａ一２的化学名为２一［６一双乙酸基一５一（２一双 乙酸氨基）一５一甲苯氧乙氧基］一２一苯骈呋喃基一５一恶 唑羧酸五钾盐。属于第二代荧光指示剂，是测定细胞内游 离钙的重要试剂…。用Ｃａ“荧光指示剂Ｆｕｒａ一２检测活细 胞胞浆中［Ｃａ２ ］ｉ是十几年来兴起的－ＶＩ技术，已广泛应 用于细胞生理、病理的研究，已有文献报道应用于测定细 胞 Ｊ、组织块 等内的游离钙。应用本院的９７０ＣＲＴ荧光 分光光度计，根据本院的实验条件，本研究建立了用Ｆｕｒａ 一２双波长荧光法测定心肌细胞内游离钙的方法。 １材料与方法 １．１ 仪器与试剂９７０ＣＲＴ荧光分光光度计（上海分析仪 器总厂），ＩＧＯ１５０型ＣＯ２培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃｏｒｐｏｒａ— ｔｉｏｎ），６０１超级恒温水浴孵箱（江苏省金坛市医疗仪器 厂），ＴＤＺ５一ＷＳ小型离心机（北京光学仪器厂）。 Ｆｕｒａ一２／ＡＭ、ＤＭＥＭ、１：２５０胰蛋白酶购于ＳＩＧＭＡ公 司；ＴｒｉｔｏｎＸ一１００、ＥＤＴＡ购于上海华美；小牛血清购于北 京元亨圣马生物技术研究所；其它试剂均为国产分析纯。 １．２实验方法 １．２．１实验原理Ｆｕｒａ一２具有较强的亲水性，不易透过细 胞膜，但能与Ｃａ 特异性结合，在特定波长的紫外光激发下 产生荧光，乙酰羧基甲基酯（Ａｃｅｔｏｘｙ—Ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ，ＡＭ）具有 亲酯性，可透过细胞膜进入细胞。细胞质中的酯酶可将Ｆｕｒａ 一２／ＡＭ水解为游离的Ｆｕｒａ一２，Ｆｕｒａ一２与细胞内游离的 Ｃａ 结合形成Ｆｕｒａ一２一Ｃａ 复合物，Ｆｕｒａ一２及其与Ｃａ２ 结合的复合物其最大激发波长分别为３８０ｎｍ和３４０ｎｍ，其发 射光的强度与Ｃａ２ 浓度呈比例，胞浆Ｃａ２ 浓度愈高，Ｆｕｒａ一２ 与Ｃａ 形成的螯合物愈多，在３４０ｎｍ激发波长处产生的荧 光（Ｆ３４ＪＤ）愈强，而在３８０ｎｍ激发波长处产生的荧光（Ｆ３８０） 愈弱，因此Ｆ３４０／Ｆ３８０可以反映胞浆Ｃａ 浓度。 １．２．２心肌细胞悬液的制备取出生２—３天的ＳＤ大鼠， 开胸取出心脏，用Ｈａｎｋｓ液洗涤３次后，剪成１ｍｍ 的小 块，放入５０ｍＬ三角烧瓶，加入０．０８％胰蛋白酶消化液 ５ｍＬ，在磁力搅拌器上（３５—３７℃）进行消化，１０ｍｉｎ后取 下吹打混匀后静置，吸弃上清，再加入５ｍＬ胰蛋白酶消化 液，同样温度消化５～８ｒａｉｎ后取下静置，收集上清于离心 管，并向管中加入少量ＤＭＥＭ培养基及小牛血清终止消化。 重复以上过程４—６次，直至将组织块消化，细胞分离完 全，以１２８ｇ离心８—１０ｍｉｎ，吸弃上清液，加入１５％小牛血 清的ＤＭＥＭ培养基（含庆大霉素４万Ｕ／Ｌ）混悬沉淀的细 【文章编号】 １０００—５１６１（２００７）０３—００８２—０２ 胞，以２００钼钢网过滤后置入ＣＯ 培养箱，３７℃静置培养 １．５—２ｈ，以差速贴壁法纯化心肌细胞。将细胞密度调至２ ×１０ 个／ｍＬ，０．４％台盼兰染色，活细胞比率大于９０％， 接种于含无菌载玻片的２４孔培养板中，送入通以５％ＣＯ 的ＣＯ 孵箱中培养，培养２４—３６ｈ。 １．２．３ Ｆｕｒａ一２／ＡＭ的负载去除长有心肌细胞的载玻片孔 内的培养基，加入０．２５％Ｆｕｒａ一２／ＡＭ使其终浓度为５￣ｍｏｌ／ Ｌ，含０．２％小牛血清的培养基２００１ｘＬ，ＣＯ２孵育箱中３７℃孵育 ４０ｍｉｎ，负载完毕后，将细胞用胰酶消化下来，离心１０ｍｉｎ （１００ｇ／ｒａｉｎ），去上清，用Ｈａｎｋｓ液冲洗２—３次，除去细胞外的 Ｆｕｒａ一２／ＡＭ，重新悬浮成１×１０ ￣＇／ｍＬ细胞浓度待用。 １．２．４测定细胞悬液的荧光荧光测定采用９７０ＣＲＴ荧光 分光光度计，测定条件：激发狭缝与发射狭缝均为ｌＯｎｍ， 灵敏度为２，扫描速度为最快。（１）先扫描测定Ｆｕｒａ一２／ ＡＭ标准液、负载液及测定细胞内Ｆｕｒａ一２的激发光谱和发 射光谱，Ｆｕｒａ一２／ＡＭ无Ｃａ２ 结合能力，其激发波长和发射 波长在加入Ｃａ 前后变化不大，最大发射波长为４９０ｎｍ， 最大激发波长为３８０ｎｍ，负载液的荧光光谱基本上同于此。 Ｆｕｒａ一２与细胞内游离的Ｃａ２ 结合形成Ｆｕｒａ一２一Ｃａ”复合 物，最大激发波长从３８０ｎｍ漂移到３４０ｎｍ。固定发射波长 ４９０ｎｍ，测定激发波长３４０／３８０ｎｍ的荧光值。 （２）加入 １０％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００，使终浓度为０．１％，破坏细胞膜，半小 时后上机检测最大值，检测３４０ｎｍ、３８０ｎｍ两个波长处的 值。（３）加入ＥＤＴＡ，使终浓度为５ｍｍｏｌ／Ｌ，络合所有的钙 离子，使Ｆｕｒａ一２呈游离状态，半小时后上机检测最小值， 检测３４０ｎｍ、３８０ｎｍ两个波长处的值。 １．２．５钙离子浓度的计算上面测得的是相对值，由下列 公式计算［Ｃａ ］ｉ，［Ｃａ ］ｉ＝Ｋｄ（ＦＤ／Ｆｓ）×（Ｒ—Ｒｍｉｎ／Ｒｍａｘ
豚鼠心肌细胞急性酶分离方法
豚鼠心肌细胞急性酶分离方法
周亮;曾晓荣;杨艳;刘智飞;李妙龄;裴杰
【期刊名称】《四川生理科学杂志》
【年(卷),期】2000(022)002
【摘要】用于膜片钳实验的细胞必须具备细胞膜完整、表面光洁、活性良好。
这类细胞既可以通过原代培养方式获得，也可通过急性酶分离方法获得。
细胞情况如何是膜片钳实验是否成功的第一个关键性步骤。
本研究总结多年的经验摸索出一套行之有效的豚鼠心肌细胞分离方法，具体步骤如下：
【总页数】2页(P35-36)
【作者】周亮;曾晓荣;杨艳;刘智飞;李妙龄;裴杰
【作者单位】泸州医学院心血管医学研究所心肌电生理研究室泸州 646000;泸州医学院心血管医学研究所心肌电生理研究室泸州 646000;泸州医学院心血管医学研究所心肌电生理研究室泸州 646000;泸州医学院心血管医学研究所心肌电生理研究室泸州 646000;泸州医学院心血管医学研究所心肌电生理研究室泸州 646000;泸州医学院心血管医学研究所心肌电生理研究室泸州 646000
【正文语种】中文
【中图分类】R3
【相关文献】
1.大鼠心肌细胞急性分离方法及影响因素探讨 [J], 任静娜;马宏昕;饶本龙;许正新
2.一种有效急性酶分离大鼠心肌细胞及复钙的方法 [J], 程俊;曾晓荣;谭晓秋;李鹏
云;文静;毛亮;杨艳
3.豚鼠心肌细胞分离方法及电生理特性的观察 [J], 宋建国;侯月梅
4.一种适用于膜片钳研究的豚鼠心室肌细胞急性分离方法 [J], 张艳;董献红;李新强;李晓娟;李东亮
5.成年大鼠心肌细胞的急性分离方法 [J], 韦丽兰;莫书荣
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文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持. 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 成年大鼠心肌细胞分离方法 【摘要】 目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。 【关键词】 大鼠; 心肌细胞; 细胞分离 【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rodshaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be 文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持. 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. isolated well with the above methods. 【KEY WORDS】 Rat; Cardiomyocytes; Cell Separation 心肌细胞不仅保存了心肌结构和功能上的某些特点,同时去除了体内各种限制因素的影响,作为实验工具,具有简便、精确、重复性好等优点,已成为研究心肌结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工具。目前乳鼠心肌细胞的分离方法比较成熟，但是由于未成熟心肌细胞和成熟心肌细胞的差异性使得大量来自于未成熟心肌细胞实验的结论难以用于成熟心肌细胞。特别是近年来, 随着心肌细胞电生理和分子生物学研究的兴起，成熟心肌细胞越来越多的应用于心血管病理生理的研究。目前分离成熟心肌细胞应用较多的是Langendorff 灌流胶原酶消化法，但是它消化下来的是整个心脏的心肌细胞，如果我们只想了解部分心肌细胞功能时就显示出其局限性，我们根据文献的方法加以改进，探讨三种简单、快捷的成年大鼠心肌细胞分离方法，为研究心肌细胞生理和病理特性提供了有用的实验模型。 1 材料与方法 1.1 酶消化法 1.1.1 动物 健康雄性Wister大鼠（200～300g），军事医学科学卫生与环境医学研究所提供。 1.1.2 试剂 0. 1%胰蛋白酶（GIBCO）, 0. 1%胶原酶Ⅰ(GIBCO) (两种酶均用DHanks 液配制成0. 1 %的液体,经正压过滤除菌,pH7. 2, - 20 ℃保存)，DHanks 液（g/L）（NaCl 8.0, KCl 0.4,Na2HPO4 0.7，H2O 0.06, KH2PO4 0.06,NaHCO3 0.35）,用双蒸去离子水配制，pH7.2,文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持. 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 高压蒸气灭菌,4 ℃保存。培养液[10%DMEM(GIBCO) 干粉,由双蒸去离子水配置液体]正压过滤除菌,pH7. 2～7. 4, - 20 ℃保存。 1.1.3 主要器材 光学显微镜(Olympus),超净工作台(苏州净化设备有限公司),FA21045N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司) 1.1.4 心肌细胞分离 大鼠用25%乌拉坦（1.0g/kg）腹腔注射麻醉，取适量待测心肌组织（下列操作均除水浴和离心外均在超净工作台内进行）立即放入预冷的DHanks 液中,冲洗3次。将心室肌用眼科剪剪成1 mm3 大小组织块,然后加入0. 1 %胰蛋白酶溶液10 ml,37 ℃水浴8min 后,吸取上层混悬液移弃。再加入0. 1 %胶原酶溶液15ml，37 ℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min 后,吸取上层混悬液，放在预冷10%DMEM中终止反应。剩余沉淀物再加0. 1%胶原酶溶液15ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min后, 吸取全部液体，终止反应。混悬液用200目孔径不锈钢网过滤除去未消化组织,在室温下800～1000转/min离心3～5min，弃上清，沉淀加入培养液2ml,混匀。 1.2 程序冷冻后机械法 1.2.1 动物 同上。 1.2.2 试剂 DMEM (GIBCO)，Ficoll(Pharmacia) ，KrebsHenseleit 缓冲液（mM）（NaCl 118, KCl4.8, MgSO41.2 ，KH2PO41.2, NaHCO325,Glucose 11，pH7.4），蒸馏水溶解后，经0.22μm滤膜抽滤消毒，备用。0.1M PBS（mM）（NaCl 138, KCl 2.7, KH2PO41.2,Na2PO4 8.1，pH7.4）, 蒸馏水溶解后，高压蒸汽消毒，备文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持. 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 用。 1. 2.3 主要仪器 FA21045N 型电子天平(上海精密科学仪器有限公司), B600型离心机（白洋离心机厂），光学显微镜（Olympus）等。 1.2.4 心肌细胞的分离 大鼠麻醉后，开胸迅速取心脏，将待测部分左心室放在60%甘油的DMEM的冻存管中，程序冷冻，最后保存于液氮中备用（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）。从液氮中取出保存的心脏，迅速放入40℃水浴中解冻。用DMEM清洗心脏，将左心室剪碎成1mm3的小块，于KH液中吹打10min以分离心肌细胞，必要时可重复一次。将含心肌细胞的溶液用100目网筛过滤，800转/min离心5min，0.1MPBS清洗两次，800转/min离心。将沉淀轻轻加入4%的Ficoll上，400转/min离心4min，弃上清，沉淀即为高纯度的杆状心肌细胞。 1.3 酒精和多聚甲醛固定后机械法 1.3.1 动物 同上。 1.3.2 主要仪器 100目、300目筛子，眼科剪刀，眼科镊子，平皿，离心机等。 1.3.3 单细胞悬液的制备 将待测心肌组织用生理盐水冲洗后置于70%酒精和4%多聚甲醛溶液(0. 1M pH7. 4)固定，4℃冰箱保存备用。将酒精固定的组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤以去除细胞团块，收集细胞悬液，以500～800转/min离心沉淀2min。时间允许文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持. 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 也可以在取下组织后立即进行悬液的制备，然后用70%冷乙醇固定备用。 1.4 心肌细胞的观察和评价 分离的心肌细胞置于显微镜下进行形态学观察, 结合0.4%台盼蓝染色评价心肌细胞活性,计数活性细胞比例。 2 结果 本方法可获得70%～80%具有活性的成年大鼠心室肌细胞(图1～3)。新分离的存活单个成年大鼠心室肌细胞呈杆状或矩形, 横纹清晰, 菱角分明, 长宽比约4～5∶1。由于活性细胞的细胞膜完整, 所以台盼蓝不能进入细胞内而拒染。死亡或损伤严重的心肌细胞呈团块状, 由于细胞膜缺乏完整性, 被台盼蓝染成蓝色。 2007年2月李淑娟等：成年大鼠心肌细胞分离方法第1期2007年2月河北北方学院学报（医学版）第1期图1 成年大鼠心室肌细胞图2 成年大鼠心室肌细胞图3 成年大鼠心室肌细胞 （图1～3新分离的心肌细胞呈长杆状，长宽比大约为4～5∶1，数量多，横纹明显。） 3 讨论 目前分离心肌细胞的方法主要有酶消化法和机械收集法。文献报道最多的是Langendorff逆行主动脉灌注酶溶液消化的方法,但由于技术条件要求较高,收获细胞的质和量差异较大,尤其在我国进行成熟心肌细胞分离培养的单位尚少,成功率也较低，而且它消化下来的是整个心脏的心肌细胞，如果我们只对处理过的局部心肌细胞感兴趣，这就显示出它的局限性，比如在对部分缺血处理过的心肌细胞用流式细