质粒DNA的提取—碱变性提取法
质粒DNA的提取及浓度判定
1. 目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒 DNA的提取、测定，学习用 碱变性法提取质粒DNA的方 法，了解用分光光度计测定 DNA含量的方法。
2. 相关知识及原理
质粒(Plasmid) 质粒(Plasmid) ：
独立于染色体外的， 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传 的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 DNA分子 的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物 细胞中，在细菌细胞中最多。 细胞中，在细菌细胞中最多。
4. 加入 加入150 µ l乙酸钾溶液 溶液 ，加盖后颠倒 乙酸钾溶液(溶液 乙酸钾溶液 溶液II)，加盖后颠倒67次混匀，冰上放置5min; 次混匀， 次混匀 5. 用台式高速离心机，10000r/min离心 用台式高速离心机， 离心7min，上 离心 ， 清移入另一干净离心管，并加1ml 100％乙醇混 清移入另一干净离心管，并加 ％ 离心5min，弃去上清液 匀，12000r/min离心 离心 ，弃去上清液; 6. 沉淀用0.5ml 70％乙醇清洗一次， 12000r/min 沉淀用 ％乙醇清洗一次， 离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上 离心 ，弃去上清液， 除尽乙醇，室温自然干燥; ，除尽乙醇，室温自然干燥 7. 加入 加入30-50µl含有 µg/ml RNase的灭菌蒸馏水 µ 含有 含有20µ 的灭菌蒸馏水 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min 或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置 充分溶解(有时需要酚 氯仿抽提); ，使DNA充分溶解 有时需要酚 氯仿抽提 充分溶解 有时需要酚:氯仿抽提 8. 将分离出的质粒 将分离出的质粒DNA置于 ℃保存备用。 置于-20℃保存备用。 置于
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取方案一常规小量提取(碱裂解法)【实验目的】(1)掌握碱裂解法小量提取质粒DNA的原理及操作过程。
(2)掌握微量加样器的使用方法。
【实验原理】在NaOH存在的碱性环境(pH值12.0～12.6)中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA由于分子量小且缠绕紧密，仍为自然状态。
将pH值调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA恢复可溶状态的。
通过离心，去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质等物质，上清液中的质粒DNA可用酚/氯仿抽提。
【实验试剂】(1)溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl(pH值8.0)10mmol/LEDTA(pH值8.0)溶液I可成比配制，每瓶约100ml,在6.9×10°Pa(10lbf/in²)高压下蒸汽灭菌15min,贮存于4℃下。
(2)溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液稀释)1%SDS(3)溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml(4)酚(pH值7.8～8.0)。
(5)氯仿。
(6)TE缓冲液。
(7)6×DNA上样缓冲液。
(8)0.8%琼脂糖。
(9)无水乙醇。
【实验器材】(1)低温高速离心机。
(2)旋涡振荡器。
(3)Eppendorf管(EP管)。
(4)微量移液器。
(5)移液器头。
(6)电泳仪与电泳槽。
(7)紫外透射仪。
【实验样本】细菌(含某种质粒)。
【实验步骤】(1)将5ml菌液分次装入同一1.5mlEP管中，3000r/min离心5min,以收集菌体。
(2)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡5min。
(3)加200μl新配制的溶液Ⅱ,盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，不可强烈振荡，放置于冰上3min左右。
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。
该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。
反复数次，收集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
质粒DNA的提取实验
实验六质粒DNA的提取一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒二、实验原理质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。
它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS （十二烷基硫酸钠）包盖。
当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
三、实验材料与试剂1、实验材料大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T）2、实验试剂(1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；(2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；(3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；(4) 氯仿－异戊醇（24：1）；(5) 异丙醇、70%乙醇；四、实验步骤（一）提取质粒1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。
（由老师完成）2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。
3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm 离心1min。
4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。
质粒DNA的提取和PCR技术
试剂准备 ：
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和离子 抑制DNase活性 高压灭菌15min ，贮存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与SDS
溶液二中NaOH不要暴露在空气中太久。可能会与空气中的CO2 与 NaOH作用,减弱了条
带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提 得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的 带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。
反应参数要素： 反应参数要素
1。PCR反应五要素
（1）Taq酶：酶量：催化一典型的PCR反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特 异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。保真性： rTaq-1~2kbp,LaTaq-~20kbp,Pfu（Pyrobest）-. 吸取时注意，保存在甘油中故比较粘稠。 （2）dNTP的质量与浓度 ：在PCR反应中，一般反应 中每种dNTP的终浓度为20-200µmol/L 。4种dNTP的 浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同 于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。 （3）模板；模板可以是DNA片断，基因组，质粒， 噬菌体，菌液等任何含DNA生物样品。可以是单链分 子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状 分子 一般反应中的模板数量为102 -105 拷贝。模板纯 化程度影响扩增效率。
注意问题：
1。防止核酸污染：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高
实验一 质粒DNA的提取(共25张PPT)
沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
结构的三大要素： • 多克隆位点
• 选择标记（耐药性，LacZ） • 独立的复制单位
种类：
• 质粒
• 噬菌体
• 酵母人工染色体（YAC）
• 反转录病毒载体 • 表达载体等
pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant
实验目的
了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法；
掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。
实验原理
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复 制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小 型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室 常用的方法。
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与 线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离 它们。
在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。
2. 溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）；Tris·HCl（ 25mmol/L， ）； （10mmol/L） 3. 溶液Ⅱ： NaOH （） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 4. 溶液Ⅲ： 60ml的 5mol/L KAC ； 的冰醋酸 ； 28.5ml H2O
溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使DNA复性。但是 质粒DNA与染色体DNA复性的速度不同。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质 形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，
质粒DNA的提取及浓度测定PPT课件
8
载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复 制与表达的质粒(运载工具)。
10b
碱基对 10,002
8,001 6,001 5,001 4,001 3,001 2,000 1,500 1,000
517 500
质量 42 ng 42 ng 50 ng 42 ng 33 ng 125 ng 48 ng 36 ng 42 ng 42 ng* 42 ng*
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5. 实验报告 1)目的与要求 2)实验原理 3)材料与方法 4)结果与讨论
ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts.
•E. coli replication origin: pUC
•Copy number: ~500
17
Insert
EcoR1 1.9kb
Xho1
pCMV-Myc-T10
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4. 步骤 A.质粒DNA的提取
碱裂解法
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5. 加入750l洗涤缓冲液于离心吸附柱中， 12000rpm离心1分钟。
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• 浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无 水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的DNA可 能被洗脱下来，影响回收效率。
6. A.重复步骤5一次；B.随后，再次于12000rpm空 管离心2分钟，尽量除去漂洗液。
• 洗涕时（即步骤5和6）一定要尽量除去漂洗液， 否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促 反应。必要时，可适当延长离心时间或者用Tip 头吸净。
质粒DNA的提取及浓度判定
• 为了充分除尽RNA的污染，可在提取的质粒中 加入0.5mlRNaseA（10mg/ml）。这并不影响其 他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来作 为测序模板和其他酶促反应。 • 若提取的质粒大于10Kb，在加入洗脱缓冲液后， 可在70℃水浴中放置3－5分钟，以确保质粒 DNA的完全洗脱。
B. 用分光光度计法定量DNA 1. 取2ml提取的质粒 DNA，加入98ml蒸 馏水对待测DNA样品做1:50(或更高 倍数的稀释); 2. 蒸 馏 水 作 为 空 白 , 在 波 长 260nm 、 280nm 处调节紫外分光光度计读数 至零。
8. 将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。
Biodev（博大泰克）质粒快速 提取试剂盒（plasmid rapid isolation kit）
碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。 使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液 中按1:3的比例加入无水乙醇。
操作步骤
1. • 收集1.5－3ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。 加入100ml溶液1，振荡至彻底悬浮。 为了获得高质量的质粒DNA，培养细菌的时 间不宜过长，一般为12小时； 细菌沉淀中加入溶液1后，一定要彻底悬浮， 否则抽提质粒DNA的纯度及得率会大大降低 加入150ml溶液2，立即轻柔颠倒离心管数次， 使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。 随后将离心管冰上放置1－2分钟（时间勿 超）。
2. 相关知识及原理
质粒(Plasmid) ：
独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传 的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物 细胞中，在细菌细胞中最多。
DNA超螺旋结构
细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类 群，其大小从1Kb-200Kb，它们复 制时利用宿主细胞复制自身基因组 DNA的同一组酶系。
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质粒DNA的提取—碱变性提取法实验目的：1．掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。
2．掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
仪器和材料；恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器；1.5ml离心管，50ml离心管；不同型号的的枪尖等。
菌体：E.coliDH5α受菌体，具有AMP r标记的质粒PUC19。
实验试剂：LB培养基，抗生素，溶液I，溶液II，溶液III，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚等。
试验原理：碱裂解法是较常用质粒的提取的方法。
其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。
该方法操作简单，易于操作,一般实验室均可进行。
十二烷基磺用于进行质粒的小量制备。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。
由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。
在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。
再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。
碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等.DNA粗提取所用的三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 M NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸；溶液I：任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
EDTA 是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果缺少溶液I，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
不过菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II：是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提法。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA 片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦。
溶液III：它加入后就会有大量的沉淀，大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS 的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。
这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被SDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
DNA分子在中性溶液中都是溶解的。
NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。
溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了SDS沉淀更充分一点。
试验准备：1、溶液Ｉ:pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；2、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1％的SDS)，这个用的时候需现配。
要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。
3、溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；4、异丙醇；采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。
5、pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTris－HCl，1mmol/L EDTA，其中含RNA 酶20ug/ml。
实验步骤1、配制LB液体培养基，灭菌枪尖（1000ul/200ul/20ul）、2个50ml离心管，吸管，三角瓶等。
2、把E.coliDH5α接种到含20mlLB和氨苄青霉素培养基中，在37摄氏度下，过夜培养。
（注意无菌操作，防止杂菌干扰试验。
）3、从摇床中取出过夜培养的细菌，轻轻混匀，取2-3ml菌液转接到含50ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃160r/min振荡培养过夜或至对数生长晚期。
（经过一夜的培养，液体培养基底部浑浊，菌体大量沉淀。
）4、先称量50ml灭菌离心管的质量m1，然后取一定量的菌体培养液于其中，7000rpm离心5min，弃上清液，收集菌体。
5、沉淀中加5ml用冰预冷的溶液I，充分混合（需要剧烈振荡）。
7000rpm离心5min，弃上清液，收集菌体。
离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。
称量其质量m2。
（m2-m1是菌体湿重，干燥时使离心管口向下，直到看不见液滴。
加入离心管前，混匀菌体。
加入溶液I时，一定要打散菌泥）。
6、按湿菌体质量：溶液I质量=100mg：1ml的比例加入用冰预冷的溶液I，剧烈震荡，使菌体完全分开。
冰浴5min。
（打散菌体可用吹吸助溶，或漩涡振荡器。
这一步主要是悬浮菌体）7、以二倍溶液I的体积量加入溶液II,慢慢颠倒，使之混匀（切勿剧烈震荡！），将离心管置于冰上5min,此时，溶液粘稠如蛋清。
（滴加溶液II时，要逐滴加入，且要轻振溶液使之混匀，整体动作要快，因为强碱在溶液中停留时间不能过长，它也会破坏质粒DNA，如果操作慢时，可适当减少冰浴时间。
G-细胞壁薄，所以强碱足以损坏细胞壁，不需要额外添加酶。
加入溶液II，轻振后，溶液变得粘稠。
）8、以1.5倍溶液I的体积加入冰浴后的溶液III，轻轻颠倒数次混匀，使之在粘稠的细菌裂解物中分布均匀，将离心管置于冰浴5 min 。
（加入溶液III后，生成了大量的絮状沉淀，在冰上静置后，沉淀沉在溶液底部。
溶液III中和强碱使质粒复性，不可剧烈震荡，可放冰上使它自己混匀。
）9、以4℃，12000rpm离心15min，取上清液于另一新离心管中。
（白色沉淀聚集在离心管一侧，上清液澄清。
取离心管时，不改变其倾斜度，斜着插进枪尖，切勿触碰下部沉淀，吸取时，计算上清液体积。
尽可能多的吸取上清液。
）10、向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃下沉降30分钟。
（加入上述溶液后，溶液变浑浊，不过浑浊程度明显小于加入溶液III。
高浓度的盐有利于质粒的沉降。
）11、以12000rpm离心15min，小心倒去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使所有的液体流出。
12、向DNA沉淀中加入70%冰乙醇5ml，以12000rpm离心5min，（离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。
）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上。
（加入乙醇时，不打散沉淀洗涤盐分。
枪尖深入离心管中，把液体打到沉淀的对面，然后转动离心管，使沉淀被液体覆盖。
离心时，小心放置离心管位置，不改变质粒沉降位置，沉淀面朝外。
粗提取的质粒呈浅黄色，随着水分的减少质粒变为无色。
所以为了完全溶解质粒，在离心管上标记质粒所在位置是必要的。
）13、将DNA沉淀溶于1mlTE缓冲液中，转移到一个Eppendorf管中，加入RNase A（纯浓度50ug/ml），37℃保温1小时。
（加入TE溶液溶解质粒时，可以用600ul溶解，400ul冲洗未完全转移的质粒。
吹吸助溶时，用黄色枪尖吸取溶液，打在刚刚标记的质粒位置的上面，由于质粒本身黏着，容易产生气泡，枪尖溶液快打完时，不要把枪尖插入溶液中。
加入酶后混匀溶液保温。
）14、将上述的溶液平均分配到2个1.5ml的微量离心管中，每管0.5ml，分别加入与溶液等体积的饱和苯酚溶液，振荡混匀，以4℃，7000rpm,离心5min，取上层水相到一洁净的Eppendorf管中。
（苯酚是经Tris饱和后的，显黄色。
苯酚加入后，溶液分层，苯酚向下，下层呈浅黄色，上层溶液无色，在中间产生大量白色沉淀，此为变性后的蛋白质。
通过两个离心管液体高度的比较，加入与原来溶液相同体积的苯酚。
苯酚加入后，放平离心管，混合均匀。
离心后，取离心管时不改变离心管的倾斜角度，用黄色枪尖吸取上层清液。
尽可能多的吸取上清液，但不要吸入蛋白质。
）15、加入等体积的苯酚/氯仿溶液（1:1），振荡混匀，以4℃，7000rpm,离心5min，取上清液到一洁净的Eppendorf管中。