实验动物微生物控制
《中国药典》2020版—生物制品实验动物质量控制
生物制品实验动物质量控制生物制品实验动物分为生物制品生产用实验动物和检定用实验动物。
生产用实验动物是指用于生物制品生产的实验动物，检定用动物则是用于生物制品检定的实验动物。
本通则是对生物制品生产用和检定用实验动物微生物与寄生虫学的质量控制要求。
实验动物的管理应符合国家相关要求。
一、实验动物微生物学等级分类按照实验动物携带微生物与寄生虫情况进行等级分类，分为普通级、清洁级、无特定病原体级和无菌级实验动物。
普通级实验动物[conventional (CV) animal]系指不携带所规定的重要人兽共患病和烈性传染病病原的实验动物。
清洁级实验动物[clean (CL) animal]系指不携带普通级实验动物的病原，并且不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体的实验动物。
无特定病原体级实验动物[specific pathogen free (SPF) animal]系指不携带普通级和清洁级实验动物的病原，并且不携带主要潜在感染或条件致病和对科学研究干扰大的病原体的实验动物。
无菌级实验动物[Germ Free (GF) animal]指无可检出的一切生命体的实验动物。
SPF 鸡胚是指由SPF 鸡所产的受精卵，在符合生物制品生产条件下，经孵化后所生成的鸡胚。
疫苗生产与检定应采用适宜级别的实验动物，具体应符合相关各论的要求。
二、检测要求1、外观要求实验动物应外观健康、无异常。
2、微生物与寄生虫学检测项目常用实验动物检测要求见表1-8。
必须检测项目，在日常检查时必须定期检测；必要时检测项目，在供应商评估或者怀疑有感染时进行检查，根据需要而定。
3、实验动物质量检测频率一般不少于 3 个月。
表 1 生物制品生产用、检定用小鼠微生物与寄生虫学检测项目Hantavirus (HV)Ectromelia Virus (Ect.)肝炎病毒Mouse Hepatitis仙台病毒 Sendai Virus (SV)小鼠肺炎病毒 Pneumonia Virus of Mice呼肠孤病毒Ⅲ型Reovirus type Ⅲ (Reo小鼠细小病毒 Minute Virus of Mice脑脊髓病毒Theiler ’。
实验动物的分级
．实验动物分级及其标准根据实验动物微生物控制标准，可将实验动物分为四级：一级普通动物（CV），系指微生物不受特殊控制的一般动物。
要求排除人兽共患病的病原体和积少数的实验动物烈性传染病的病原体。
为防止传染病，在实验动物饲养和繁殖时，要采取一定的措施，应保证其用于测试的结果具有反应的重现性（即无论不同的操作人员，在不同的时间，用同一品系的动物按规定的实验规程所做的实验，都能获得几乎相同的结果）。
二级清洁动物（CL），要求排除人兽共患病及动物主要传染病的病原体。
三级无特殊病原体动物（SPF），要求到二级外，还要排除一些规定的病原体。
其除菌与灭菌的方法，可使用高效空气过滤器除菌法、紫外线灭菌法、三甘醇蒸气喷雾法及氯化锂水溶液喷雾法。
四级无菌动物（GF）或悉生动物（GN）。
无菌动物要求不带有任何用现有方法可检出的微生物。
悉生动物要求在无菌动物体上植入一种或数种已知的微生物。
在病理学检查上，四类实验动物也有不同的病理检查标准。
一级外观健康，主要器官不应有病灶。
二级除一级指标外，显微镜检查无二级微生物病原的病变。
三级无特殊病原体动物。
无二、三级微生物病原的病变。
四级不含二、三级微生物病原的病变，脾、淋巴结是无菌动物组织学结构。
综合上述，对不同级别的实验动物在动物房设计上和管理上则有不同的要求。
无菌、已知菌以及无特殊病原体动物都需要在无菌或尽可能无菌的环境里饲养，这种环境，目前国际上通用称为屏障环境，即用一道屏障把动物与周围污染的环境隔开，就如胎鼠在母鼠子宫内一样。
这种环境从控制微生物的角度分为隔离系统、屏障系统、半屏障系统、开放系统和层流架系统等五大类。
A 隔离系统是在带有操作手套的容器中饲养动物的系统，用于饲养无菌动物和栖生动物。
内部保持按微生物要求的100级的洁净度，但其设置的房间及操作人员不必按无菌室考虑。
B 屏障系统把10000~100000级左右的无菌洁净室作为饲养室，主要用于无特殊病原体动物的长期饲养和繁殖。
第三章实验动物标准化
封闭群动物的遗传学特性
• 1、基因库大，杂合率高
封闭群是一种长期与外界隔离，雌雄个体间能够随即交 配的动物群，其遗传组成比较接近自然状态下的动物群体 结构，具有类似于人类群体遗传异质性的遗传组成。其基 因的杂合率较高，个体间的基因型不一致，因此，群体基 因库较近交系大。
封闭群动物的遗传学特性
• 2、群体基因频率基本保持稳定 封闭群动物不从其外部引入新基因，
4、长期的遗传稳定性
近交系动物的基因高度纯合，坚持近亲交配则增加其在特定部位纯合 子，减少了遗传变异，使动物的基因型可长期处于稳定状态，导致近交系动 物长期遗传稳定性。近交系动物的遗传变异仅发生在少量残留杂合基因，或 基因的突变，而这种机率非常低。
近交系动物的特性
5、个体性 每个品系在遗传上都是独特的，有些品系可能发生
• 间交：自交或称互交（Intercrosses）：亲代为两个杂合子交配。
近交系 Inbred strain
• 概念：近交系动物也叫纯系动物，是相同基因类型动物中 最主要的一种。它是经连续20代以上的全同胞兄妹或亲子 交配培育而成，且品系内所有个体都可追溯到起源于20代 或以后的一对共同祖先的遗传群体。
近交系动物的特性
7、 背景资料和数据完整性
近交系动物在培育和保种过程中都有详细记录，一些常用品系 具有相当数量的背景资料；有大量文献记载了各种品系的生物学特性。 这些有关品系的特征、寿命和自发性疾病等资料，对今后的研究工作 的设计和动物实验结果的解释提供便利条件。
8、可分辨性
每个近交系都有自己独特的生化标志基因。研究者在掌握了遗 传质量监测方法后，通过建立品系的遗传概貌，和定期的遗传检测， 可以分辨混杂在一起的两个，或两以上外貌近似的品系动物。
实验动物的微生物学、寄生虫学的检验检疫
实验动物的微生物学、寄生虫学的检验检疫一、实验动物的微生物学、寄生虫学质量控制分类根据国家标准GB14922.1和GB14922.2，我国实验动物按微生物和寄生虫学控制分类，分为四个等级，即：①普通级动物（Conventional Animal, CV）；②清洁级动物（Clean Animal, CL）；③无特定病原体级动物（Specific Pathogen Free Animal, SPF）；④无菌级动物（Germ Free Animal, GF）。
现行标准中，大小鼠无普通级，犬、猴无清洁级及无菌级。
二、实验动物的微生物学、寄生虫学质量监测如何控制微生物和寄生虫，是实验动物标准化的主要内容之一。
一般而言，实验动物中，其微生物学和寄生虫学的控制等级越高、不确定因素和干扰因素越少，其实验结果就越准确、越可靠。
（一）监测意义1. 保证实验研究的顺利进行和工作人员的身体健康在人工饲养环境中实验动物被集中饲养，由于活动空间相对狭小，动物繁殖快、数量多、互相影响大，当受到外界或动物间各种病原体感染时，极易导致传染病的发生与流行。
实验动物疾病的发生与流行，除造成动物死亡外，还会干扰实验的顺利进行，引起生物制品的污染，对人类健康产生危害。
2. 确保实验数据的准确性和可重复性定期对实验动物和动物实验的环境设施、饲料、垫料和饮水等的监测，为确保实验动物符合控制等级要求提供了基础；对各级实验动物群进行微生物学、寄生虫学监测，可以确定各级实验动物是否符合原定级别，有利于排除不确定因素，保证实验动物和动物实验的质量可控，从而确保实验数据的准确性和可重复性。
也可以对实验动物不应有的病原体的入侵，及早采取措施，以免疫情扩大，导致动物的死亡，实验的终止而造成更大的损失，（二）监测方法实验动物的微生物、寄生虫检测具体操作方法详见《国家标准实验动物微生物学和寄生虫学的检测方法>>(GB/T 14926.1-14926.64；GB/T 18448.1～18448.10 ),检测方法归纳起来有病原学检测和血清学检测。
动物实验学-名词解释
名词解释绪论1．实验动物：经人工饲育，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或来源清楚的，用于科研、教学、生产、检定以及其他科学实验的动物。
2．实验用动物：以研究、实验、教育、药品生产等为目的而使用的动物。
包括实验动物，野生动物，经济动物。
实验动物：驯化，育种，生理，解剖，生化，兽医，营养及环境生态等。
动物实验：研究动物对实验的反应，动物模型设计，实验方法改良提高等。
3．动物实验的3R原则♦1、减少〔Reduction)，在科学研究中，使用较少量的动物获得同样多的试验数据或使用一定数量的动物能获得更多实验数据。
在减少动物使用量的问题上，对不同的实验应采用不同的处理方式。
例如药品异常毒性实验。
“亮甲素”事件♦2、替代〔Replacement)，使用其他方法而不用动物所进行的试验或其他研究课题，以到达某一试验目的。
或者是使用没有知觉的试验材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎动物进行实验。
♦相对性替代，用人道方法处死动物或使用细胞、组织及器官进行体外实验研究，或用低等动物替代高等动物的实验方法；♦绝对性替代，在实验中完全不用动物。
♦3、优化〔Refinement)，在符合科学原则的基础上，通过改良条件，善待动物，提高动物福利；或完善实验程序和改良实验技术，防止或减轻给动物造成的与实验目的无关的疼痛和紧张不安。
♦优化包括实验动物和动物实验两个方面，涉及试验设计、实验技术、人员培训、饲养环境、动物运输等。
♦4．标准化实验动物质量控制，包括环境、微生物、遗传、营养四个方面内容。
微生物控制：基础/普通动物：不携带所规定的人畜共患病病原和动物烈性传染病病原的动物。
例如流行性出血热、弓形体、沙门氏菌、狂犬病毒等。
清洁动物：指普通动物应排除的病原外，还应不携带对动物健康危害和对科学研究干扰比较大的病原的动物SPF动物：无特定病原体动物，除清洁动物应排除的病原外，还应不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的动物。
实验动物微生物质量与动物实验
• 仙台病毒
• Mouse Hepatitis Virus
• 小鼠肺炎病毒
• Sendai Virus
• 呼肠孤病毒III型 • 小鼠细小病毒 • 小鼠脑脊髓炎病毒
• Pneumonia Virus of
Mice
• Reovirus type III • Minute Virus of mice 29
隔离环境
GF动物 植入 GN动物 污染 GF动物
植入
污染
屏障环境
SPF动物
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普通级动物 清洁级动物 SPF级动物
无菌动物 悉生动物
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不同微生物学等级的实验动物比较
项目 传染病 寄生虫 实验结果 应用动物数 长期实验效果 死亡率
长期实验存活率
实验标准设计 统计价值
实验结果的价值
GF 无 无 准确 少量 可能好 很低 约100％ 可能 很好 很高
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• 小鼠肝炎病毒(MHV)
属冠状病毒科，冠状病毒 属，与人冠状病毒 (普通感冒，或 肺炎)，大鼠冠状病毒 (新生大鼠 肺炎)，大鼠唾液腺病毒(唾液腺， 泪腺炎)同属。有多种毒株。
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• 消瘦肝炎病毒是实验小鼠重要的病
毒感染之一。呈现世界范围分布， 无明显的季节性。临床表现为肝炎， 脑炎和肠炎。
发育阶段分为五型：
• 滋养体和包囊出现在中间宿主体内， • 裂殖体，配子体和卵囊只出现在终
宿主－－猫体内。
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• 传播途径
• 任何动物食入弓形虫的包囊，卵囊或活体，
都能受到感染而患弓形虫病。猫科动物的粪 便中，常带有卵囊。可以污染草原、牧场、 蔬菜、水果等。猫的身上和口腔内常常有弓 形虫包囊和活体。直接接触猫易受感染。狗 的身上和口腔内常有包囊或活体，养狗的人 不小心可能感染。其他家畜、家禽，如：鸡、 鸭、鹅、猪、牛、马、羊等动物体内有时带 弓形虫包囊和活体。所以食用肉、蛋奶也可 能感染，鱼肉体内有时也有弓形虫包囊或活
实验动物与动物实验室的生物安全防护
一、流行性出血热 二、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎 三、狂犬病 四、猴B病毒病 五、弓形虫病 六、沙门氏菌病
与人类之间自然传播和感染疾病， 七、钩端螺旋体病
即人类和脊椎动物由共同病原体 八、结核分支杆菌病
引起，在流行病学上又有关联的 疾病。
九、志贺菌病 十、鼠痘 十一、兔出血症
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（一）流行性出血热
由流行性出血热病毒引起的主要发生于大鼠的烈性传染病
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（七）钩端螺旋体病
钩端螺旋体病(Leptospirosis)是一种重要而复杂的 人畜共患病和自然疫源性传染病。临床表现形式多样， 主要有发热、黄疸、血红蛋白尿、出血、流产、皮肤和 黏膜坏死、水肿等。
钩端螺旋体的动物宿主非常广泛，几乎所有温血 动物都可感染，其中啮齿目的鼠类是最重要的贮存宿主
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，也是一种人畜共患的自然疫源性传染病。1981年WHO统一命 名为肾综合征出血热（HFRS ）。 1、自然宿主：主要是小型啮齿动物，大鼠为实验动物型HFRS
的主要传染源。
2、传播：气溶胶吸入，人类主要接触宿主动物及排泄物而受感 染。
3、症状： 人：发热，头痛，肌肉痛，结膜水肿充血（点状）， 出血性肾损伤（肾综合症出血热），最后肾衰竭，出现尿毒 症，严重可导致死亡。大鼠：多为隐性感染，长期排毒，一 般无临床症状，也不死亡。一般不影响实验进程。
（八）结核分支杆菌病
由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引
起的人和动物共患的一种细菌性疾病。人感染后形成
结核病，猴、犬、豚鼠、兔和猫等均可感染，以猴发
病率最高。
（九）志贺菌病
由志贺菌(Shigella spp)或称痢疾杆菌引起人和实
验动物肠道感染的一种细菌性疾病。人和猴以细菌性
实验动物屏障系统的结构及其控制要求
昼夜明暗交替时间，h
屏障系统进出管理 1.人员
整理 头发 门禁
脱鞋
进入一更，填写进入记录 风淋60秒钟 （自动设定）
清净手及消毒
进入二更，穿上净化服， 戴口罩和手套 出动物房 风淋室 （打开风淋）
脱下净化服
进入动物房 进行操作 填写出动 物房时间
二更
进入一更
注意： • 随手关门，动物房任何时候都不允许两道门同时打开 • 在动物房内，绝不允许裸手与小鼠接触
屏障设施环境指标（静态）
项 温度，℃ 相对湿度，％ 换气次数， 次／h 气流速度， m/s 压强梯度， Pa 空气洁净度， 级 落下菌数，个／皿 ≤ 氨浓度，mg/m3 ≤ 噪声，dB 照度，lx ≤ 工作照度 动物照度 目 指 标 20-26 40～70 10～20* 0.1～0.2 20～50** 10000 3 14 60 150～300 15～20 12/12或10/14
1.温度
表1 同环境温度时戊巴比妥钠给药导致大鼠死亡率比较
环境温度（度） 给药动物数（只） 死亡动物数（只） 死亡率（%） 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 10 10 10 10 7 6 11 16 100 100 100 50 50 50 50 35 30 55 80
4. 噪声及其来源
噪声对实验动物的影响
（1）影响神经及心血管等系统功能
（2）影响消化及内分泌系统功能
（3）影响幼小动物生存
噪声控制要求：≦60dB
5. 空气洁净度 气体污染 ：NH3 （≦14mg/m3 ）、SH2 颗粒物污染: 粉尘 气溶胶 6. 通风和换气 换气频率： 10-20次/h 气流速度： 0.1-0.2m/s 7. 压差梯度： 20-50Pa 8. 动物的种间影响
实验动物分级及其标准
．实验动物分级及其标准根据实验动物微生物控制标准，可将实验动物分为四级：一级普通动物（CV），系指微生物不受特殊控制的一般动物。
要求排除人兽共患病的病原体和积少数的实验动物烈性传染病的病原体。
为防止传染病，在实验动物饲养和繁殖时，要采取一定的措施，应保证其用于测试的结果具有反应的重现性（即无论不同的操作人员，在不同的时间，用同一品系的动物按规定的实验规程所做的实验，都能获得几乎相同的结果）。
二级清洁动物（CL），要求排除人兽共患病及动物主要传染病的病原体。
三级无特殊病原体动物（SPF），要求到二级外，还要排除一些规定的病原体。
其除菌与灭菌的方法，可使用高效空气过滤器除菌法、紫外线灭菌法、三甘醇蒸气喷雾法及氯化锂水溶液喷雾法。
四级无菌动物（GF）或悉生动物（GN）。
无菌动物要求不带有任何用现有方法可检出的微生物。
悉生动物要求在无菌动物体上植入一种或数种已知的微生物。
在病理学检查上，四类实验动物也有不同的病理检查标准。
一级外观健康，主要器官不应有病灶。
二级除一级指标外，显微镜检查无二级微生物病原的病变。
三级无特殊病原体动物。
无二、三级微生物病原的病变。
四级不含二、三级微生物病原的病变，脾、淋巴结是无菌动物组织学结构。
综合上述，对不同级别的实验动物在动物房设计上和管理上则有不同的要求。
无菌、已知菌以及无特殊病原体动物都需要在无菌或尽可能无菌的环境里饲养，这种环境，目前国际上通用称为屏障环境，即用一道屏障把动物与周围污染的环境隔开，就如胎鼠在母鼠子宫内一样。
这种环境从控制微生物的角度分为隔离系统、屏障系统、半屏障系统、开放系统和层流架系统等五大类。
A 隔离系统是在带有操作手套的容器中饲养动物的系统，用于饲养无菌动物和栖生动物。
内部保持按微生物要求的100级的洁净度，但其设置的房间及操作人员不必按无菌室考虑。
B 屏障系统把10000~100000级左右的无菌洁净室作为饲养室，主要用于无特殊病原体动物的长期饲养和繁殖。
03-中英-医学实验动物学-实验动物质量控制-02-微生物及寄生虫质量控制
Dogs、monkeys:
grade 1、3
1、无菌动物
Germfree animal
无菌剖腹产胎儿 Sterile caesarean fetus
隔离系统
无菌隔离器 一切物品高压灭菌
空气高效过滤
Isolation system
aseptic isolator sterilizing all articles under high pressure;
➢ （7）放线菌：主要是衣氏放线菌，常存于正常人口腔、 咽部和扁桃体中，可侵入组织引起慢性化脓性炎症。皮肤 ，伤口感染。(7) Actinomycetes: mainly Actinomycetes linii , which often exists in the mouth, pharynx and tonsil of nor mal people, and can cause chronic suppurative inflammatio n in invading tissues. Skin, wound infection.
➢ （4）衣原体：广泛寄生于人类、禽类及哺乳动物体内，对 某些抗生素敏感。砂眼衣原体、肺炎衣原体等。沙眼，泌 尿生殖道感染。(4) Chlamydia: widely parasitic in humans, b irds and mammals, sensitive to certain antibiotics. Chlamydi a trachomatis, chlamydia pneumoniae, etc. Trachoma, uroge nital tract infection
原体动物
Clean conventional animal CCVA,清洁普通动物＝ Clean animal，CL，清洁动物