肺炎链球菌的微生物学检验方法与原理
微生物细菌实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解细菌的基本形态结构。
2. 掌握细菌的分离、纯化和鉴定方法。
3. 学习细菌生理生化反应的检测原理和应用。
二、实验原理细菌是单细胞微生物，具有典型的原核细胞结构。
通过观察细菌的形态、染色和生理生化反应，可以鉴定细菌的种类。
三、实验材料与仪器1. 材料：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等纯菌株。
2. 仪器：显微镜、接种环、培养皿、酒精灯、无菌水、生理盐水、革兰氏染色液、生理生化试剂等。
四、实验方法1. 细菌形态观察- 将细菌涂布在载玻片上，进行革兰氏染色。
- 使用显微镜观察细菌的形态、大小、染色性等特征。
2. 细菌分离与纯化- 将纯菌株接种于琼脂平板，进行划线分离。
- 观察菌落特征，挑选单菌落进行纯化。
3. 细菌生理生化反应检测- 进行糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验、V-P试验等。
- 观察反应结果，判断细菌的生理生化特性。
五、实验结果与分析1. 细菌形态观察- 大肠杆菌：革兰氏阴性，呈杆状，两端钝圆。
- 金黄色葡萄球菌：革兰氏阳性，呈球形，呈葡萄串状排列。
- 肺炎克雷伯菌：革兰氏阴性，呈短杆状，两端钝圆。
2. 细菌分离与纯化- 划线分离后，观察到单菌落形成。
3. 细菌生理生化反应检测- 糖发酵试验：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均能发酵葡萄糖。
- 吲哚试验：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均呈阳性。
- 甲基红试验：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均呈阳性。
- V-P试验：金黄色葡萄球菌呈阳性，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌均呈阴性。
六、讨论与分析1. 通过观察细菌的形态、染色和生理生化反应，可以初步鉴定细菌的种类。
2. 细菌的生理生化反应具有特异性，可用于细菌的鉴定和分类。
3. 在实际应用中，细菌的分离、纯化和鉴定是微生物学研究和临床诊断的重要环节。
七、实验结论1. 通过本次实验，我们掌握了细菌的基本形态结构、分离、纯化和鉴定方法。
2. 我们学会了利用生理生化反应进行细菌的鉴定和分类。
3. 本实验有助于提高我们对微生物学基本理论的认识和应用能力。
球菌
球菌（二）一、链球菌属（Streptococcus）链球菌属是一大类G＋、排列呈双或长短不一的链状球菌。
1. 分类1)溶血现象分类链球菌在血琼脂平板培养基上生长繁殖后，按产生溶血与否及其溶血现象分为3类：①甲(α)型溶血链球菌；②乙(β)型溶血链球菌；③丙(γ)型链球菌。
2）抗原结构分类：据链球菌细胞壁中抗原结构（C多糖抗原）不同,运用血清学方法分成A～V 20群。
对人致病的链球菌菌株，90%左右属A群，其他群少见。
同一群的链球菌又分若干型。
A群根据其M抗原不同，可分成约100个型。
3）生化反应分类：对一些不具有群特异性的链球菌（如肺炎链球菌和草绿色链球菌等），需用生化反应、药物敏感和对氧的需要分类。
对氧的需要分类分为：需氧、厌氧和微需氧链球菌。
2. 医学常见链球菌二、A群（化脓性）链球菌：本属细菌的代表种，主要成员有化脓性链球菌或β-溶血性链球菌，致病性强，对人致病的链球菌有90%属此种。
1. 形态与染色：球形或椭圆形，链状排列，长短不一，革兰染色阳性（G＋），无芽胞，无鞭毛，透明质酸的荚膜。
2. 培养特性：（1）营养要求高：血平板或含血清培养基；（2）液体培养为沉淀生长；（3）血平板呈灰白色表面光滑小菌落，不同菌株溶血不一，多数有透明溶血环（β溶血现象）。
3. 生化反应：（1）分解葡萄糖，产酸不产气。
（2）分解葡萄糖。
（3）不分解菊糖，不被胆汁溶解（可鉴别甲型溶血性链球菌与肺炎链球菌）。
（4）链球菌不产生触酶，与葡萄球菌不同。
4.抗原结构：（1）多糖抗原（C抗原）：为群特异性抗原，细胞壁的多糖组分，可用稀盐酸等提取。
为链球菌的分群依据。
（2）表面抗原或称蛋白质抗原：壁外的菌毛样结构含M蛋白，位于C抗原外层，具型特异性，有近100种血清型。
M抗原与致病性有关。
（3）P抗原或称核蛋白抗原：无特异性。
5. 抵抗力：一般链球菌均可在60℃被杀死，对常用消毒剂敏感。
在干燥尘埃中生存数月。
乙型链球菌对青霉素、红霉素，四环素、杆菌肽和磺胺药都很敏感。
(完整版)猪链球菌的检测和鉴定技术
ATCC43765
+ + + + + + + + + + 4641427 （92%）
HA9801
+ + + + + + + + + + + 4651427 (80%)
ATCC35246
+ + + + + + + + + 0461607 (99.9%)
32210 化脓链球菌
0161415 (99.9%)
读数仪
比浊仪 电子加样枪
计算机 打印机
19
试条组成
试条种类：
24h常规鉴定试条
Ref.32400，ID32 E Ref.32100，ID32 GN Ref.32500，ID32 Staph Ref.32200，ID32 C
4h快速鉴定试条
Ref.32700，rapid ID32 E Ref.32300，rapid ID32 A Ref.32600，rapid ID32 Strep
粪肠球菌
7143711 （98.7%）
猪链球菌的API鉴定结果
TRE（海藻糖）、RAF（棉子糖）等几个的试验与API 菌种库有些不符，但 都属于SS2型或1型，数值分类
相对于双歧分类的优点
ATCC43765
HA9801
ATCC35246
32210 化脓链球菌
粪肠球菌
编码 4641427（92%） 4651427(80%) 0461607(99.9%)0161415(99.9%)7143711（98.7%）
球菌
SPA
葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）
概念：是存在于金黄色葡萄球菌细胞壁表
面的一种蛋白质. 特点:能与人及多种哺乳动物的IgG Fc段 非特异性结合. 生物学意义：抗吞噬、促细胞分裂、引起 变态反应、损伤血小板等作用. 用途：协同凝集试验.
毒素性疾病
食物中毒 烫伤样皮肤综合征(SSSS) 毒性休克综合征(TSS)
假膜性肠炎
三、免疫性
人类有一定的天然免疫力，只有
当皮肤黏膜受伤后，宿主免疫力降低 时，才易引起葡萄球菌感染。 感染后能获得一定的免疫力，但 不强，难以防止再次感染。
微生物学检查
直接涂片染色镜检：观察细菌形态、排列、染色性 观察菌落性状、溶血性、色素 涂片、染色、镜检 挑取可疑菌落 生化反应测定 纯培养 致病性测定
4. 肠毒素：
是一组热稳定的可溶性蛋白， 耐100℃ 30min；
抗胃蛋白酶分解； 刺激呕吐中枢，导致以呕吐
为主要症状的食物中毒
常污染食物有牛奶、肉类等
5. 表皮剥脱毒素：
使表皮层细胞脱落，引起剥脱性皮炎
裂解表皮组织的棘状颗粒层
表 皮与真皮脱离
烫伤样皮肤综合征
6. 毒性休克综合征毒素-1（ TSST-1） （toxic shock syndrom toxin 1）
抗吞噬：
（体内作用）
SPA
抗体
金葡菌
协同凝集实验： 未知Ag(病原菌)
（体外作用）
金葡菌
抗体
SPA
分 类：
金黄色葡萄球菌（致病菌） 产生色素
表皮葡萄球菌（条件致病菌）
腐生葡萄球菌
产生凝固酶 噬菌体分型
第九章球菌
二、致病性
致病物质
葡萄球菌溶素 毒性休克综合征毒素—1 杀白细胞素 肠毒素 表皮剥脱毒素 酶 凝固酶 耐热核酸酶 纤维蛋白溶酶 透明质酸酶 酯酶 表面结构蛋白 粘附素、荚膜、胞壁肽聚糖、SPA 毒素
凝固酶（coagulase）
概念 使含有抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类 游离凝固酶free coagulase 结合凝固酶bound coagulase
SLS— 小分子糖肽，对O2稳定
——血平板上β溶血
——无抗原性
侵袭性酶 透明质酸酶 扩散因子 分解细胞间质的透明质酸→组织中扩散
链激酶（链球菌溶纤维蛋白酶） 链道酶（链球菌DNA酶）
有利于细菌扩散
感染特点：感染病灶与周围界限不清，易于扩散，脓汁稀薄
所致疾病：
A群链球菌 淋巴管炎，
Fc receptor
IgG
SPA
Fab
Fc
BACTERIUM
SPA（staphylococcal protein A） SPA功能 体内作用： SPA与IgG结合后所形成的复合物具有抗吞 噬、促细胞分裂、引起超敏反应、损伤血小 板等多种生物活性。 体外作用：用于多种微生物抗原检测。
协同凝集试验（coagglutination））
约1/3临床分离金黄色葡萄球菌可产生
引起急性胃肠炎，即食物中毒
特点：
——耐热，100℃30min
引起毒素性食物中毒 ——抗胃肠液中蛋白酶
作用机制：刺激呕吐中枢导致以呕吐为主要症
状的食物中毒
毒性休克综合征毒素-1（TSST-1）
引起机体发热，增加对内毒素的敏感性
引起发热、休克、肾衰、皮疹等多个器官功能紊乱，
分αβγδ 等，α溶素为主要致病因子，溶解红 细胞，破坏白细胞，血小板及多种其它组织 细胞 攻击中性粒细胞和巨噬细胞 抵抗宿主吞噬细胞，增强细菌侵袭力
呼吸道感染的微生物检验
危险因素
1.COPD/支扩/陈旧肺结核/肺间质纤维化等基础肺疾病 2.糖尿病 3.慢性心、肾功能不全 4.慢性肝疾患 5.误吸或易致误吸因素 6.脾切除术后 7.慢性酗酒或营养不良，吸烟 8.精神状态改变 9.近一年内因社区获得性肺炎住院史
治疗原则
合理使用抗生素 • 在用药前，尽早采集标本进行细菌鉴定及
• 不能及时接种的标本可以4℃冰箱保存（疑为肺炎链球菌、 流感嗜血杆菌等苛养菌感染不在此列），以免杂菌生长。 但保存标本应在24h内处理。
• 对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等） 的患者检验标本，在采集、运送或保存过程中必须注意生 物安全防护。
血培养
• 血液：当患者发热体温（≥38℃）或低体温 （≤36.0℃）时；或外周血白细胞计数超过 10×109个/L（特别是存在核左移时）；或粒细胞 绝对值减少（成熟中性粒细胞计数少于1×109个 /L）；或合并有明显感染症状体征、伴有感染病 灶存在时，应当及时抽血作2~3份血培养。“份 数”是指“穿刺点”的数量，而非瓶子数。对于 成人，每瓶血量应为8~10ML。儿童患者，每瓶血 量应为1~5ML。
什么是呼吸道感染
• 呼吸道感染包括鼻、咽、喉、气管、支气管及肺部的感染性炎症。呼 吸道以环状软骨为界，分为上、下呼吸道。上呼吸道包括鼻、咽、喉， 其感染称上呼吸道感染。下呼吸道包括气管、主支气管、叶、段支气 管直至肺泡，其感染称下呼吸道感染。
• 上呼吸道感染主要病原体：细菌和病毒 • 下呼吸道感染病原体包括：细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体、立
初诊 •患者的主要症状是咳嗽、咳 痰、高热、胸痛，可伴有呼吸 异常、咯血
诱发因素 上呼吸道病毒感染 突然受寒、饥饿、疲劳、醉酒等，消 弱全身抵抗力。 某些慢性疾病患者，如免疫缺陷。糖 尿病，肾功能衰竭。
临床微生物学检验理论课：02细菌鉴定试验-涂片染色
涂片抗酸染色结果观察
镜检时，油镜下仔细查遍整个涂片或至少100个视野； 抗酸性菌呈红色，其它细菌及细胞呈蓝色； TB为细长，着色不均匀，可2个以上的菌形成V、Y、T
等或平行排列等。
涂片抗酸染色结果报告
结果报告，1984年国内统一暂行规定报告方式： 未找到抗酸菌-； 找到抗酸杆菌1或2个，全视野发现1或2个； 找到抗酸杆菌+，全视野发现3-9个； 找到抗酸杆菌++，全视野发现10-99个； 找到抗酸杆菌+++，每视野发现1-9个： 找到抗酸杆菌++++，每视野发现10个以上。
（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验
吲哚（靛基质或蛋白胨水）试验： 阳性：色氨酸酶，分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚，
加入指示剂形成红色界面； 阴性：加入指示剂不变色； 区分普通变形杆菌（+），奇异变形杆菌（-）。
尿素分解试验： 阳性：尿素分解酶分解尿素产生大量的氨，使培养基
呈碱性，加入指示剂为红色； 阴性：加入指示剂不变色。
4、墨汁染色查隐球菌
新生隐球菌广泛分布于自然界，也可存在于人体体表、 口腔及肠道中；
经呼吸道侵入人体，由肺经血行播散时，可侵犯所有脏 器组织，主要侵犯肺、脑及脑膜；
好发于细胞免疫功能低下者，如AIDS、恶性肿瘤、糖尿 病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者；
临床上怀疑脑膜炎时，常抽取脑脊液检查细菌真菌、抗 酸菌、隐球菌。
3、涂片抗酸染色：检查抗酸杆菌
据世界卫生组织估计，全球每年增加结核病人约800万 1000万，死亡病人约300万；
全人类的三分之一即17亿人曾感染过结核杆菌； 结核病人主要见于发展中国家，尤其经济落后地区； 我国是结核病高发国家，广东地区发病率较高。
肺炎链球菌的临床分布及药敏结果
肺炎链球菌的临床分布及药敏结果王春光目的：了解昆明市儿童医院肺炎链球菌临床分布及药敏情况，为结合临床用药提供依据。
方法：对2013年7月—10月进行微生物病原学培养分离的肺炎链球菌药敏结果进行统计分析。
结果 该院分离的肺炎链球菌主要来自儿童（100%），标本主要来源是痰液（72.72%），其次是血液（22.72%），其他（4.56%）。
肺炎链球菌的耐药率：青霉素86.4%，氨苄西林0%，头孢曲松40.9%，美罗培南54.5%，庆大霉素0%，环丙沙星0%，左旋氧氟沙星0%，氧氟沙星4.5%，克林霉素95.5%，红霉素95.5%，万古霉素0%，氯霉素27.3%，四环素90.9%。
结论 应该积极对儿童预防接种肺炎链球菌疫苗，青霉素对该菌耐药性较高。
肺炎链球菌（Streptococcus Pneumoniae, SP）是儿科社区获得性感染的主要病原菌之一，主要寄生在人类上呼吸道，为条件致病菌，约40% ～ 70% 正常人鼻咽部有本菌存在。
可通过飞沫、分泌物传播,对人的健康构成了一定的威胁,WHO估计，每年大约有160万人死于SP感染，其中5岁以下儿童占43.8％～62.5％，且大多数分布在发展中国家。
更为严重的是,在过去青霉素等抗菌药物是治疗肺炎链球菌感染的有效手段，但随着抗菌药物的大量使用或使用不合理，耐青霉素菌株和多重耐药菌株持续增加，已成为临床抗感染治疗的新难题。
肺炎链球菌疫苗是预防其感染、延缓耐药菌株产生和传播的有效措施。
SP感染严重威胁着儿童的健康，避免抗生素滥用是目前公认的较好的控制SP耐药发生和发展的主要途径。
为了解近年来肺炎链球菌的耐药情况，为临床合理使用抗生素提供依据，特对昆明市儿童医院2013年7月～10月临床分离的非重复的22株肺炎链球菌的耐药性进行回顾性分析，现将结果报道如下。
一、资料与方法（一）一般资料2013年7月—10月分离自昆明市儿童医院患儿的肺炎链球菌感染菌株22株。
其中16株来自痰液，5株来自血培养，1株来自其他。
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肺炎链球菌的微生物学检验方法与原理
肺炎链球菌（Setrt Pococcuspneumoinae）简称肺炎球菌，是1881年首次
由巴斯德及G.M.Stembegr分别在法国和美国分离出来。
肺炎球菌菌体似矛头，
呈短链状排列或成双排列的球菌，革兰氏阳性，绝大多数兼性厌氧，偶有专性厌氧，肺炎链球菌的主要致病物质是肺炎球菌溶血素和荚膜。
近年来，越来越多的
国家和地区出现耐药性肺炎链球菌菌株的报道，严重威胁着肺链感染的临床治疗，已成为一个呛待解决的健康问题。
1、药敏试验
1.1微量稀释法该法是美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的肺炎链
球菌药敏试验的参考方法。
该法主要使用经过离子校正的M-H肉汤+2%～5%的溶
血马血作为培养基的，然后将抗生素稀释后加人培养基中。
将在羊血平板上的菌
落制备菌液，以0.5浊度分装微量板。
在35℃普通条件下培养24h后，人工判断
结果。
具体MIC见NCCLS的判定标准。
1.2纸片扩散法NCCLS推荐使用的纸片法药敏试验，主要使用羊血平板，以0.5浊度的菌液接种平板。
对于临床分离株的药敏试验，CO2是必备的环境。
平
板应于35℃条件下在5%的CO2中培养24h后进行测量，从正面量取。
抑菌环的
大小和质控标准详见NCCLS的规定。
纸片扩散法的优点是简单方便，对非β-内
酞胺药物的重复性、准确性均较高，但是在应用于青霉素和头抱类抗生素时准确
性明显降低。
2、肺炎链球菌的耐药性检验
目前有很多实验室在对血液、脑脊液等体液分离得到的肺炎链球菌耐药性测
定时，只检测青霉素的耐药性。
事实证明，多重耐药和对三代头抱耐药的肺炎链
球菌越来越多，因此，NCCLS已经明确要求，从脑膜炎者分离出来的肺炎链球菌
必须做青霉素、头孢曲松或者头孢他啶的MIC，另外还应检测对万古霉素的耐药性。
对于中枢神经系统以外分离而来的肺链球菌，则首先应该选用苯唑西林来检
测其是否对β-内酰胺类药物耐药。
若抑菌环>200mm，证明其对青霉素和β-内
酞胺类药物敏感物耐药性；若抑菌环<19mm，则须进一步检测其对青霉素、头孢
曲松或头孢他啶的耐药性。
同时，对于非中枢神经系统分离的菌株还应进行红霉素、复方磺胺药物敏感性的测定。
阿奇霉素、克拉霉素等新大环内脂类药物的敏
感性则可通过红霉素药敏试验结果推知，而不必进行常规的检测。
自1965年波
士顿报道了首例耐青霉素肺炎链球菌以来，世界各地不断有耐药性肺炎链球菌的
菌株被发现，虽然各地报道的耐药率和检出率不尽相同，但是一个总的趋势就是，肺炎链球菌耐药性正在逐年上升。
临床上和实验室应该特别注重肺炎链球菌耐药
性的检测和使用抗生素进行治疗。
3、微生物学检查
3.1标本根据感染部位不同采取不同标本，如痰液、脓液、血液、脑脊液等。
3.2直接涂片镜检对痰、脓或脑脊液沉淀物标本，可涂片进行革兰染色镜检，若发现典型的成双排列、有荚膜的革兰阳性球菌，结合临床症状可做初步诊断。
3.3分离培养与鉴定将痰或脓液直接接种于血琼脂平板上，37℃孵育24h后，挑选溶血的可疑菌落做进一步鉴定。
血液及脑脊液先在血清肉汤培养基中增菌后，接种到血琼脂平板上分离培养并鉴定。
3.4肺炎链球菌的鉴定主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。
其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和奥普托辛试验最为常用。
必要时可做小鼠毒力试验。
在上述试验中，肺炎链球菌均为阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。
4、肺炎链球菌型别鉴定
4.1荚膜肿胀试验亦称为Quellug试验。
新鲜标本悬液与等量不稀释的肺炎
球菌分型诊断血清混合后，覆以盖玻片，油镜下观察。
标本中肺炎球菌若与同型
免疫血清相遇，荚膜将显著增大。
4.2凝集试验将可疑肺炎球菌与已知标准分型血清做玻片凝集试验，若细菌
凝集成堆，为同型肺炎球菌。
5、分子流行病学研究方法
近年来，由于传统的细菌药敏试验和英膜血清学分型具有一定的局限性，分
子流行病学研究方法被作为一种重要的补充手段用于肺炎链球菌感染和耐药性的
分析中。
主要包括以下三个方面，①BOX-PCRP：它是肺炎链球菌染色体上的一段
重复序列，呈现高度保守性，由三个亚单位组成，分别为A、B、C。
其中以
BOXA1为引物的PCR检测法被广泛应用。
②核酸分子杂交：该技术又被称为核糖
体分型。
首先利用限制性内切酶切割DNA，电泳后将DNA1转移到尼龙膜上，使其
与被标记的BOX片段进行杂交，从而比较DNA片段的同源性。
③限制性片段长度
多态性分析（RFLP）：该法与上法有类似之处，首先利用限制性内切酶切割DNA，经电泳分离后，直接比较各菌株的DNA指纹，从而判断其同源性。