高效液相色谱
高效液相色谱
二、 进样系统
将样品溶液准确送入色谱柱的装置 ——手动方式、自动方式
进样器要求
密封性好、死体积小、重复性好、进样时 引起色谱系统的压力和流量波动要很小。
常用手动进样器——六通阀进样器，
二、 进样系统
六通阀进样
Load
Inject
分析对象及范围 能气化、热稳定性好、 G 且沸点较低的样品，占 C 有机物的20% 流动相的选择 操作条件
流动相为有限的几种 加温常压 “惰性”气体，只起运 操作 载作用，对组分作用小
溶解后能制成溶液的样 H 流动相为液体或各种液 品，高沸点、高分子量、 P 体的混合。它除了起运 室温、高 难气化、离子型的稳定 L 载作用外，还可通过溶 压下进行 或不稳定化合物，占有 C 剂来控制和改进分离。 机物的80%
经典LC HPLC
固定相颗粒>100μm,不均匀 固定相颗粒<10μm,均匀 常压下输送流动相 柱效较低（H↑，n↓） 高压下输送流动相 柱效较高（H↓，n↑）
分析周期长 无法在线检测
分析周期短 可以在线检测
2. HPLC与GC的比较
相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼
具分离和分析功能，均可以在线检测
高分子多孔微球：YSG
一、固定相
3. 常用固定相
化学键合固定相
以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子
以共价键连接在硅醇基上
(硅酯化) Si OH R OH Si O R
SOCl 2
(酰氯化) Si OH SOCl2 Si Cl RLi 或RMgCl Si R (硅烷化) Si OH R3 SiCl Si O SiR3 HCl
高效液相色谱的原理
高效液相色谱的原理高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种基于分子间相互作用力进行化合物分离和分析的方法。
它主要由四个部分组成：流动相，固定相，色谱柱和检测器。
其原理如下：1. 流动相：液相在常温下以高压泵的作用下通过色谱柱，它可以是有机溶剂、水或其他特定的溶剂组合。
流动相在整个过程中起到带动样品运动以及分离化合物的作用。
2. 固定相：为了实现分离，需要使用一种高表面积的固相材料将样品担持在流动相中进行分离。
固定相通常以粉末或颗粒的形式填充在色谱柱中，常见的固定相材料有硅胶、高性能液相色谱柱（如C18）等。
固定相的选择取决于目标分析化合物的特性。
3. 色谱柱：色谱柱是将固定相填充在其中的管状包层，它是高效液相色谱分离的关键部分。
色谱柱的长度、内径和填充粒径等参数会对分离效果产生影响。
较长、较细的柱内填充材料可以提高分离效率，但也会增加分析时间。
4. 检测器：在色谱柱出口处使用检测器来检测化合物的浓度。
常用的检测器包括紫外-可见吸收检测器（UV-Vis）、荧光检测器、电化学检测器等。
检测器将检测到的信号转化为可见的色谱图谱，用以分析和定量目标化合物。
在高效液相色谱分离过程中，样品溶液被注入到进样器中，经由高压泵送入色谱柱。
在色谱柱中，化合物会与固定相发生不同程度的相互作用，并在流动相的作用下逐渐分离。
分离出的化合物会依次出现在检测器中，通过检测器的信号输出，我们可以获得色谱图，并通过峰面积或峰高等参数对化合物进行定量和定性分析。
高效液相色谱的优点包括分离效率高、分析速度快、样品制备简单等，因此被广泛应用于生物医药、农药残留、环境监测等领域的化学分析。
色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
色谱柱不能很长，柱效不会太高
载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性
固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性
回收困难
可定量回收，可用于制备
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一)定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
高效液相色谱法简介
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱
柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中
同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
第二节
塑料块 Teflon
1 cm
工作电极 (Pt, Au, 碳糊)
e.电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理： 根据待测物在一些介质中电离后所产 生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质 的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应 受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温 箱中。另外，当 pH>7时，该检测器不够灵敏。 电导检测器不能用于梯度洗脱。
◆恒流泵
注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。
往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。 （使用较多） 对流量变化敏感的检测器会有噪声 干扰，此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。
输液泵操作注意事项：
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
F=2.3QKI0εCl
Q为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸光系 数，l为光径长度。
F=KC
特点：选择性好，
专属型检测器，灵敏 度比紫外检测器高 （检测限10-10 g/ml） 对多环芳烃，维 生素 B 、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药 、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应；
c. 示差折光检测器
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
中国药典版--高效液相色谱法
现象3：基线漂移
判断————————————------------------排除方法 （1）溶剂贮槽污染---------------（1） 清洗贮槽装入新的流动相冲洗柱子 （2）前次分离样品中的强吸附组分 从柱上洗脱-------（2）在分离之前用强 流动相从柱中洗脱所有的组分：使用溶 剂梯度清洗柱子 （3）由微粒造成柱入口、进样阀、 柱入口的部分堵塞--（3）清洗进样系统 和柱入口过滤片
色谱条件与系统适用性试验
按各品种项下的要求对仪器进行适用 性试验，即用规定的对照品对仪器进 行试验和调整，应达到规定的要求； 或规定分析状态下色谱柱的最小理论 板数、分离度、重复性和拖尾因子。
（1） 色谱柱的理论板数
色谱柱的理论板数(n) 在选定的条件下，注入 供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液， 记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰 的保留时间tR（以分钟或长度计，下同,但应 取相同单位）和半高峰宽(Wh/2)，按 n=5.54(tR／Wh/2)<2>计算色谱柱的理论板数， 如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小 理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长， 载体性能，色谱柱充填的优劣等），使理论板 数达到要求。
6最低检测限的意义 最低检测限虽然是个绝对值，但其真正 意义确是相对值，即相对于供試品溶液 的中样品浓度的多少而言，，设定杂质 总量不得过1.0％。最低检出限通常许达 到对照溶液浓度的十分之一到五十分之 一。 7使用对照品外标一点法测定时的关键是 什么 使用对照品外标一点法测定时的关键是 尽量保持样品溶液和对照品溶液的浓度 一致。
（4）泵中有气泡，泵压不稳-----------（4） 赶除聚集于泵头内的气泡 （5）溶剂纯度不高，背景吸收强，透 光差------ -------- -------- （5）提纯溶剂或 选纯度比较高、透光性好的溶剂作为流动 相 （6）检测池污染-------------（6）清洗检 测池 （7）示差折光检测器液槽漏 --------（7）检修或更换液槽
高效液相色谱样品预处理步骤
高效液相色谱样品预处理步骤1. 样品准备在准备高效液相色谱样品时，需要确保样品的稳定性，防止样品在分析过程中发生变化。
因此，在样品准备过程中需要注意以下几点：（1）选择合适的样品存储容器，避免样品被污染或发生变化；（2）确保样品在分析前达到室温，以避免样品在注射到色谱柱时产生气泡；（3）注射适量的样品，以避免色谱柱被过度磨损或样品过载。
2. 样品过滤在进行高效液相色谱分析前，需要将样品通过过滤器进行过滤，以去除样品中的固体杂质或悬浮物，从而防止其对色谱柱的堵塞或损坏。
通常使用的过滤器有不同规格的筛网或滤膜。
3. 样品衍生化在一些情况下，需要对样品进行衍生化处理，以便更好地进行高效液相色谱分析。
衍生化处理可以将样品中的某些化合物转化为更易分析的形式，例如将某些极性化合物转化为非极性化合物，使其更适合用有机溶剂进行洗脱。
4. 样品稀释在某些情况下，需要将样品进行稀释，以便更好地进行高效液相色谱分析。
过浓的样品可能会导致色谱峰过宽或重叠，影响分析结果的准确性。
通常使用的的是溶剂或水进行稀释。
5. 样品进样在进行高效液相色谱分析时，需要将样品通过进样针注入到色谱柱中。
在进行进样时，需要注意以下几点：（1）注射适量的样品，以避免色谱柱被过度磨损或样品过载；（2）确保进样针的清洁和干燥，以避免对分析结果产生干扰。
6. 样品分离在将样品注入到色谱柱后，需要对其进行分离。
通常使用的的是高压泵将流动相通过色谱柱，将样品中的各个化合物进行分离。
在进行分离时，需要注意以下几点：（1）选择合适的流动相，以便将样品中的各个化合物进行分离；（2）调整流动相的流速和比例，以便获得更好的分离效果。
7. 检测器检测在分离后的各个化合物通过色谱柱流出时，需要使用检测器进行检测。
常见的检测器有紫外可见光检测器、电导检测器、荧光检测器等。
检测器可以提供样品的信号，并记录下各个化合物的在色谱图中的保留时间。
8. 数据处理在检测器检测完成后，需要对数据进行处理。
hplc工作原理
hplc工作原理
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术，通过溶液中物质分子
之间的分配和相互作用来实现成分的分离。
HPLC的工作原理
如下：
1. 液相：
HPLC使用液相作为移动相，通常是溶解在溶剂中的样品溶液。
液相必须满足一定的要求，如流动性好、化学稳定性高、与样品充分溶解等。
2. 固定相：
HPLC中的固定相通常是一种固体填料，填充在柱子中。
填料
的性质决定了分离的效果和速度。
常用的填料有C18疏水相、氢氧化铝等。
3. 注射：
样品溶液经过稀释、过滤等预处理后，用注射器将准确的样品注入到HPLC装置中。
注射器通常设有自动进样器，使得样
品的注入过程更加准确和稳定。
4. 色谱柱：
色谱柱是HPLC系统中最重要的组成部分。
样品在色谱柱中
与固定相发生相互作用，不同组分的分配系数不同，从而实现分离。
色谱柱可以通过调整填料的性质来控制分离效果。
5. 产物检测：
HPLC系统通常设有检测器，用于检测柱前和柱后流出液中的
化合物。
常用的检测器有紫外-可见吸收检测器、荧光检测器、电导检测器等。
检测器将信号转化为电信号，通过电子积分器测定分离物质的峰面积和峰高。
6. 数据处理：
HPLC系统通过计算机控制和数据处理软件进行数据获取和处理。
常用的数据处理方法有峰面积计算、峰高计算、保留时间计算等。
通过上述步骤，HPLC可以实现对复杂样品中各种成分的分离
和定量分析。
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高效液相色谱-荧光法测定人尿液中氧氟沙星的浓度【实验目的】1．掌握氧氟沙星尿液样品的收集、处理方法和尿药累积排泄率的计算方法。
2．熟悉氧氟沙星尿液样品的预处理方法好测定步骤。
【实验原理】氧氟沙星为喹诺酮类抗菌药，化学名(+/-)-9-氟-2,3-二氢-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶并[1,2,3-de]-[1,4]苯并恶嗪-6-羧酸。
本品为白色或微黄色结晶性粉末；无臭、味苦；遇光渐变色；在三氯甲烷中略溶，在水或甲醇中微溶或极微溶解，在冰醋酸或氢氧化钠试液中易溶，在0.1mol/L盐酸溶液中溶解。
（C18H20FN3O4 361.38）环丙沙星（内标），化学名1-环丙基-6-氟-4-氧代-1，4-二氢-7-（1-哌嗪基）-3-喹啉甲酸。
（C17H18FN3O3331.35）1．尿液中药物浓度的测定可以计算药物的排泄量及排泄率，在某些缺乏严密医护条件不便于对给药对象多次采血情况下，尿药排泄数据可以用来求算药动学参数；一般抗菌药物很容易通过尿液以原形药物形式排出体外，可以表征当时体内的药量。
2．氧氟沙星具有长共轭刚性结构，可以采用荧光检测器检测，由于体内内源性物质能够产生荧光的可能性很小，因此，荧光检测可以有效地减小内源性物质的干扰，同时增加检测灵敏度，满足了体内药物分析干扰多、含量低的特点。
3．氧氟沙星具有酸碱两性，在水溶液中发生解离，因此选择偏酸性的色谱条件可以有效地抑制其拖尾或者色谱峰对称性差的缺点，获得较好的色谱分离效果；由于尿液中浓度较大，可以采用直接稀释后离心的前处理手段，以获得适合于色谱分析的样品。
【仪器与试药】高效液相色谱仪-荧光检测器，分析天平，离心机，超声波清洗器，恒温水浴锅，涡旋混合器，微量注射器；离心管，微量移液器，容量瓶，量筒；氧氟沙星片（每片0.1克），氧氟沙星对照品，环丙沙星对照品，甲酸，三氯乙酸，乙腈，甲醇，二次蒸馏水。
【实验步骤】1．生物样品采集与保存给药与收集尿液：健康志愿受试者隔夜、禁食10小时，收集给药前的尿液作为空白对照；于实验当日晨单次空腹口服氧氟沙星片1片（每片0.1克），200ml温开水送服。
实验2小时后可适量饮水，4小时后进统一清淡午餐，分段收集给药后0-2、2-4、4-8、8-12和12-24小时尿液，准确测量体积，滤过，于-20℃冷冻保存、待测。
2．对照品溶液制备（1）氧氟沙星标准溶液：精密称取氧氟沙星对照品10mg，置100ml量瓶中，用乙腈溶解，并稀释制成每1ml含100ug的标准储备液，精密量取氧氟沙星标准储备液适量，用水稀释制成浓度分别为100、200、500、1000、2000、3000和4000ng/ml的氧氟沙星标准系列溶液。
（2）环丙沙星内标溶液：精密称取环丙沙星对照品10mg，置100ml量瓶中，用水溶解，并定量稀释成每1ml含100ug的储备溶液；精密量取该溶液1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度配成1.0ug/ml的标准溶液。
以上溶液均在4℃条件下冷藏。
3. 尿液样品前处理取冷冻的尿液样品，在37℃水浴下解冻，经适当稀释后，精密吸取500ul，置2ml具塞离心管中，精密加入环丙沙星内标溶液50ul，再加入200ul10%三氯乙酸混匀后高速离心，取上清液20ul进样分析。
4. 方法学确证（1）特异性评价：对6份不同志愿者空白尿液进行上述样品预处理，分别进样液相色谱分析，在氧氟沙星与内标保留时间位置未有内源性物质干扰出现，则证明本方法可以很好地排除尿液对氧氟沙星测定的干扰。
（2）尿液标准曲线制备：取空白尿液450ul,分别置10ml具塞离心管中，精密加入上述配制的氧氟沙星标准溶液50ul，得氧氟沙星浓度分别为10、20、50、100、200和400ng/ml 标准尿液样品。
按“尿液样品前处理”步骤操作，自“精密加入环丙沙星内标溶液50ul”起，同法处理，进样20ul，记录色谱图。
以氧氟沙星浓度为横坐标，氧氟沙星与内标的峰面积笔直为纵坐标，求得的直线回归方程即为标准曲线。
（3）准确度、精密度和最低定量限：取空白尿液450ul，按“标准曲线”项下的方法分别制成含有氧氟沙星浓度为10、20、100、和300ng/ml的最低定量限及低、中、高三个浓度的质量控制尿液样品，每一浓度进行5个样本分析，根据标准曲线，计算质控样品中氧氟沙星的实测浓度。
根据质控样品中氧氟沙星的实测浓度，计算本法的精密度与准确度。
（4）绝对回收率：按照“准确度、精密度和最低定量限”项下低、中、高三个浓度的质控样品，每一浓度进行5个样本分析。
同时，另取空白尿液500ul，除不加氧氟沙星标准溶液和内标溶液外，其他按“尿液样品前处理”项下的方法操作，向获得的下层水相中加入相应浓度的氧氟沙星标准溶液适量和内标溶液50ul，制成氧氟沙星的浓度分别为20、100和300ng/ml的低、中、高浓度的对照样品各2份，20ul进样分析，获得相应峰面积（3次测定的平均值）。
以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算绝对回收率。
（5）稀释效应：取空白尿液450ul，按“标准曲线”项下的方法，分别制成含有氧氟沙星浓度为600、1500和3000ng/ml的高浓度尿液样品，分别为高浓度质控样品的2、5、10倍。
将上述溶液分别用空白尿液稀释2、5和10倍，其中稀释10倍采用先2倍再5倍的逐级稀释方式，所得稀释尿液样品按照“尿液样品前处理”项下方法操作，进样分析获得峰面积，代入标准曲线求得稀释后浓度，再乘以相应的稀释倍数得到实测浓度。
此浓度与配制浓度相比，以回收率形式表示稀释对准确度的影响，每个浓度进行3个样本分析，准确度应在85%-115%之间，RSD小于15%。
5. 氧氟沙星尿药浓度测定色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-甲醇-甲酸-水（6:12:0.5:81.5）；流速1.0ml/min；检测波长：激发波长（Ｅx）＝２７８ｎｍ，发射波长（Ｅm）=445nm。
取空白尿液样品，按“标准曲线”项下标准尿液样100ng/ml分别测定，氧氟沙星与环丙沙星的分离度应符合规定，理论板数按氧氟沙星峰计算应不低于3000；空白尿液样品色谱中，在氧氟沙星与内标位置应没有干扰峰。
测定法取得含药尿液样品，按照“尿液样品前处理”步骤操作后进样分析，记录色谱图，按内标法，用标准曲线计算即得。
尿药累积排泄率的计算：排泄率（%）=C×V×D／S×100%式中，C为测得的一段时间内的尿药浓度（ng/ml）；V为收集的尿液体积（ml），D为尿样的稀释倍数；S为口服氧氟沙星的量（ng）。
【注意事项】1．尿液样品中细菌较多，收集的尿液样品若不立即测定，应放置在-20℃冷冻保存，测定前解冻。
2. 抗菌药肾排泄较多，因此尿液中的氧氟沙星浓度较大，为了适应色谱分析需要，将尿液进行逐级稀释，因此需要考察尿液稀释对定量准确度的影响，进行稀释效应的评价。
凡是测定样品高出标准曲线上限，均应用相同的生物基质进行稀释，并考察稀释效应。
3. 所用玻璃仪器均应以洗液洗涤，不得用肥皂或洗衣粉，以防带入荧光干扰物。
【思考题】1. 荧光检测器测定氧氟沙星的原理是什么？荧光检测器的特点是什么？2. 尿样是如何收集和保存的？如何评价氧氟沙星在尿中的排泄情况？3. 尿中药物浓度的测定主要用于哪些方面的研究？4. 荧光检测器与紫外检测器相比有何优点？在测定时应注意哪些条件？【附录】荧光检测器简介荧光检测器是高效液相色谱仪常用的一种检测器之一。
用紫外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即可检出。
其特点是选择性高，只对荧光物质有响应；灵敏度也高，最低检出限比紫外检测器通常高一个数量级，适合于多环芳径及各种荧光物质的痕量分析，也可用于检测不发荧光但经化学反应后可发荧光的物质。
如在酚类分析中，多数酚类不发荧光，为此先经处理，使其变为荧光物质，而后进行分析。
从电子跃迁的角度来讲，荧光是指某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线以后，原子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高的某些振动能级。
电子在同类分子或其他分子中撞击，消耗了相当的能量，从而下降到第一电子激发态中的最低振动能级，能量的这种转移形式称为无辐射跃迁。
由最低振动能级下降到基态中的某些不同能级，同时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光，就是荧光。
被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光，发射光波长总要长于激发光波长。
对于稀溶液，荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入射光强度、荧光的量子效率及荧光的收集效率等成正相关。
在其他因素保持不变的条件下，物质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比，这是荧光检测器的定量基础。
荧光检测器属于溶质型检测器，可直接用于定量分析。
激发波长和发射波长是荧光检测的必要参数。
选择合适的激发波长和发射波长，对检测的灵敏度和选择性都很重要，尤其是可以较大程度地提高检测灵敏度。
血浆中5-单硝酸异山梨酯的气相色谱法测定【实验目的】1．掌握5-单硝酸异山梨酯血浆样品的处理过程和分析测定方法。
2．熟悉气相色谱法用于血浆样品分析测定的方法学验证内容。
3．了解气相色谱仪-电子捕获检测器分析的特点。
【实验原理】5-单硝酸异山梨酯为血管扩张药，化学名1，4：3，6-二脱水-D-山梨糖醇-5-单硝酸酯。
白色针状结晶或结晶性粉末，无臭，在甲醇或丙酮中易溶，在三氯甲烷或水中溶解，在己烷中几乎不溶。
选择结构类似物硝酸异山梨酯为内标，化学名1,4:3,6-二脱水-D-山梨醇二硝酸酯。
（C6H9NO6 191.14）选择结构类似物硝酸异山梨酯为内标，化学名1,4:3,6-二脱水-D-山梨醇二硝酸酯。
（C6H8N2O8236.14）【实验材料】气相色谱仪-电子捕获检测器，分析天平，离心机，超声波清洗器，涡旋混合器，氮吹仪，微量注射器；离心管，微量移液器，量筒；5-单硝酸异山梨酯片（每片40mg）5-单硝酸异山梨酯对照品，硝酸异山梨酯对照品，磷酸二氢钾，氢氧化钠，乙酸乙酯，甲醇。
【实验内容】1．生物样品采集与保存（1）准备肝素抗凝管：将12500U的肝素用生理盐水稀释至10ml（1→10）。
取稀释后的肝素溶液0.1ml置于5ml或10ml试管中，转动试管，使肝素溶液均匀涂布在试管内壁，80-100℃干燥。
（2）给药与采血：受试者隔夜、禁食10小时，于实验当日晨单次空腹口服单硝酸异山梨酯普通片，剂量为40mg，200ml温开水送服。
试验2小时后可适量饮水，4小时后进统一清淡（低脂）午餐。
在给药前（0小时）及给药后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、8.0、12、16和24小时分别抽取肘静脉血3ml，置肝素化试管中，混匀，离心（3500r/min）10分钟，分离血浆，于-20℃冷冻保存、待测。