紫外分光光度计测蛋白浓度

紫外分光光度法测定蛋白质含量

一、实验目的

1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。

2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

3.掌握TU-1901紫外可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理

1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外光：10-400 nm

可见光：400-780 nm(可被人们的眼睛所感觉)

特点：带光谱、分子光谱应用：定性分析最大吸收波长; 定量分析：朗伯-比尔定律(标准曲线法和标准加入法)

a.定性分析原理：吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状

b.定量分析原理：根据朗伯-比耳定律： A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。

c. 仪器组成部件: 各种类型的紫外可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。

2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：

(1)蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

(2)此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。据初步统计，浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。

(3)有嘌呤、嘧啶等核酸类干扰时的经验公式：若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在280nm处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰。核酸在260nm 处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算：蛋白质浓度

(mg/mL)=1.45A280-0.74A260 (A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和

260nm处测得的吸光度值) 还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量：蛋白质浓度(mg/mL)=F* A280*D*1/d

其中A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值;

d为石英比色皿的厚度(cm);

D为溶液的稀释倍数;F为校正因子

(4)稀溶液中蛋白质浓度测定的经验公式：蛋白质的肽键在200—250nm有强的紫外吸收。其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其波长越短，光吸收越强。若选用

215nm可干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差，因此，对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用215nm和225nm光吸收差法。

常用下列经验公式：蛋白质浓度(mg/mL)=0.144(A215-A225)

(A215和A225分别为蛋白质溶液在215nm和225nm处测得的吸光度值

三、仪器与试剂

仪器：TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管(10ml的5个)，吸量管。

试剂：标准蛋白质溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl 溶液，待测蛋白质溶液(牛血清白蛋白)。

四、实验步骤

1.基本操作

(1)启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器,预热半小时。

(2)用吸量管分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比(参比溶液不可取出).

(3)在工作界面上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数(起点：400nm，终点：250nm，速度：中，间隔：1.0nm，单次扫描)

(4)将两个均装有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描，然后选定量测定，校零，在调回光谱扫描。

2.吸收曲线的制作:(找出最大吸收波长) 将放在前面的比色皿中溶液换为0.3 mg/mL 的蛋白质溶液，点击START进行扫描，得到如下吸收曲线，从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的最大吸收波长为278nm，此波长下的吸光度为0.1984。

3. 标准曲线的制作：在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件 ( 测量波长： 278.00 nm) 。用 1 cm 石英比色皿，以 0.9%NaCl 溶液为参比，在 278nm 处分别测定以上所配标准溶液的吸光度 A278 ，记录如下：以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线：

4. 样品测定：配制三份待测蛋白质溶液， ( 取待测蛋白质溶液 2.0mL 分别于 3 只10mL 比色管中，用 0.9% NaCl 溶液稀释至刻度 ) 按上述方法测定 278 nm 处的吸光度。得吸光度依次为 0.3906 ， 0.3765 ， 0.3848 。平均值为 A278=0.3840, 根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度为 0.6101mg/mL 。转换后待测蛋白质溶液的浓度为 C= 0.6101mg/mL •10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL

紫外分光光度法测定蛋白质含量实验报告

紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的 1.学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理； 2.掌握紫外分光光度法测蛋白质含量的实验技术。二、实验原理 1.测蛋白质含量的方法主要有：①测参数法：折射率、相对密度、紫外吸收等；②基于化学反应:定氮法、双缩脲法、Folin―酚试剂法等。本实验采用紫外分光光度法。 2.蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同蛋白质略有不同）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从朗伯―比尔定律。利用紫外吸收法测蛋白质含量的准确度较差，原因有二：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；②样品中含有的嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。三、仪器与试剂 TU―1901紫外可见分光光度计、标准蛋白质溶液3.00mg·mL-1、0.9%NaCl 溶液、试样蛋白质溶液。 10mL比色管、1cm石英比色皿、吸量管。四、实验步骤 1.绘制吸收曲线用吸量管吸取2mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在190~400nm间每隔5nm测一次吸光度Abs，记录数据并作图。 2.绘制标准曲线用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在波长280nm处分别测其吸光度，记录数据并作图。 3.样品测定取适量浓度试样蛋白质溶液，在波长280nm处测其吸光度，重复三次。在已经得到标准曲线的情况下，为了使测量结果准确度高，待测溶液的浓度需在标准曲线的线性范围内，所以，先测定试样蛋白质原液的吸光度（1.363），估算浓度为2.0960 mg·mL-1，再将原试液稀释至5倍（即取2mL试液，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀），估算浓度为0.4192 mg·mL-1，测吸光度，重复三次五、数据处理与结果分析

常用紫外分光光度法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1) 2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2) (nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材 1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制，酪蛋白用0．05n naoh配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（cuso4?5h2o）和6.0克酒石酸钾钠（knac4h4o6?4h2o），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法 1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、folin—酚试剂法（lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮

蛋白浓度的测定

蛋白质浓度测定：紫外分光光度法 OD280/OD260＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式：样本蛋白质含量(mg/m1)＝1.45*OD280一0.74*OD260 OD280/OD260﹥1.5时，用Lamber-Beer定律计算：样本蛋白质含量(mg/m1)= OD280/K×L＝（OD280/6.3×1）×10g/L 本实验样品：牛血清白蛋白E1%cm＝6.3（100ml/cm.g） K：克分子消光系数；E1%cm：百分比吸光度的吸光系数；注：不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异，故标准管与测定管的蛋白

质氨基酸组成应相似，以减小误差。 OD是optical density（光密度）的缩写， OD＝1og（1/trans），其中trans 为检测物的透光值。吸光度：吸光度，absorbance，是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用A表示， A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/（g·cm），b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ，c为溶液浓度，单位g/L。影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量，温度通过影响c，而影响A。一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度，OD230代表其他杂质（多糖等）的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值，而OD是光密度值，一个意思。 A260/280比值一度成为判断核酸纯度的唯一通用标准，纯的DNA一般在1.8~2.0之间；后来发现在抽提过程中使用的许多试剂影响 A260和A280读数；同时，对同一样品10倍数量级稀释后测定吸光值发现，分光光度计的吸光值仅在一定的区域是线性的。结论是：当A260读数处在0.1-0.5 之间，A200 到A320之间的数值构成一条光滑的曲线时，少量苯酚（30 ul/ml）残留使A230，A260，A280均变大（差不多增加一倍），但A260/A280和A260/A230均在2左右。少量异硫氰酸胍（132 uM）残留使A230变大，但A260，A280几乎不变，所以A260/A280仍在2左右，而A260/A230大大低于2。大量异硫氰酸胍（2.4 M）残留使A230，A260，A280均变大，根本就没有办法测定了。PEG（6.25%）残留使A230，A260，A280均变大，但对A230，A260影响更大，所以A260/A280比2大不少，而A260/A230仍在2左右。核酸抽提中常用的试剂，如Phenol，GuanidineIsothiocyanate，PEG都能使A260和A280的值变大，但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致。因为A260值几乎是峰值，所以有必要在其两边各取一个：A280和A230。干净的核酸A260/A230应该在2左右。如果有在230 nm 处的强吸收提示污染有酚盐离子等有机化合物 1.蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。 2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。

紫外分光光度法测蛋白质的含量

紫外分光光度法测蛋白质的含量一、实验目的 1、学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。 3、掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。二、实验原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。该测定方法简单、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。 1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外光：10-400 nm 可见光：400-780 nm 特点：带光谱、分子光谱应用：定性分析-最大吸收波长；定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法） a.定性分析原理：吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状. b.定量分析原理：根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。 c.仪器组成部件: 各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。

2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：（1）蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。（2）由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收值也不同。据初步统计，浓度为1.0 mg/mL 的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。（3）若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在280nm处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰。核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A 280-0.74A 260 (A 280和A 260 分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值) 还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量：蛋白质浓度（mg/mL）=F* A 280 *D*1/d 其中A 280 为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值；d为石英比色皿的厚度（cm）;D为溶液的稀释倍数；F为校正因子（4）蛋白质的肽键在200—250nm有强的紫外吸收。其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其波长越短，光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的

紫外分光测蛋白浓度

蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或且已经知道其消光系数作为参考。另外，不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力，可能发生干扰。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定OD260nm，与OD280nm。，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化之蛋白质的微量测定。主要缺点：当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生—定误差，混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。 [操作] 取试管7支,各管混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以空白管调节零点，分别于280nm、260nm波长下测定各管光密度。 [计算] (一)直接根据标准液与待测液的光密度值(OD280nm)，或从标准曲线，求得样本蛋白质含量。以标准管各管光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线，然后根据测定管光密度值，直接查标准曲线求得样本中蛋白质的含量。 1．选一种与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品，用生理盐水稀释至浓度为lmg/m1，作为稀释标准蛋白质溶液。 2．用生理盐水稀释待测样本蛋白质至浓度约为lmg/m1，即为稀释样本蛋白质溶液。 (二)利用经验公式直接计算样本蛋白质含量，准确吸取血清样本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，即500倍稀释，在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。 1、OD280/OD260＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式：样本蛋白质含量(mg/m1)＝1.45OD280一0.74OD260 2、OD280/OD260﹥1.5时，用Lamber-Beer定律计算：样本蛋白质含量(mg/m1)= OD280/K×L＝（OD280/6.3×1）×10g/L 本实验样品：牛血清白蛋白E1%cm＝6.3（100ml/cm.g）

紫外分光光度法测蛋白含量

紫外-可见分光光度法测蛋白质的含量一、实验目的 1.了解紫外-可见分光光度计的基本结构。 2.掌握紫外-可见分光光度法测量蛋白质含量的基本原理。 3.熟悉紫外分光光度计的实验技术。二、实验原理蛋白质分子结构中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环所含的共轭双键，具有吸收紫外光的性质，其最大吸收波长为280nm左右。在一定实验条件下，蛋白质溶液的吸光度与其浓度符合Lambert-Beer定律，据此可对蛋白质进行定量分析。三、实验试剂与仪器 1.紫外可见分光光度计 2.石英比色皿、胶头吸管、比色管、烧杯、容量瓶 3.生理盐水、蛋白质标准溶液、未知蛋白质溶液四、实验步骤 1.配制标准溶液及样品溶液：准确移取5.00mg/ml牛血清白蛋白标准应用液0.00ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml及0.1ml未知蛋白质溶液分别置于10ml比色管中，用生理盐水稀释至10ml刻度，摇匀。 2.吸收光谱曲线的绘制：以生理盐水作参比，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，从200nm-400nm扫描牛血清白蛋白的吸收曲线并找出最大吸收波长λ 。 max

3.标准曲线绘制：以生理盐水作参比，在λ 波长下测定吸光度，以 max 溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 4.测定未知蛋白溶液。五、实验结果 1.数据记录与标准曲线绘制：表1 不同浓度蛋白溶液及其吸光度值标准1 标准2 标准3 标准4 标准5 样品浓度c(mg/ml) 0.000 0.250 0.500 0.750 1.000 待测c 吸光度值A 0.007 0.321 0.666 1.049 1.368 0.740 2.数据处理：根据线性方程，可求得吸光度值A=0.740的得测c=0.542mg/ml, 由于未知蛋白质溶液被稀释了100倍，故原未知蛋白质溶液浓度为54.2mg/ml。

紫外测定蛋白质的浓度吸收法

★ ★★★★ 实验6紫外测定蛋白质的浓度吸收法一、目的 1、了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。 2、了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。二、原理由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯坏含有共轨双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280mn波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（Ads。）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较人的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嚓吟、喀咗等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。三、材料、试剂与器具（一）试剂 1、标准蛋白溶液准确称取经微屋凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为lmg/mL的溶液。 2、待测蛋白溶液配制成浓度约为Img/niL的溶液。（二）器具 1、紫外分光光度计。 2、试管和试管架。 3、吸量管。四、操作步骤（一）标准曲线法 1、标准曲线的绘制按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm 波长处分别测定各管溶液的A：so值。以A'so值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2、样品测定取待测蛋白质溶液ImL,加入蒸馆水3mL,摇匀，按上述方法在280mn波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。（二）其他方法（1）将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260mn和280mn处分别测出A值，然后利用280mn 及260mn -F的吸收差求出蛋白质的浓度。计算蛋白质浓度（mg/mL） =1.45A2SO-O.74A26O 式中A'so和A260分别是蛋白质溶液在280mn和260mn波长下测得的光吸收值。此外，也可选计算出A28a/A2（5o的比值后，从表6-1中查出校正因子“F”值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将“F”值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。表6-1紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子注：一般纯蛋白的光吸收比值（A3'A M＞）约为1.8,而纯核酸的比值约为0.5。蛋白质浓度（mg/mL） =Fxix A280 x N d 式中A逊为该溶液在2801）111卜•测得的光吸收值：d为石英比色杯的厚度（cm）； N为溶液的桶释倍数。（2）对于稀蛋白质溶液，还可用215mn和225nm的吸收差来测定浓度。从吸收差AA 与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。吸收差AA = A215-A225 式中的A215和A225分别是蛋白质溶液在2151U11和225nm波下测得的光吸收值。此法在蛋白质含量达20—100“g/mL的范閑内，是服从Eeer定律的。氯化钠、硫酸钱以及 lX10“moL，L磷酸、硼酸和三疑甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。但是IX lO hnoLr乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在2151U11波长下的吸收较大，不能应用，必须降至5X10-3moLL 才无显著影响。由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH的改变而有高低，故应紫外吸收法时要注意溶液的pH,最好与标准曲线制订时的pH—致。

实验6紫外测定蛋白质的浓度吸收法

实验6 紫外测定蛋白质的浓度吸收法一、目的 1、了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。 2、了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。二、原理由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。三、材料、试剂与器具（一）试剂 1、标准蛋白溶液准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为1mg/mL的溶液。 2、待测蛋白溶液配制成浓度约为1mg/mL的溶液。（二）器具 1、紫外分光光度计。 2、试管和试管架。 3、吸量管。四、操作步骤（一）标准曲线法 1、标准曲线的绘制按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm 波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2、样品测定取待测蛋白质溶液1mL ，加入蒸馏水3mL ，摇匀，按上述方法在280nm 波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。（二）其他方法（1）将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm 和280nm 处分别测出A 值，然后利用280nm 及260nm 下的吸收差求出蛋白质的浓度。计算蛋白质浓度（mg/mL ）=1.45A 280-0.74A 260 式中A 280和A 260 分别是蛋白质溶液在280nm 和260nm 波长下测得的光吸收值。此外，也可选计算出A 280/ A 260的比值后，从表6-1中查出校正因子“F ”值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将“F ”值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。表 6-1 紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子注：一般纯蛋白的光吸收比值（A 280/A 260）约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5。 280A N ⨯⨯⨯1 蛋白质浓度(mg/mL)=F d 式中A 280为该溶液在280nm 下测得的光吸收值；d 为石英比色杯的厚度（cm ）；N 为溶液的稀释倍数。（2）对于稀蛋白质溶液，还可用215nm 和225nm 的吸收差来测定浓度。从吸收差A ∆与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。吸收差 21522 A A A ∆=- 式中的A 215和A 225分别是蛋白质溶液在215nm 和225nm 波下测得的光吸收值。此法在蛋白质含量达20—100g μ/mL 的范围内，是服从Beer 定律的。氯化钠、硫酸铵以及1×10-1mol/L 磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。但是1×10-1mol/L 乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在215nm 波长下的吸收较大，不能应用，必须降至5×10-3mol/L 才无显著影响。由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH 的改变而有高低，故应紫外吸收法时要注意溶液的pH ，最好与标准曲线制订时的pH 一致。

蛋白浓度测定的方法

蛋白浓度测定的方法蛋白浓度测定的方法： 1. 紫外分光光度法紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是讲蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法，不需要任何试剂，操作简单且易回收。蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。 2. 双缩脲法利用半饱和硫酸铵或27.8%硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化学研究工作中，如一些特殊蛋白质—酶、蛋白激素等的分离和纯化。蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物(双缩脲反应)，且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。 3. Folin-酚试剂法目前实验室较多用Folin-酚法测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的

物质都会影响测定结果的准确性。其原理是蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。4. 考马氏亮蓝G-250 此方法是1976年Bradform建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。考马氏亮蓝G-250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm 的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。

紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理

紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理介绍紫外分光光度法是常用的一种测定蛋白质浓度的方法。本文将详细介绍紫外分光光度法的原理以及其在蛋白质浓度测定中的应用。紫外分光光度法原理紫外分光光度法利用蛋白质溶液对紫外光的吸收特性进行测量，从而确定蛋白质的浓度。蛋白质分子中的色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）等芳香族氨基酸在紫外光区域具有吸收峰，通过测量吸光度可以间接测定蛋白质的浓度。实验步骤以下是使用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的一般实验步骤： 1. 制备蛋白质样品制备含有待测蛋白质的溶液样品。确保溶液浓度适中，避免过高或过低浓度对测定结果产生影响。 2. 预热紫外分光光度计打开紫外分光光度计并进行预热，使其达到稳定的工作温度。 3. 校准光程使用标准样品校准紫外分光光度计的光程，确保准确测量待测样品的吸光度。 4. 测定吸光度将待测样品倒入光度池，使用紫外分光光度计测量样品溶液在特定波长下的吸光度。常用波长为280nm，其对色氨酸具有最大吸收峰。

5. 绘制标准曲线制备一系列已知浓度的蛋白质标准溶液，分别测定它们的吸光度。利用这些测定值绘制标准曲线，用于计算待测样品的蛋白质浓度。 6. 计算蛋白质浓度根据标准曲线，计算出待测样品的蛋白质浓度。根据不同的光吸收系数和波长，可以得出不同氨基酸的摩尔吸光系数，再根据摩尔吸光系数进行计算。紫外分光光度法的优势紫外分光光度法具有以下优势： 1.灵敏度高：对浓度较低的蛋白质样品也能够进行准确测量。 2.快速便捷：测量过程简单，不需要复杂操作。 3.非破坏性：样品在测量过程中不受损伤，可以进行进一步的分析。紫外分光光度法的局限性紫外分光光度法也存在一定的局限性： 1.干扰物质：一些样品中可能含有其他吸收波长与蛋白质相近的物质，会对测定结果产生干扰。 2.重复性：在批量测定时，光度池的装填和清洗对结果的重复性有一定影响。 3.波长选择：根据不同蛋白质的吸收特性，选择适当的波长进行测量，否则会导致测定结果不准确。结论紫外分光光度法是一种常用的测定蛋白质浓度的方法。通过测量蛋白质对紫外光的吸光度，可以间接测定蛋白质的浓度。该方法具有灵敏度高、操作简便等优势，但也存在一定的局限性。在实际应用中，需要根据具体的实验条件和样品特性进行优化，以获得准确可靠的测定结果。参考文献 1.Smith, P.K., et al. (1985). Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Analytical Biochemistry, 150(1):76-85.

紫外分光光度计测蛋白质含量

紫外分光光度法测定蛋白质含量 1 仪器与试剂 TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管标准蛋白质溶液：5.00 mg.mL-1溶液 0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液 2 实验方法与原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。该测定法具有简单灵敏快速高选择性，且稳定性好，干扰易消除不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。 3 实验步骤 3.1 准备工作 3.3.1启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。 3.3.2 在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。 3.3.3 将空白放入测量池中，点击START扫描空白，点击ZERO校零。 3.3.4 标准曲线的制作。 3.2 测量工作 3.2.1吸收曲线的绘制

用吸量管吸取2mL5.00mg/mL标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液为参比，在190 nm～400nm区间，q全波段扫描。 3.2.2标准曲线的制作用吸量管分别吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5mL 5.00 mg.mL-1标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm 石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在280 nm处分别测定各标准溶液的吸光记录所得读数。度A 278 3.2.3样品测定取适量浓度的待测蛋白质溶液3mL，按上述方法测定278 nm处的吸光度。平行测定三份。 4 实验结果记录 4.1 吸收曲线根据全波段扫描结果，已知蛋白质的最大吸收峰位于280nm左右。（λmax=278nm） 4.2 标准曲线的制作以蛋白质标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。绘制的蛋白质标准曲线如下图所示。

紫外分光光度计测蛋白质含量

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 紫外分光光度计测蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质含量 1 仪器与试剂TU-1901 紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管标准蛋白质溶液：5.00 mg.mL-1 溶液 0.9% NaCl 溶液，待测蛋白质溶液2 实验方法与原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。紫外-可见吸收光谱法又称紫外可见分光光度法,它是研究分子吸收 190nm～750nm 波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于 280nm 附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。该测定法具有简单灵敏快速高选择性，且稳定性好，干扰易消除不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。 3 实验步骤3.1 准备工作 3.3.1 启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。 3.3.2 在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。 1/ 7

3.3.3 将空白放入测量池中，点击 START 扫描空白，点击 ZERO 校零。 3.3.4 标准曲线的制作。 3.2 测量工作 3.2.1 吸收曲线的绘制

(完整word版)紫外吸收法测蛋白质含量

紫外吸收法测定蛋白质浓度一．目的 1.了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理. 2.熟悉紫外分光光度计的使用。二．原理蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近。最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯尔比尔定律： A=abc “A”为溶液的吸光度值，“b”为石英比色池的厚度，“c”为蛋白质溶液的浓度。紫外—可见吸收光谱法又称紫外—可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm~750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外—可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱,是带光谱。紫外—可见分光光度法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成,如下所示：由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光，该单色光通过样品池对样品溶液吸收后,通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池;紫外光区采用氘灯

光源、石英吸收池。蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。由于核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质测定有一定的干扰作用,但核酸的最大吸收峰在260nm处。如同时测定260nm的光吸收,通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。以此如溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm处的吸光度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。三．器材 1.1800S型紫外可见分光光度计 2.容量瓶100ml（×1） 3.试管若干 4.移液管若干 5.吸水纸 6.檫镜纸四．试剂 1.酪蛋白标准溶液：1mg/ml 2.样品液:血清稀释100倍