DNA连接2
ssb对dna二级结构
ssb对dna二级结构
DNA的二级结构是指DNA分子中两条螺旋状的链之间的结构。
单链DNA具有一定的二级结构，而双链DNA则形成了经典的双螺旋结构。
而SSB（Single-Strand Binding）蛋白则在DNA复制和修复过程中发挥着重要的作用。
SSB蛋白是一种结构特殊的蛋白质，它的主要功能是在DNA复制和修复过程中保护单链DNA，防止其形成二级结构或被降解。
在DNA复制过程中，双链DNA需要被解开成两条单链DNA，而这些单链DNA容易形成二级结构，影响DNA复制的进行。
SSB蛋白的作用就是结合在单链DNA上，阻止其形成二级结构，保持DNA的单链状态，为DNA复制酶提供一个稳定的模板。
此外，SSB蛋白还在DNA损伤修复过程中发挥作用。
当DNA受到损伤时，会产生单链断裂或者缺失，这时SSB蛋白会结合在损伤的单链DNA上，保护其不被降解，并且为DNA修复酶提供修复的模板。
总的来说，SSB蛋白在维持DNA的单链状态、防止DNA二级结构的形成以及在DNA损伤修复中发挥着重要作用。
它的存在保证了
DNA复制和修复过程的顺利进行，对维持细胞的遗传稳定性起着重要的作用。
高二生物制作dna双螺旋结构模型
实验十制作DNA双螺旋结构模型一、教材分析本实验既可加深学生对“DNA结构”的感性认识和理解，也可以培养学生的动手能力。
教材首先介绍了该实验的“实验原理”。
从制作DNA模型前应该考虑的问题、制作过程做了详细阐述。
教材接着说明了制作的“目的要求”。
要求通过制作DNA双螺旋结构模型，加深对DNA 分子结理解和认识。
教材第三部分清楚地列出了该实验所需要的“材料用具”。
特别应明白用什么代表磷酸、什么代表糖、什么代表含氮碱基。
以及用什么对它们进行连接。
教材第四部分更为详细地介绍该实验的“方法步骤”。
从制作“基本单位→脱氧核苷酸长链→DNA结构→DNA的空间结构”这一步骤详细地作了说明。
因此，我们从如下几方面对该实验做本质性的准备：1．知识结构的联系：要明确DNA的化学元素是C、H、O、N、P，由它们组成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基，再由1分子磷酸、1分子脱氧核糖和1分子的含氮碱基组成基本单位一—脱氧核苷酸；再由脱通过聚合作用形成DNA分子。
2．掌握该实验的知识点：对理解和掌握“DNA分子的功能（复制和表达)”、“遗传和变异”以及“基因工程”打下了较好的理论基础。
3．实验操作的关键：该实验成败的关键是连接。
二、教学目标1 知识目标①应用：碱基互补配对原则。
②掌握：制作DNA双螺旋结构模型的方法。
2 能力目标通过制作“DNA双螺旋结构模型”培养学生的动手能力。
3 情感目标①通过小组实验，培养学生的合作精神。
②通过实验，培养学生的实事求是精神。
三、重点·实施方案1 重点掌握制作“DNA双螺旋结构模型”的技术。
2 实施方案①对每小组进行关键步骤指导；②对连接方式进行讲解。
四、难点·突破策略1 难点“DNA双螺旋结构模型”的制作。
2 突破策略①板书说明制作的程序和重要环节。
②诱导学生理解各步骤的连接及原理。
五、实验原理DNA分子具有特殊的空间结构一一规则的双螺旋结构，这一结构的主要特点是：(1)DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成。
重叠延伸PCR技术
反应机理
F2 引物 F1 引物
5’ 3’ 3’ 5’
基因B
5’ 3’
R2 引物
3’ 5’
基因A
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
R1引物
加入酶，buffer等反应液。PCR仪中解链， 退火——单链模板结合
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 加入F1引物、R2引物
5’ 3’
5’
3’
无目标产物
5’ 3’
F1 引物
3’ 5’
R2 引物
重叠延伸PCR技术
（SOE PCR）
1. 重叠延伸PCR技术的概念
• 重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采 用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的 延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术可以 很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其 成功的关键是重叠互补引物的设计。SOE PCR在基因的定点突变、 长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独 特的应用。
答案： （1）越高 （2）引物2和引物3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失 去作用 （3）3 （4）2 （5）目的基因与载体结合 将重组DNA导入受体细胞
解析：重叠延伸PCR技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、 基因的定点诱变等方面有广泛的应用。老师要予以关注，在讲评中可适当拓展。G 与C碱基对之间是三个氢键，引物中G—C含量越多，越稳定。由图可知，因为引物 2、3有互补片段，但引物1、4没有互补片段。利用引物1、2进行扩增，可产生 两种DNA片段，利用引物3、4进行扩增，可产生 ，其中a、c 分别是以引物1和引物4扩增产生的DNA片段，是相同的DNA片段，b、d分别是以引 物2和引物3扩增的DNA片段，碱基序列是不同的，共三种。因为新的核苷酸链必须 从5′端到3′端，在第二阶段，含引物1和引物4的脱氧核苷酸链因为有互补的碱基序 列，而部分互补，并能互为模板进行延伸，但含引物2和引物3的脱氧核苷酸链虽 能部分互补，但因方向问题，不能延伸。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
染色体与DNA2
？
B-DNA的变化情况：
＊ DNA在水溶液中, 构型偏B型状态 ＊ DNA以10 bp/helix为最稳定构型 ＊ 小于10bp/helix 向正超螺旋发展(紧缠态)
＊ 大于10bp/helix 向负超螺旋发展(松缠态)
天然的DNA都存在负超螺旋 但一些生命活动过程中存在正超螺旋
二、超螺旋状态的描述
胞嘧啶核苷酸（CMP）
尿嘧啶核苷酸（UMP）
二、DNA的一级结构 1、四种脱氧核糖核苷酸 脱氧核糖的5’位和与其相邻的 戊糖的3’位之间由3’,5’磷酸二 酯键连接。 核酸由具有方向性的糖-磷酸骨 架及结合于糖分子1’位的碱基 构成。 磷酸带负电，因此核酸是具有 强负电性的多聚大分子。
3’ 5’
DNA、RNA的一级结构
3、一级结构的功能 指DNA分子中的碱基排列顺序
贮存遗传信息
决定DNA的高级结构
DNA的二级结构
* 1953.
Watson & Crick提出
右手 B- DNA Double helix Model
Phosphodiester Backbone
一、双螺旋模型
· 直径2nm · 螺距为3.4nm（任一条链
本节学习重点
• DNA双螺旋结构（主链，侧链和碱基；氢 键，碱基堆积力） • DNA一级结构 • DNA二级结构（A-DNA, B-DNA, Z-DNA） • DNA三级结构（L=T+W，拓扑异构酶I和 Ⅱ）
核酸的化学组成
碱基 核苷 核酸 核苷酸 磷酸
戊糖
HOCH2 H H
O H
OH H
HOCH2 H H
3、拓扑异构酶的生物学功能 a、恢复由一些细胞过程产生的超螺旋 如：复制叉前面正超螺旋的消除 转录酶前正超螺旋的消除，后面负超螺旋的产生 b、防止细胞DNA的过度超螺旋
人教版高二生物选修三知识点总结：专题二细胞工程
选修3《现代生物科技专题》知识点总结专题2 细胞工程（一）植物细胞工程1.植物组织培养技术（1）原理：植物细胞的全能性全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞脱分化再分化发育（2）过程：离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织胚状体植物体常用的植物激素生长素和细胞分裂素。
（3）用途：微型繁殖、作物脱毒（选材应该选择茎尖组织）、制造人工种子、单倍体育种（最大的优点是明显缩短育种年限，得到的全为纯种）、筛选突变体、细胞产物的工厂化生产。
（4）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。
2.植物体细胞杂交技术（1）原理：细胞膜的流动性、植物细胞的全能性（2）过程：去壁的方法：酶解法；诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电激等。
化学法是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。
（4）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
（二）动物细胞工程1. 动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
（2）原理：细胞增殖（3）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
（4）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
（5）动物细胞培养需要满足以下条件①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。
通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。
此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。
通常需加入血清、血浆等天然成分。
专题9 现代生物科技专题 精研重难点(2) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别 和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。 答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制 一个至多个限制酶切割位点 用含有该抗生素的 培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱 动转录过程
精研重难点(二) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
从“高度”上研究高考
[典例] (2021·福建高考)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫 蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。 科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过 PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的 基因位置。选用的引物组合应为__________。
B．NdeⅠ和XbaⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ
解析：构建重组质粒时，要将目的基因插入到启动子和终止子之间，而且不能 破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位。故只能选用Nde Ⅰ 和BamH Ⅰ切割质粒，因此在PCR扩增的该基因的两端需分别引入Nde Ⅰ和 BamH Ⅰ两种限制酶的识别序列。 答案：A
[解析] (1)密码子位于 mRNA 上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密 码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对 引物应分别位于 A 位点和 B 位点的外侧。
(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P，但后续需进一步将重组 载体P′中的MT基因接入载体E，此时需将MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ两个酶切 位点之间，故选EcoRⅤ将载入体P切开；由于E.coli DNA连接酶只能连接黏性 末端，而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端，结合题意可知， MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构 成重组载体P′。②由图1可知，载体P′不含有表达MT基因的启动子和终止子； 为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图1可知，载体 P′和载体E均含有Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点，故可选用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶进行酶 切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是感受态细胞法，需用钙离子处理大肠杆 菌。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定， 故即使MT工程菌的MT蛋白相对表达量较高，也无法说明已经成功构建能较强 吸附废水中重金属的MT工程菌。
【公开课件】DNA的结构+课件高一下学期+生物人教版必修二
双螺旋解开放大
TA GC CG AT GC CG TA GG C
DNA片段的立体结构模式图
DNA片段的平面结构模式图
二、DNA的结构
5'
胸腺嘧啶脱氧核苷酸 磷酸二酯键 鸟嘌呤脱氧核苷酸
3'
TA GC CG AT GC CG TA GG C
3'
一条脱氧核苷酸链片段
DNA分子中 磷酸 = 脱氧核糖 = 含氮碱基
C-G间：3个
单链中相邻碱基：通过脱氧 核糖一磷酸一脱氧核糖连接
氢键越多，结合力越强。G和C的含 量越多，DNA的结构稳定性越强。
特点：(3)两条链上的碱基通过氢键连
接成碱基对，并且碱基配对具有一定
规律：A一定与T配对，G一定与C配
对。碱基之间的这种一一对应的关系，
叫作碱基互补配对原则。
5'
特点
DNA分子的稳定性
五、巩固练习
2. 书本P52页 在含有4种碱基的DNA片段中，腺嘌呤有a个，占该 区段全部碱基的比例为b，则（ C ） A.b≤0.5 B.b≥0.5 C.胞嘧啶为a（1/2b-1）个 D.胞嘧啶为b（1/2b-1）个
预告
制作DNA双螺旋结构模型比赛
时间：半期考后一周 材料用具：曲别针、泡沫塑料、纸片、扭扭棒、牙签、橡皮泥、铁丝等 常用物品，都可用作模型制作的材料。不可以网上直接购买模型。
腺嘌呤脱氧核苷酸
胸腺嘧啶脱氧核苷酸
鸟嘌呤脱氧核苷酸
胞嘧啶脱氧核苷酸
一、DNA双螺旋结构模型的构建
脱氧核苷酸如何形成DNA分子呢？
一、DNA双螺旋结构模型的构建
资料2： 1951年，波林（1954年诺贝尔化学奖
得主），发现蛋白质的长链结构。由此启 发：DNA是由许多个 脱氧核苷酸 连 接而成的 长链 。
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本实验由二个方面组成:
1. 质粒ＤＮＡ转化大肠杆菌。 质粒转化不同细菌有不同的转化效率，转化 效率的高低与实验的成败直接相关， 通常转 化效率可达１０５－１０７转化子/μg DNA。 获得高转化效率的关键是感受态体菌的制备。
所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理 状态。 关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前 主要有两种假说： １．局部原生质体化假说 －－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮ Ａ的酶位点， 使ＤＮＡ分子能进入细胞。
２互补法
现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌 ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的 调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一 个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基 因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生 色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（xgal）培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而 使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重 组子和非重组子。
实验8 DNA的连接
一．实验目的及背景
当我们已经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段 之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因 工程药物的生产），还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研究中。
三．实验步骤
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液： a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。 b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重 新退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。 c. 加入： １０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer 1μl Ｔ４ＤＮＡ连接酶 0.5μl 5mM ATP 1μl ２．盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。 ３．１２℃下过夜连接反应。 ４．反应结束后于－２０℃保存。
制备感受态细胞
现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受 体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成 双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。
1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进 行的。
连接反应中值得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 二者的作用机理类似。
3. DNA的平未端和粘性末端
由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末 端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性 末端连接。 二者连接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的，
4.碱性磷酸酶处理质粒载体
为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的 浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮ Ａ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体 用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸 基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可 在转化细胞后得以修复。
四．结果与分析讨论
１．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪 些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？
二、实验试剂
ＬＢ培养基 质粒ＤＮＡ（含Amp抗生基因），受体菌 CaCl2 0.1M Amp
三．实验方法
一、感受态细胞制备 １．将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，３７℃培养１６～２０小时。 ２．挑取单菌落转入２０ｍｌ ＬＢ培养基锥瓶中，３７℃振荡过夜。 ３．从中取２ｍｌ菌液转入５０ｍｌ ＬＢ培养基中３７℃振荡培养４－ ５小时， 测ＯＤ１００达０．４～０．５。 ４．培养物于冰上１０分钟。 ５．转入－５０ｍｌ离心管，于４０００ｒｐｍ下４℃离心１０分钟。 ６．弃上清，倒置离心管１分钟，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷 的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上１０分钟。 ７．4,000rpm 4℃离心１０分钟，弃上清。 ８．加入2ml，0.1M CaCl2悬浮细胞，于４℃过夜。
2.重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则 上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有 该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等） 这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基 上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。
Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制
Ｔ４连接酶作用分三步： １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形 成酶－ＡＭＰ复合物。 ２． 酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷 酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮ Ａ腺苷化。 ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起 来.
2.连接反应的温度
ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳 定，折衷方法是１２℃过夜。
5.连接反应的检测
连接反应成功与否，最后的检测要通过下一 步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确 定。 我们下面的实验从粘性末端为例操作。
二、实验试剂 １．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇 500μl/ml BSA ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ４．5mM ATP
二、转化
１．在1.5ml Eppendorf管中加入２００μl感受态细 胞和１０μl 40ng DNA溶液， 温和混匀，于冰上３ ０分钟。 ２．于４２℃水浴９０秒。 ３．冰浴２分钟。 ４．加入８００μl ＬＢ 液体培养基３７℃ ４５分 钟。 ５．取２００μl涂布于含Amp(50μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
四．结果与分析
电泳检查连接结果 １．如何判断连接效果的成功性？
问题与讨论：
１．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提 高连接效率。
2．Ｄ外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组 质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性 克隆。在此阳性克隆中，ＤＮＡ可在生物体系中大 量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这 是ＰＣＲ体外扩增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮ Ａ重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株 已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。