基因捕获技术

・ ’( ・
国际遗传学杂志 ’((< 年 ’ 月 ), 日第 ’! 卷第 ) 期
G7@ Q >?7?@
R?H ),， ’((<， S%2 ’!，$% & )・ 综述 ・基 Nhomakorabea捕获技术
党素英 王铸钢
【摘要】 基因捕获技术是一种产生大规模基因突变的便利手段， 对于揭示大量基因序列所对应的 基因功能具有重要应用价值。本文综述了基因捕获技术的基本原理和研究方法、 发展现状及远景。 【关键词】 基因捕获； 基因捕获载体； 表达筛选 “!"#". $%&’’(#)”*"+,#(-." & !"#$ %&. ’()* ，+"#$ ,-&. *.)* & （ !/0.123/)2 45 6/7(8.9 $/)/2(8: ，%-.)*-.( B. 3.(9 ：C-&*.)*D9 >(0 & )<# & 843
［!］ 序列 ， 这样即使报告基因与 ;0501" "#)’: 5+)"， >?./）
捕获基因不发生融合也可产生报告基因翻译产物。 尽管 ./ 细胞中大量基因具转录活性， 为了获得全 基因组突变克隆必须使用不依赖于捕获基因表达的 筛选策略。因此， 在第一、 二代基因捕获载体中应用 报告基因和含自身启动子 （ @AB） 的筛选标记基因 抗药性的产生不需要捕获基因的表达。不同的 !"# ， 是， 第二代基因捕获载体 （ *04:9()’%**+#,） 中筛选标 记基因 !C末端没有 *04:9 加尾信号而含有一剪接供
内利用同源重组产生特定基因突变的 B@?/ =?22， -K） 基因打靶技术， 即基因敲除和敲进技术 （ L7%=L.%5@ %A 是目前被用来研究结构信息明确的基因功 L7%=L.17） 能的最重要的手段之一。然而， 由于同源重组几率 低、 动物繁育耗时费力且产生的功能失活突变 （无义 突变， 常常与疾病中发现的分子损伤 7522 /5@0@1%7B） 类型不同， 因此， 随机突变筛选策略更受研究者青 睐。 基因捕获是一种结合随机突变与对分子信息明 确的基因突变二者之优势的突变策略， 即 “随机基因 打靶” ， 广泛应用于植物、 线虫、 果蝇及小鼠的研究 中。 8 基因捕获的基本原理 基因捕获的方法酷似以报告基因为诱饵来捕获 基因。其基本过程是将一含报告基因的 M$N 载体 随机插入基因组， 从而产生内源基因失活突变， 并通 过报告基因的表达激活提示插入突变的存在， 及突 变内源基因表达特点。通过筛选得到的插入突变的 -K 细胞克隆经囊胚注射转化为基因突变动物模型， 进而分析表型来研究突变基因功能。每一种 -K 细 胞克隆中含有不同的突变基因， 在短期内可建立大 量含不同基因突变的 -K 细胞克隆库。突变基因的 序列可通过基于 O*P 的一些方法鉴定， 同时还可能
图 ! " 种基本捕获载体及 #$%&’ 捕获载体 !"# ( ! $%&’’ #’(’))&*++"(# ,’-).&/ *(0 +.123))&*++"(# ,’-).& 载体插入到 % 基因的增强子附近时， 报告基因 !"#$ 转录 *+ 增强子捕获载体在 !"#$ 报告基因上游含有一个最小的截短型热休克诱导启动子， 并翻译。 ,+ 基因捕获载体插入到内含子中， 产生 - 基因外显子与 !"#$ 报告基因的融合转录本； % 基因转录激活时， .+ 启动子捕获载体需插入 到 % 基因的编码区产生 % 基因与 !"#$ 的融合转录本及蛋白。 /+ #$%&’ 捕获载体以一外显子形式参与拼接， 产生 !"#$ 与其上游 % 基因外显子融 合转录本的同时， &’( 与下游 % 基因外显子融合。 （ )1*%*.2$34/*35； )15$： !0 1*%： ! ! !0 1*%*.2$34/*35)65$7 8934$:；;<= 0 >?：@5A#53 34B#%5C D4A93 2@&B4/4:5 E4:*35；@ !0 *.24:：@9B*:!0 *.24:；#’：#$%&*/5) :&%*24$:；FG?：#@$3#@$1%&.5A*25 E4:*35 ! ( ） *( H:@*:.5 2A*##4:1 D5.2$A 43 .$B#$35/ $8 * B4:4B9B 2A9:.*25/ #A$B$25A 4:/9.5/ ,& @5*2 3@$.E *:/ /$I:32A5*B A5#$A25A 15:5 )"#$ ( J:35A24$: $8 5:@*:.5 2A*##4:1 D5.2$A 4:2$ 2@5 3425 */K*.5:2 2@5 5:@*:.5 $8 15:5 % ，2A*:3.A4#24$: *:/ 2A*:3%*24$: $8 L*.M 15:5 I4%% ,5 4:424*25/( , ( J:35A24$: $8 15:5 2A*##4:1 D5.2$A 4:2$ 2@5 4:2A$: $8 15:5 % ，8934$: 2A*:3.A4#2 $8 15:5 % *:/ )"#$ I4%% ,5 5C#A5335/ I@5: 5:/$15:$93 15:5 % 43 *.24D*25/( .( J:35A24$: $8 #A$B$25A 2A*##4:1 D5.2$A 4:2$ 2@5 .$/4:1 A514$: $8 15:5 % B*& %5*/ 2$ 5C#A5334$: $8 * 8934$: 2A*:3.A4#2 $8 15:5 % *:/ )"#$ ( /( #$%&’ 2A*##4:1 D5.2$A I$AE3 *3 *: 5C$15:$93 5C$:( HC#A5334$: $8 )"#$ /5) #5:/3 $: 5C#A5334$: $8 5:/$15:$93 15:5 % 9#32A5*B 4:35A24$: 3425 *:/ /$I:32A5*B #$%&’ $8 15:5 % (（ )1*%： )15$： )1*%*.2$34/*35 0 65$7 89) ! !0 1*%*.2$34/*35； ! ! 34$:；;<=)>?：@5A#53 34B#%5C D4A93 2@&B4/4:5 E4:*35；@ )*.24:：@9B*: ! )*.24:；#’：#$%&*/5:&%*24$:；FG?：#@$3#@$1%&.5A*25 E4:*35 ! ( ） !
［<］ 型载体也已问世， 如 /H%’#"5 等 利用分泌蛋白的原
理及! (,%4 活性在内质网被灭活的特点设计了一种 载体专门用以捕获在 ./ 细胞中表达的编码穿膜分 泌蛋白的基因 （见图 2） 。 一些研究小组还在载体中引入了重组位点， 以
［I， J］ 实现由重组酶介导的捕获位点插入后修饰 。这
［-］ 变 。
获的百分比， 如果以多种类型的载体进行足够多次 的突变实验所获得的突变克隆就可以覆盖整个 ./
［2］ 细胞基因组中全部基因位点 。因此， 新型捕获策
略和载体不断被设计应用。 早期基因捕获载体的特点是当报告基因与内源 基因的读码框一致时， 产生由内源蛋白的 8 末端与 。近来 报告基因蛋白融合的活性蛋白质 （见图 -;） 对这一类载体所做的改进是在报告基因与 /9 序列 间插入一来源于脑、 心肌炎病毒的 >?./ （ +#)"’#%4 ’+(
基 金 项 目： 国家重点基础研究发展计划 （ !"# ） 项目 （ $%& ’(()*+,(!!()） 作者单位： 上海交通大学医学院遗传学教研室 ’(((’,， 通讯作者： 王铸钢 （ -./012：345607689 :1; & )<# & =%/）
［)］ 。在 胚 胎 干 细 胞 （ ?/HAF%71= 记来 克 隆 突 变 基 因
国际遗传学杂志 233I 年 2 月 -< 日第 2M 卷第 - 期
>#) N A"#")
O"; -<， 233I， P04 2M，80 Q -
・ 2- ・
发现一些在体内表达或不表达的新基因。 ! 基因捕获载体 根据报告基因在载体中的位置及报告基因激活 表达的方式， 基因捕获分为 ! 种类型。 载体含有一个最 增强子捕获 （ "#$%#&"’()’%**+#,） 小的启动子和翻译起始位点， 当载体整合到顺式增 强子元件附近时， 此增强子将调控报告基因的表达 （见图 -%） 。对报告基因在体内表达的 ./ 细胞系插 入位点进行克隆鉴定发现插入位置邻近编码序列。 关于增强子捕获的诱变比率还未见报道， 但插入的 性质预示由增强子捕获产生功能失活的突变比率较 低， 因此， 增强子捕获载体在小鼠体系中未得到广泛 应用。 载体通常由不含 启动子捕获 （ *’010)"’()’%**+#,） 启动子成分的报告基因和一筛选标记基因组成， 只 有当载体插入到内源基因编码区序列中产生融合转 录本时报告基因才可能表达 （见图 -&） 。因而启动 子捕获的致突变比率很高。然而载体插入到外显子 的频率非常低， 捕获效率较增强子捕获至少低 233 倍。故载体中通常含有一个筛选标记基因， 如新霉 素抗性基因 （ !"# ） 或! （ ,%4%&)05+6%5"） 与 (半乳糖苷酶 （ ， 保证载体插入的细胞克隆 !"# 的融合基因 ( $%& ） ! 被筛选保留。由于插入发生在 789 转录区， 克隆插 入位点就可确定突变基因。 基因捕获载体中在无启动子序列的报告基因上 游和下游分别含有剪接受体 （ 5*4+&" %&&"*)0’， 和 /9） 多聚腺苷酸加尾序列 （ *04:9） （见图 -;） ， 当含有顺式 作用的启动子和增强子元件被捕获基因转录激活 时， 载体 中 /9 与 内 源 基 因 剪 接 供 体 （ 5*4+&" 60#0’， 作用产生上游内源基因编码序列与报告基因融 /7） 合转录本， 使内源基因发生突变， 同时报告基因的表 达提示内源基因的表达特点。融合转录产物可作为 克隆突变基因序列的模板。由于插入发生在内含子 中， 基因捕获的效率较启动子捕获至少提高 <3 倍。 然而选择性剪接 （ %4)"’#%)+=" 5*4+&+#,） 的发生会导致 低水平的野生型转录本产生而形成减效等位基因突