基于qPCR的循环miRNA定量检测的方法探讨
miRNA的常用检测方法研究
miRNA的常用检测方法研究miRNA是一类长度约为22核苷酸的非编码RNA分子，它们能够通过调节靶基因的表达来参与生物体内细胞的生长、分化、凋亡和代谢等生理过程。
miRNA在各种疾病的发生发展中扮演着重要的角色，因此对miRNA的研究也变得越来越重要。
为了更准确、快速地检测miRNA的存在和表达水平，科研人员开展了各种miRNA的检测方法研究。
本文将介绍miRNA的常用检测方法，包括定量PCR、原位杂交、miRNA芯片和次世代测序等。
一、定量PCR定量PCR技术是一种检测miRNA表达水平的常用方法。
由于miRNA分子较小，难以使用传统的RT-PCR方法进行检测。
科研人员开发了一种特殊的PCR方法——逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），常用于miRNA的检测。
在这种方法中，miRNA首先被逆转录成cDNA，然后通过PCR扩增和定量分析miRNA的表达水平。
相比于传统PCR方法，定量PCR技术能够更加准确地检测miRNA的表达水平，对于疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
二、原位杂交原位杂交技术是一种检测miRNA位置和表达水平的重要方法。
在这种方法中，使用与miRNA序列互补的探针标记miRNA，然后通过显微镜观察细胞或组织中miRNA的分布和表达水平。
原位杂交技术能够直观地展示miRNA在生物体内的表达情况，对于研究miRNA在细胞和组织中的功能具有重要的意义。
三、miRNA芯片四、次世代测序miRNA的检测方法研究对于深入理解miRNA在生物体内的功能和作用具有重要的意义，为医学研究和临床诊断提供了重要的工具和方法。
随着科学技术的不断发展，相信miRNA的检测方法研究也会不断更新和完善，为人类健康和生活质量的提高做出更大的贡献。
miRNA的常用检测方法研究
miRNA的常用检测方法研究miRNA（microRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，可以通过调节靶基因的表达水平来影响细胞的生物过程，包括细胞增殖、分化、凋亡等。
miRNA在多种疾病的发生和发展中扮演着重要的角色，因此对miRNA进行准确、灵敏的检测对于疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。
目前，常用的miRNA检测方法包括定量PCR、miRNA芯片、高通量测序等。
本文将对这些miRNA检测方法进行综述，希望对miRNA的检测有所帮助。
一、定量PCR定量PCR是一种常用的miRNA检测方法，包括SYBR Green法和TaqMan法等。
SYBR Green法是通过引物引导，结合SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR，适用于多个miRNA 的同时检测。
TaqMan法则是利用与目标miRNA序列互补的引物和荧光探针进行PCR扩增和实时监测，具有高度的特异性和灵敏度。
这两种方法在miRNA检测中都有广泛的应用，具有准确、灵敏、特异、重现性好等特点。
二、miRNA芯片miRNA芯片是一种高通量的平行检测技术，可以同时检测数百种miRNA的表达水平。
miRNA芯片通过将细胞或组织中的miRNA转录后转化为cDNA，然后标记成荧光探针并杂交到芯片上，最后通过扫描仪进行扫描和信号检测。
miRNA芯片具有高通量、高灵敏度、高效率的优势，但其成本较高，且需要严格的实验技术和数据分析能力。
三、高通量测序高通量测序是一种能够对整个miRNA组进行全面检测的技术，通过对miRNA序列进行测序，可以获取miRNA的全面信息。
高通量测序技术具有高灵敏度、全面性和精准度高的特点，可以发现新的miRNA，同时能够检测miRNA的修饰和异质性。
高通量测序技术的成本较高，需要较长的分析时间，对实验技术和数据分析有较高的要求。
在miRNA的检测中，不同的方法各有优势和局限性，具体选择何种方法应根据实验目的、实验条件和经费预算来决定。
miRNA的常用检测方法研究
miRNA的常用检测方法研究1.原位杂交（in situ hybridization）原位杂交技术是一种广泛应用于miRNA检测的方法。
该技术基于miRNA和其互补的探针（probe）间的互补配对，通过观察上调或下调的信号强度来判断miRNA的存在及相对表达量。
此方法可能不如其他技术在定量方面准确。
2.RT-qPCR实时荧光定量PCR（RT-qPCR）被广泛应用于miRNA检测。
该方法通过引物探针的设计，特异性的扩增目标miRNA，利用荧光信号实现高灵敏度、高特异性和低误差的miRNA检测。
此方法可以获得很高的检测精度和速度，但是相对于其他技术成本较高。
3.Northern blottingNorthern blot是一种利用RNA凝胶电泳、转移和探针杂交检测RNA分子量、丰度及空间分布的方法。
该方法适用于测定miRNA的大小，但是灵敏度较低，需要较大的miRNA数量才能获得可靠的结果。
因此其在miRNA检测中的使用较少。
4.MicroarraymiRNA microarray是一种同时检测大量miRNA在样品中存在与否和表达量的方法。
它通过载入大量的探针来检测miRNA，具有高通量和快速的检测速度。
但是由于探针的种类、长度和相互竞争存在的问题，其实验结果的可重复性和准确性容易受到影响。
5.Next-generation sequencing随着测序技术的发展，高通量测序技术也被应用于miRNA的检测分析。
该方法通过高速测序技术，直接测定miRNA的序列和表达量，具有高度准确性和可重复性。
与其他方法相比，其天然的多样性和广泛性也是其独特优势之一。
但是其数据量大、需较长时间的数据处理和计算，并且实验成本相对较高。
总之，miRNA检测技术各有优劣，不同方法的选择应视具体的实验需求而定。
现阶段综合应用多种技术进行miRNA检测，在不同的研究环节中互补和交叉验证，是对miRNA检测更好的选择。
miRNA的常用检测方法研究
miRNA的常用检测方法研究miRNA是小分子非编码 RNA，具有调节基因表达和参与多种生物学过程的作用。
近年来，由于其在许多疾病的发生和发展中起到重要的调节作用，成为热门的研究方向。
因此，miRNA的检测方法也逐渐得到发展和完善。
本文将对常用的miRNA检测方法进行综述。
（一）荧光定量PCR检测方法荧光定量PCR（qPCR）是目前较为常用的miRNA检测方法之一。
此方法通常包括两个步骤：首先利用逆转录酶将miRNA转录成cDNA，然后在PCR反应中使用荧光探针进行检测。
其中，探针通常为miRNA特异的探针，一旦检测到miRNA与探针结合，就会产生荧光信号。
荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、通量大、分析速度快等优点，但是，该方法的检测结果受到样品特殊性的影响，因此需要针对不同类型的样本做出相应的优化。
（二）microarray检测方法microarray（微阵列）技术可以同时检测大量miRNA的表达水平，通常使用Oligonucleotide或者LNA探针来辨别miRNA。
其优点是一次能测量大量miRNA，自动化高效，但是这种方法相对荧光定量PCR方法相对成本较高，而且对于大规模的样品检测来说，该方法的分辨率会降低且结果会更加复杂。
（三）in situ hybridization 检测方法in situ hybridization技术主要用于miRNA的组织表达定位、功能研究和诊断等。
该技术的基本原理是利用特异探针和标记物来检测组织中miRNA的表达情况，从而实现miRNA在组织中的空间表达。
in situ hybridization的优点是对于局部miRNA的表达情况具有比较高的检测灵敏度，可以检测miRNA在细胞中的亚细胞定位。
但是，需要进行多次操作，时间较为繁琐、耗时较长，分析量相对较小，不适合快速高通量的miRNA检测。
（四）基于高通量技术的检测方法在大规模的miRNA检测过程中，使用传统的方法会遇到处理数据量巨大、数据分析复杂等问题。
miRNA的qPCR检测
miRNA的qPCR检测测序技术的引入促使miRNA研究领域进入快速发展阶段，然而qPCR仍是验证测序数据的重要标准。
本文将为您介绍使用qPCR进行miRNA分析的基本要点，希望能帮助新人快速入门。
什么是miRNA？miRNA是一类小的非编码RNA，能够与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合，通过作用于mRNA，进而介导转录后基因表达。
通常情况下，miRNA-RICS复合物能够通过阻断靶标miRNA的翻译或促使其降解，从而起到抑制mRNA表达的作用。
多数miRNA长度约为18‒22个核苷酸，在样本中的总RNA量中仅占很小的一部分。
通常认为总RNA中miRNA的量大约为0.01%(1)。
经过多年研究，一些mRNA与其相应miRNA之间的调控作用已经取得了较多的数据积累。
miRNA参与的生物过程包括分化、发育、信号转导和宿主感染应答。
此外，多项研究结果表明，miRNA表达失调是癌症等疾病的病因，或是某些疾病的指标。
循环miRNA表达与疾病有关，并且血清和血浆中能作为检测样本来源，因此循环miRNA极有潜力成为疾病相关生物标志物。
目前的miRNA检测技术探究miRNA在细胞水平的功能和转录后的调控机制，必须采用适宜的检测方法。
目前常用的方法包括定量real-time PCR、深度测序和微芯片。
每种方法都有其各自的优缺点，下文会为您详细说明。
定量逆转录PCR（RT-qPCR）在《Annual Review of Analytical Chemistry》的一篇文章中提到，“如果选择一种方法作为miRNA检测的金标准，则非RT-qPCR 莫属。
(1)”之所以这样说，是因为qPCR的多项特性都满足miRNA 检测的关键要求：该方法准确且经济，无需大量的样本，并且检测范围灵活。
使用qPCR检测RNA时，需要留意若干重要因素，包括RNA 的纯度与质控、cDNA合成、引物设计、检测和数据均一化。
检测血液中的miRNA时，数据均一化较为挑战，需要特别考量以进行有效的均一化化并获得有意义的数据结果。
miRNA高效检测方法及具体步骤
miRNA高效检测方法及具体步骤miRNA（microRNA）是一类长度约为22个核苷酸的小分子RNA，它在生物体内起到调节基因表达的重要作用。
由于miRNA在许多生物学功能中的重要性，开展高效检测miRNA的方法具有很大的研究价值。
目前，有许多方法可以用于检测miRNA，本文将介绍其中几种常见的方法及其具体步骤。
1.基于荧光探针的实时定量PCR法实时定量PCR (qPCR) 是一种常见且广泛应用的方法，可以用于miRNA的检测。
该方法在miRNA的检测过程中，首先将miRNA转录为cDNA，然后通过PCR反应扩增miRNA的序列。
在qPCR中，miRNA将与一个标记有荧光探针的引物结合，通过荧光信号的监测，可以对miRNA的数目进行定量分析。
具体步骤如下：- 步骤一：RNA提取：使用RNA提取试剂盒将miRNA从细胞或组织样本中提取出来。
- 步骤二：miRNA逆转录：使用miRNA逆转录试剂盒将miRNA逆转录为cDNA。
- 步骤三：qPCR扩增：使用qPCR试剂盒对miRNA的cDNA进行PCR扩增。
- 步骤四：数据分析：通过检测PCR产物的荧光信号，计算miRNA的表达量。
2. Northern blotting法Northern blotting是一种传统的RNA分析方法，也可以用于miRNA的检测。
在该方法中，首先将miRNA与若干硝酸酰胺交联，并通过琼脂糖凝胶电泳分离miRNA。
然后，将miRNA转移到膜上，并使用与miRNA互补的探针进行杂交。
通过放射性或化学染料检测标记的探针与miRNA的结合，可以确定miRNA的存在与周围环境的定量。
具体步骤如下：- 步骤一：miRNA分离：使用硝酸酰胺交联和电泳方法从总RNA中分离miRNA。
- 步骤二：膜转移：将miRNA转移到膜上。
- 步骤三：杂交：使用与miRNA互补的标记探针进行杂交。
- 步骤四：探针检测：通过放射性或化学物质检测标记的探针与miRNA的结合来确定miRNA的存在。
miRNA的常用检测方法研究
miRNA的常用检测方法研究miRNA (microRNA) 是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA，在细胞中起着重要的调控作用。
miRNA参与调控基因表达、细胞周期、代谢、增殖和凋亡等各种生物学过程，因此在许多疾病的发生发展中也扮演着重要角色。
miRNA的检测方法成为了当前研究的热点之一。
本文将介绍miRNA的常用检测方法，并对其优缺点进行探讨。
目前miRNA的检测方法主要包括定量PCR、芯片芯片技术、Next-generation sequencing(NGS)、蛋白质悬浊微球(Protein-coated-magnetic beads)和分子影像技术等。
以下将详细介绍各种方法的原理、步骤和特点。
第一种miRNA检测方法是定量PCR。
PCR是一种常用的核酸检测技术，通过链式反应扩增目标区域的DNA序列，基于PCR的miRNA检测技术可以分为两类：miRNA逆转录-定量PCR(RT-qPCR)和miRNA转录-定量PCR(TaqMan PCR)。
在RT-qPCR中，miRNA首先被逆转录成cDNA，然后通过PCR扩增cDNA，最后通过实时荧光技术检测PCR产物的数量。
TaqMan PCR则是直接对miRNA进行PCR扩增并检测。
这两种方法都具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，但需要提取RNA，且不能检测未知miRNA。
第二种miRNA检测方法是芯片技术。
芯片技术是一种高通量平行检测技术，能够同时检测数千种核酸分子。
miRNA芯片技术主要包括两类：杂交芯片和基于微阵列的miRNA检测芯片。
杂交芯片是通过杂交技术检测miRNA的表达水平，而基于微阵列的miRNA检测芯片则是通过检测miRNA与探针的结合情况来定量miRNA水平。
芯片技术具有高通量和高比较度的优点，但需要大量的样本，并且只能检测已知的miRNA。
第三种miRNA检测方法是Next-generation sequencing(NGS)。
双尾RT-qPCR技术——miRNA定量检测方案
双尾RT-qPCR技术——miRNA定量检测方案
传统检测miRNA的方法有Northern 印迹分析，微点阵(microarray)分析和实时定量PCR(quantitative Real-Time PCR)。
目前已有新的，升级版的基于PCR法的miRNA定量检测方法——双尾RT-qPCR。
首先，对以上三种传统检测miRNA的方法进行一个比较，如下：
那再一起来看看新的双尾RT-qPCR技术，这种方法是BioVendor最近一项新的技术，具有特别的RT引物机制，与其他方法相比，可提供出色的灵敏度和特异性，用于总的miRNA和piRNA的定量。
双尾RT-qPCR技术的优点如下：
1.高灵敏度（最多少于10个分子）
2.高特异性
1）适合于多种样本（血浆/血清，血液，组织等）中的miRNA检测和定量
血浆/ 血清/ 尿液/ 脑脊液/ 生物液体
新鲜组织，冷冻／福尔马林固定组织的
细胞，外泌体
2）通过折叠的系链连接的两个半探针（结合不同的microRNA片段）3）动态范围广（高达9 log）
4）在进行单重qPCR之前，可进行双管多重RT-PCR
5）定制化服务
3.检测流程简便
文章来源：艾美捷科技。
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区域结合而抑制或降解 mRNA，作为一种转录后调节因 1 实验材料与方法
子调节基因表达。研究显示 60% 以上的蛋白质编码基 1． 1 血浆和血清的制备 选取于北京友谊医院健康体
因的翻译活性受 miRNA 调控，因此 miRNA 广泛参与细 检的 血 浆 标 本 和 血 清 标 本 各 10 份，血 浆 的 收 集 采 用
表明 miRNA 广泛存在于血清或血浆中，而且随生理状况和 录之前先多聚 A 加尾，多聚 A 加尾法逆转录后可供检 疾病进程的发展而发生变化［3］。提示循环 miRNA 可以作 测多种 miRNA。取上述 miRNA 溶液 18 μl 按要求制成
为一种无创的、实时监测体内生理状况的生物标志物。但 25 μl 反应体系，于 PCR 仪器中 37°C 60 min，后 85°C 5
中具有组织特异性，这提示不同的 miRNA 参与了不同 者提取效率差异。具体提取流程参照说明书。简单说，
肿瘤的发生发展，miRNA 具有成为新型肿瘤标志物和治 统一取 300 μl 血清 / 血浆于无核糖核酸酶（ Rnase） 的 EP
疗靶点的前景。
管中，按要求加入相应体积的裂解液，经过分层、洗脱、
胞分化、增殖、生长和凋亡等生理病理过程。肿瘤的分 EDTA 抗凝管（ 不采用肝素抗凝管） ，取标本 1 ml 分装后
子生物学研究发现，人类 miRNA 基因多位于脆性位点 立即置于 － 20°C 保存，以备后用。
或肿瘤相关基因区域，癌基因的突变和缺失往往伴有 1． 2 RNA 的提取 本实验选用传统 Trizol 法和专用于 miRNA 的失调［1］，而且 miRNA 表达谱在不同类型肿瘤 miRNA 提取的 miRNA 试剂盒（ Tiangen 公司） ，并比较两
直到近来研究证实： miRNA 在血清或血浆中可以稳定 干燥，最后溶于 30 μl 的无 Rnase 的双蒸水中。
存在，能够耐 RNA 酶消化、耐酸碱和耐反复冻融［2］。循环
miRNA 的逆转录采用复能基因公式的 cDNA 合成
RNA 在肿瘤诊断和预后应用研究中取得了重要进展，结果 试剂盒（ All － in － One cDNA Synthesis Kit） ，该法在逆转
临床和实验医学杂志 2012 年 4 月 第 11 卷 第 7 期
基于 qPCR 的循环 miRNA 定量检测的方法探讨
·503·
论著
马雪梅（ 首都医科大学附属北京友谊医院普外科实验室 北京 100050）
【摘要】 目的 探讨和优化循环 miRNA 检测方法，为进一步研究循环 miRNA 作为生物标记物提供方法学基础。 方法 以 miR － 16 和 miR － 21 为检测目标，通过实时 PCR 的方法检测其表达量。比较传统 Trizol 法和 miRNA 提取试剂 盒的 miRNA 提取效率； 比较血清和血浆中 miRNA 含量； 并对基于实时定量 PCR（ qPCR） 的循环 miRNA 检测方法重复性 和敏感性进行评价。结果 miRNA 提取试剂盒的 miRNA 提取效率是传统 Trizol 法的 16 435 倍； 血浆中 miR － 16 和 miR － 21qPCR 检测的 Ct 值为 25． 75 ± 1． 83、25． 69 ± 2． 04，而血清 miRNA 检测 Ct 值为 27． 82 ± 1． 03、27． 12 ± 1． 35，两者相比 有显著差异； 同一批血浆 miR － 16 两次检测相关系数为 0． 8885，单个血浆样本 10 倍梯度稀释后 Ct 值拟合系数 0． 9865。 结论 Trizol 法提取循环 miRNA 效率低，血浆中 miRNA 含量较血清稍高，建议选取血浆为标本，通过 miRNA 提取试剂 盒提取 miRNA，然后行实时 PCR 检测其表达，该法具有较高的重复性和敏感性。
表 2 血清和血浆中 miR － 16、miR － 21 经 PCR 扩增后的 Ct 值
项目
miR － 16 miR － 21
Ct 值（ n = 10）
血清
血浆
27． 82 ± 1． 03 25． 75 ± 1． 83
27． 12 ± 1． 35 25． 69 ± 2． 04
t值
2． 5205 2． 262
在循环中高表达的 miR － 16 和 miR － 21 为研究靶 miRNA， qPCR Mix，上述 cDNA 溶液稀释 10 倍后，取 5． 6 μl 稀释
通过基于实时定量 PCR（ qPCR） 的方法检测其表达量，试图 液按说明书制成 20 μl 的 PCR 反应体系。于 ABI 7500
·504·
Journal of Clinical and Experimental Medicine Vol． 11，No． 7 Apr． 2012
实时 PCR 仪器上检测 SYBR GREEN 反应信号，扩增曲 线后加入溶解曲线以确认扩增产物的特异性。Ct 值的 检测采用 SDS 相对定量分析软件，所有设置采用软件默 认设置。 1． 4 统计学处理 应用 SPSS 17． 0 软件包，计量资料 以均数 ± 标准差（ x珋± s ） 表示，行 t 检验，检验水准 a = 0． 05。 2 结果 2． 1 提取方法对循环 miRNA Ct 值的影响 我们选取 6 例血清，分别按传统 Trizol 法和 miRNA 试剂盒法两种 方法提取 RNA，然后通过 qPCR 检测 miR － 16 表达量， 以验证其提取效率的差异。如图 1 所示，Trizol 法提取 的 RNA 经 qPCR 检测后其 Ct 值集中在 27 ～ 30 之间，而 miRNA 试剂盒法的 Ct 值集中在 42 ～ 43。按相对定量 = 2 － （ Ct试剂盒法 － CtTrizol法 ） 计算［5］每个样本的 miR － 16 相对定量，其结果如表 1 所示，miRNA isolation 法提取 效率平均为 Trizol 法的 16 435 倍。
P值
＜ 0． 05 ＜ 0． 05
2． 3 血浆中 qPCR 检测方法的稳定性和敏感性 为了 检验血浆中 miRNA 定量检测方法的可重复性，我们再 次重新提取 RNA、逆转录并实时 PCR 检测 miR － 16，然 后比较两次检测结果的相关性。如图 2 所示，两次检测 结果具有较高的相关系数（ R = 0． 8885） ，说明检测方法 具有较好的重复性。此外，我们还将血浆按 10 倍梯度 稀释，后 qPCR 检测其表达量，如图 3 所示，单个血浆样 本 10 倍梯度稀释后 Ct 值拟合系数 0． 9865，进一步验证 该方法能分别出血浆中 10 倍的差异，具有较高的敏感 性。
【关键词】 血清 miRNA 血浆 miRNA 实时定量 PCR
Study on quantitative detection of circulating microRNA based on qPCR． MA Xue － mei． Laboratory of General Surgery，Beijing Friendship Hospital，Captical Medical University，Beijing 100050，China．
是鉴于循环中 miRNA 含量低、循环中 miRNA 存在形式不 min。cDNA 溶液保存于 － 30°C，备用。
明确、miRNA 分子量低等特点，循环 miRNA 的检测方法不 1． 3 miRNA 的 qPCR 定量检测 实时检测 miR － 16 和 如组织 miRNA 检测效率高［4］。本研究选取了已经证实的 miR － 21 表达量采用复能基因公司的 All － in － OneTM
样本
样本 1 样本 2 样本 3 样本 4 样本 5 样本 6 平均
miRNA 试剂盒法
【Abstract】 Objective For further study of circulating miRNA as biological markers，the method for detection of circulating miRNA had been studied and optimized． Methods Circulating miR － 16 and miR － 21 were detected by real － time PCR，the efficiency of extraction of circulating miRNA was compared between Trizol method and miRNA extraction kit； and the quantity of miRNA in serum and plasma was compared，and then the sensitivity and specificity of detected method were evaluated by real － time PCR． Results The miRNA extracted by miRNA kit was 16435 times more than that by Trizol method； the Ct values of miR － 16 in serum and plasma were 27． 82 ± 1． 03 and 25． 75 ± 1． 83 respectively，Ct values of miR － 21 in serum and plasma were 27． 12 ± 1． 35 and 25． 69 ± 2． 04 respectively． Spearman correlation coefficient between two times measurement of plasma miR － 16 was 0． 8885，the regression curve between Ct values and log concentration for serially diluted plasma showed a good linear relationship （ R = 0． 9865） ． Conclusion RNA extracted by Trizol method from plasma is not suitable for detection of miRNA，the quantity of miRNA in plasma is greater than that of serum． It is advisable that it is better to choose plasma as sample for extraction of miRNA by specific miRNA kit，then its expression examined by real － time PCR． The detection of circulating miRNA by real － time PCR has higher sensitivity and specificity．