肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响

［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０４３８－０５［收稿日期］　２０１１－０４－１６［基金项目］　国家自然科学基金面上项目资助课题（ＮＳＦＣ　３０９７２９１４）；广东省科技计划项目资助课题（２００９Ｂ０６０７０００２４）；广东省自然科学基金面上项目资助课题（１０１５１００８９０１０００２０８）；中山大学高校基本科研业务费重大项目培育基金资助课题（１０ｙｋｊｃ０３）［作者简介］　汪田甜（１９８３－），女，安徽省明光市人，医师，医学硕士，主要从事肝脏恶性肿瘤方面的研究。

［通信作者］　吴祥元（Ｔｅｌ：０２０－８５２５２２１７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｘｙ３０７＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响汪田甜１，贾昌昌２，张　琪２，董　敏１，李　星１，陈冠中２，吴祥元１（１．中山大学附属第三医院肿瘤内科，广东广州５１０６３０；２．中山大学附属第三医院肝移植中心，广东广州５１０６３０）［摘　要］　目的：分离、培养及鉴定原代肝癌相关成纤维细胞（ｈＣＡＦ），阐明其在肝癌发生发展中的作用。

方法：采用酶消化法分离、纯化人ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法鉴定其相关蛋白标记物的表达，流式细胞术检测肝癌细胞Ｈｅｐ３Ｂ经ｈＣＡＦ上清处理后的增殖速度及细胞周期的变化，建立裸鼠移植瘤模型，观察ｈＣＡＦ对肝癌细胞生长的影响。

结果：在肝癌组织标本中成功分离出ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示ｈＣＡＦ特异性地高表达α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）。

ＣＣＫ８细胞增殖检测试剂盒检测证实，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ３Ｂ细胞增殖量为完全培养基处理４８ｈ细胞增殖量的１２６．０％、１２５．０％及１２０．５％，细胞增殖量差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。

流式细胞术结果显示，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ３Ｂ细胞增殖速度及细胞周期中处于Ｓ期的细胞数目均高于完全培养基处理的Ｈｅｐ３Ｂ细胞（Ｐ＜０．０５）。

ｈＣＡＦ与Ｈｅｐ３Ｂ共同接种至裸鼠皮下的成瘤体积［（１．３４±０．５２）ｃｍ３］明显大于单独接种Ｈｅｐ３Ｂ组［（０．５１±０．０９）ｃｍ３］，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。

结论：ｈＣＡＦ可以明显促进肝癌细胞系Ｈｅｐ３Ｂ的生长，其可能在肝癌生长过程中发挥重要作用。

［关键词］　癌相关成纤维细胞；肝细胞肿瘤；增殖；肿瘤微环境［中图分类号］　Ｒ３２２．４７ ［文献标志码］　ＡＣｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓＷＡＮＧ　Ｔｉａｎ－ｔｉａｎ１，ＪＩＡ　Ｃｈａｎｇ－ｃｈａｎｇ２，ＺＨＡＮＧ　Ｑｉ　２，ＤＯＮＧ　Ｍｉｎ１，ＬＩ　Ｘｉｎｇ１，ＣＨＥＮ　Ｇｕａｎ－ｚｈｏｎｇ２，ＷＵ　Ｘｉａｎｇ－ｙｕａｎ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ　Ｙａｔ－ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｌｉｖｅｒ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ　Ｙａｔ－ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ，ｃｕｌｔｉｖａｔｅ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ｈＣＡＦ）ａｎｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅｉｒ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙ　ｈＣＡＦ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈＣＡＦ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅｓ　ｏｆ　Ｈｅｐ３Ｂｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒｈＣＡＦ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈＣＡＦ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｔｈｏｕｇｈ　ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ａ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔ　ｔｕｍｏｒ　ｍｏｄｅｌ　ｉｎ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｈＣＡＦ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ａｎｄ　ｈｉｇｈｌｙ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄα－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ（α－ＳＭＡ）ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｐ３Ｂｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈＣＡＦ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉａ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｈｅｐ３Ｂｗｅｒｅ　１２６．０％，１２５．０％ａｎｄ　１２０．５％ｏｆ　ｔｈｏｓｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｍｅｄｉｕｍｆｏｒ　４８ｈ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｓ　ｐｈａｓｅ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈｅｒ８３４第３８卷　第３期２０１２年５月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３　Ｍａｙ　２０１２ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　４８ｈ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｖｏｌｕｍｅ　ｉｎ　Ｈｅｐ３Ｂｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｈＣＡＦ　ｃｏ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ［（１．３４±０．５２）ｃｍ２］ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌａｒｇｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　Ｈｅｐ３Ｂｃｅｌｌｓ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ［（０．５１±０．０９）ｃｍ２］ｉｎ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｈＣＡＦ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ｈｅｐ３Ｂ，ａｎｄ　ｈＣＡＦ　ｍｉｇｈｔ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｔｕｍｏｒ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｔｕｍｏｒ　ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ 肿瘤相关成纤维细胞（ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＣＡＦ）又称作癌相关成纤维细胞，是肿瘤间质的重要组成成分，也是组成肿瘤微环境数目最多的一类细胞，其可以通过一系列的旁分泌机制直接或间接地参与肿瘤细胞生长、侵袭和转移过程［１－３］，因此ＣＡＦ被认为是肿瘤微环境中最重要的组成部分。

在肝癌组织中被证实存在着大量的ＣＡＦ［４－５］，而目前国内外对于肝癌相关成纤维细胞（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ＣＡＦ，ｈＣＡＦ）的研究甚少，ｈＣＡＦ在肝癌发生、发展中的作用尚不清楚。

因此，本研究旨在通过从肝癌组织中成功分离、培养ｈＣＡＦ，利用体外细胞增殖实验、细胞周期分析以及动物移植瘤模型观察ｈＣＡＦ对肝癌细胞增殖能力的影响，初步明确ｈＣＡＦ在肝癌发生、发展中的作用。

１　材料与方法１．１　细胞及主要试剂　无菌条件下取本院肝切除手术切下的新鲜肝癌组织标本３例及本院健康小儿包皮环切术后切下的新鲜包皮组织３例，肝癌组织标本在术后经病理证实为肝细胞肝癌。

肝癌细胞系Ｈｅｐ３Ｂ和胎肝细胞系ＬＯ２购于上海细胞库；人脐静脉血管内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）购于美国典型培养库；原代ｈＣＡＦ及原代的正常人皮肤成纤维细胞（ｎｏｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＮＦ）经酶消化法由组织中分离培养获得；高糖ＤＭＥＭ、双抗（青霉素、链霉素１００ｍｇ·Ｌ－１）和胎牛血清购于Ｇｉｂｃｏ公司；Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶和ＥＤＴＡ购于Ｓｉｇｍａ公司；蛋白提取试剂盒、ＢＣＡ法定量试剂盒、ＣＣＫ８细胞增殖检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购于南京凯基公司；α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）抗体和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体购于Ａｂｃａｍ公司；Ｅ－钙黏蛋白（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）抗体购于Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司；６～８周龄的ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠购自北京维通利华公司。

１．２　细胞培养　肝癌细胞系Ｈｅｐ３Ｂ培养于含１００Ｕ·ｍＬ－１青霉素、１００ｍｇ·Ｌ－１链霉素和含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基中，使用含有ＥＤＴＡ的０．２５％的胰酶消化传代。

ＨＵＶＥＣ培养于含２０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基中，用含有ＥＤＴＡ的０．０５％胰酶消化传代。

１．３　ｈＣＡＦ的分离、培养及纯化　在手术室切取新鲜肝癌组织标本３～５ｇ，置于含有抗生素的ＰＢＳ中冰上短暂保存。

取出标本在超净工作台中用含双抗的ＰＢＳ清洗数次，修剪肝癌组织将毗邻的非肝癌组织及肿瘤内明显的血管结构剔除，将修剪后的组织用眼科剪剪成糊状，大小约为１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍ。

用８～１０ｍＬ　１ｇ·Ｌ－１的Ⅳ型胶原酶在摇床上３７℃消化组织约５～６ｈ，消化后ＰＢＳ清洗２次，用含１０％ＦＢＳ的高糖ＤＭＥＭ培养基重悬并过２００目滤网，最后将过滤后的细胞悬液调整至细胞密度为１０６　ｍＬ－１，接种于２５ｃｍ２培养瓶中，置于３７℃细胞培养箱中培养。

４８ｈ后第１次换液，以后每隔３ｄ换液直至细胞完全融合。

待细胞长满后用含ＥＤＴＡ的０．２５％胰酶消化细胞按１∶２传代，传至第３代后进行细胞鉴定。