取向性丝素蛋白仿生软骨支架的制备及其生物相容性评估
仿生骨修复支架材料的设计及其成骨诱导机制的研究
仿生骨修复支架材料的设计及其成骨诱导机制的研究社会经济的发展带动着人们生活水平的提高，人们对仿生骨修复支架材料的设计及其成骨诱导机制的了解度与安全性提出了一定要求，仿生骨修复支架材料应用在西方国家骨损伤治疗工作中已经越来越普遍，由于各种客观原因，我国目前的仿生材料修复工作存在诸多问题，不能有效的解决目前人体组织修复工作，融合部分也相继出现不兼容性的状况。
本文通过对仿生人工骨修复材料进行概述，分析探讨了仿生多级孔生物活性玻璃支架材料、PLLA纳米纤维支架材料及其成骨诱导机制的研究，希望对相关研究者有一定启发。
标签：仿生骨修复支架材料；设计；成骨诱导机制；仿生材料随着我国经济的迅猛发展，我国对各种骨缺材料修复的利用率也开始飞速提升，目前采用的骨缺修复材料技术无法满足现代人们的需要，不能良好解决目前复杂的骨损伤问题，大量实践表明，自体骨与异体骨移植具有诸多局限性，工作人员通过模仿天然骨本身的成分、结构特性及生物矿化过程进行研究，并针对性的对其进行调整，获取了良好的新型仿生人工骨修复，目前市场上急需大量的骨缺损修复材料，为了获取更多更优质的股组织再生修复材料，医学人员需要对其积极探索[1]。
1 仿生骨修复支架材料的作用及其现状1.1 仿生骨修复支架材料的作用人体在正常生活中会出现骨组织疾病和缺损的状况，由于此种疾病会造成机体的结构和功能障碍，对患者的正常生活造成影响。
由于人体具有一定的自愈功能，患者出现小面积的骨缺损可以通过适当的治疗而痊愈，但严重性骨损伤便需要采用外来材料进行辅助治疗骨组织。
仿生骨修复支架材料在损坏骨骼的修复工作中具有重要作用，目前优异生物矿化材料需要采用有机分子调控无机分子，国内外均出现了天然的生物体结构及组合材料，传统的仿生学设计可以适当的采用材料组合的方法去模拟生物体系，天然矿化组织均由生物大分子等物质组成，其在生长过程中会出现一定的有序性[2]。
1.2 仿生骨修复支架材料的现状随着我国医学技术的进步，采用各种方式进行骨损伤治疗，目前使用较为广泛的方法为自体骨移植、异体骨移植、人工合成骨移植。
丝素蛋白-软骨脱细胞外基质复合取向支架的制备及评价
ｔｈａｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｒｅｍｏｖｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｒｅｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｔｈｅｒｍ ａｌ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ．Ｔｈｅ ＳＦ—ＣＥＣＭ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎａｌｙｓｅｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｒ ｍ ｉｎａｔｉｏｎ ｏｆｐｏｒｏｓｉ够，ｗａｔｅｒ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ａ ｎｄ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｖｅ ｅｌａｓｔｉｃ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ１ ０ｂｌｅｅｔｉｖｅ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｉｍｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｏｒｉｅｎｔｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ（ＣＥＣＭ） ａｎｄ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ（ＳＦ）ａｎ ｄ ｕｓｅ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｉｎ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｒ ｉｅｎｔｅｄ ＳＦ—ＣＥＣＭ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ ６％ ｍｉｘｅｄ ｓｌｕｒｒｙ（ＣＥＣＭ ：ＳＦ＝Ｉ：１、ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｉｆ ｉｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ—ｇｕｉｄｅｄ
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｉｅｎｔｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍ ａｔｒｉｘ ａｎｄ ｓｉｌｋ ｆ ｉｂｒｏｉｎ
丝素蛋白-明胶-壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估
丝素蛋白-明胶-壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估作者：谷明西王常成田丰德郝瑞胡安宁郭林来源：《丝绸》2023年第11期Preparation and performance evaluation of silk protein-gelatin-chitosan-hydroxyapatiteporous scaffolds摘要：文章以絲素蛋白（SF）、明胶（Gel）、壳聚糖（CS）和羟基磷灰石（Hap）为基础材料，通过真空冷冻干燥和化学交联制备了5组SF-CS-Gel-nHap多孔支架（Hap-1%、Hap-2%、Hap-3%、Hap-4%、Hap-5%）。
通过扫描电子显微镜、X射线衍射仪（XRD）、孔隙率、吸水膨胀率、生物降解率及力学性能研究，筛选出理化性能优越适合全层软骨缺损再生重建的复合支架。
随后将其与骨关节炎患者分离提取的软骨细胞共培养，通过细胞黏附率测定、细胞活死染色和CCK-8细胞活性增殖实验等方法评估多孔支架的生物性能，探索其用于修复全层软骨缺损的可行性。
结果显示，基于明胶、壳聚糖、丝素蛋白和纳米羟基磷灰石制备的SF-CS-Gel-2%Hap多孔复合支架不仅可以模拟天然骨软骨的细胞外基质（ECM），而且具有良好的生物相容性，能够为营养物质的转运和细胞黏附、增殖和立体生长提供良好的网状骨架，为全层软骨缺损的治疗提供新的选择。
关键词：组织工程;支架;全层软骨缺损;丝素蛋白;壳聚糖;明胶;羟基磷灰石中图分类号：TS102.1; Q813文献标志码：A文章编号： 10017003（2023）110001起始页码09篇页数引用页码：111101DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2023.11.001（篇序）收稿日期：20230128;修回日期：20231011基金项目：作者简介：谷明西（1992），男，医学硕士，主要从事骨关节炎和组织工程方面的研究。
通信作者：郭林，教授，**************。
丝素蛋白／钙磷复合基因支架的制备及表征
丝素蛋白／钙磷复合基因支架的制备及表征目的人工合成的骨替代材料在治疗部分类型的骨缺损时往往存在疗效的不确定性，特别是在大范围的骨缺损的修复中存在较高的失败率，因此需迫切寻找新的解决途径。
丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有良好的生物学性能，本研究拟改善丝素蛋白的骨诱导性能。
方法采用共沉积法制备了丝素蛋白/钙磷复合材料，制备腺病毒Ad-BMP-2，然后制备丝素蛋白/钙磷复合基因支架。
将骨间充质细胞培养于其上，并采用扫描电镜（SEM）观察细胞的贴附，及检测细胞增殖、分化的性能进行观察。
结果SEM观察显示生物材料具有良好的孔径；制备了Ad-BMP2腺病毒，病毒表達GFP绿色荧光蛋白；细胞学检测发现该生物支架生物相容性好，细胞呈梭形，舒展充分，细胞核处隆起，细胞周围可见基质附着。
结论该生物材料具有良好的孔径及生物相容性，具有良好的应用前景。
标签：丝素蛋白；钙磷复合材料；BMP-2；腺病毒生物医学组织工程是近年来继基因工程之后取得重大技术突破的生命科学领域新的研究热点。
组织工程的三大要素是：具有增殖分化潜能的种子细胞、生物支架材料、生长因子。
组织工程核心技术在于构建细胞与生物材料复合物。
细胞外基质是构建组织工程化牙周组织的物质基础，细胞在三维支架材料中不断生长、增殖，并分泌细胞外基质取代逐渐降解的生物材料，最终形成具有活力的组织。
本研究将丝素蛋白与磷酸钙粉末混合，可使无机粉末均匀分布于丝素蛋白中，避免了无机粉末由于静电作用互相聚集的倾向，利用仿生共沉积的方法获得丝素蛋白磷酸钙复合物，并结合BMP-2腺病毒，制备出丝素蛋白/钙磷复合基因支架。
1 资料与方法1.1丝素蛋白的制备丝素蛋白的制备：①家蚕生丝脱胶家蚕生丝置于约0.5‰的无水碳酸钠溶液中，于90℃～100℃处理30min，重复3次，以脱去蚕丝中的丝胶。
脱胶后洗净，烘箱60℃烘干后得到精炼蚕丝；②丝素纤维溶解：配置CaCl2·CH3CH2OH·H2O（摩尔比1：2：8）三元溶液。
医用丝素蛋白材料 标准
医用丝素蛋白材料标准医用丝素蛋白材料是一种新型生物材料，广泛应用于医疗领域中。
其主要特点是具有良好的生物相容性、可降解性和生物活性，并且具有优异的力学性能和稳定性，能够在人体组织内起到修复和重建功能。
本文将从医用丝素蛋白材料的概述、制备方法、性能特点、应用领域和市场前景几个方面进行论述。
一、医用丝素蛋白材料的概述医用丝素蛋白材料是由蚕丝素蛋白（sericin）衍生而来的一种生物材料。
蚕丝素蛋白是蚕丝中的一种天然蛋白质，具有多种生物活性，如抗菌、促进伤口愈合等。
通过一系列的生物工程技术，可以从蚕丝中提取出蚕丝素蛋白，并经过纯化和改性处理得到医用丝素蛋白材料。
这种材料具有很高的纯度和无菌性，可以避免传统材料的生物相容性和免疫反应问题。
二、医用丝素蛋白材料的制备方法医用丝素蛋白材料的制备方法主要包括提取、纯化和改性三个步骤。
首先，将饲养蚕茧洗净，去除外层蚕丝，并将内层蚕丝剪成小片。
然后，用酸、碱等溶剂进行提取，将蚕丝素蛋白溶解出来。
接下来，通过离心、过滤等方法去除杂质，得到初步纯化的蚕丝素蛋白。
最后，对纯化的蚕丝素蛋白进行改性处理，如交联、复合等，得到医用丝素蛋白材料。
三、医用丝素蛋白材料的性能特点1.生物相容性：医用丝素蛋白材料具有良好的生物相容性，不易引起排斥反应，与人体组织的相容性较好，可以有效降低手术并发症的发生率。
2.可降解性：医用丝素蛋白材料可以在人体内逐渐降解代谢，并释放出水和二氧化碳等无害物质，不会对人体造成损害。
3.生物活性：医用丝素蛋白材料具有一定的生物活性，可以促进伤口愈合、抗菌消炎等功能，有助于提高手术成功率。
4.力学性能：医用丝素蛋白材料具有良好的力学性能，可以根据不同的临床需求设计制备不同形状和尺寸的材料，符合手术要求。
5.稳定性：医用丝素蛋白材料具有较高的稳定性，可以在不同的生理环境下保持材料的完整性和功能性。
四、医用丝素蛋白材料的应用领域1.修复和重建组织：医用丝素蛋白材料可以用于骨折和骨缺损修复、软组织缺损修复、皮肤损伤修复等。
丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估
研究与技术丝绸ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＳＩＬＫ丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ谷明西１ꎬ王常成２ꎬ田丰德３ꎬ郝瑞胡３ꎬ安㊀宁３ꎬ郭㊀林３(１.北京大学深圳医院内科ꎬ深圳５１８０００ꎻ２.大连理工大学医学部ꎬ大连１１６０８１ꎻ３.大连大学附属中山医院膝关节与骨肿瘤科ꎬ大连１１６００１)摘要:文章以丝素蛋白(ＳＦ)㊁明胶(Ｇｅｌ)㊁壳聚糖(ＣＳ)和羟基磷灰石(Ｈａｐ)为基础材料ꎬ通过真空冷冻干燥和化学交联制备了５组ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架(Ｈａｐ￣１％㊁Ｈａｐ￣２％㊁Ｈａｐ￣３％㊁Ｈａｐ￣４％㊁Ｈａｐ￣５％)ꎮ通过扫描电子显微镜㊁Ｘ射线衍射仪(ＸＲＤ)㊁孔隙率㊁吸水膨胀率㊁生物降解率及力学性能研究ꎬ筛选出理化性能优越适合全层软骨缺损再生重建的复合支架ꎮ随后将其与骨关节炎患者分离提取的软骨细胞共培养ꎬ通过细胞黏附率测定㊁细胞活死染色和ＣＣＫ￣８细胞活性增殖实验等方法评估多孔支架的生物性能ꎬ探索其用于修复全层软骨缺损的可行性ꎮ结果显示ꎬ基于明胶㊁壳聚糖㊁丝素蛋白和纳米羟基磷灰石制备的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ多孔复合支架不仅可以模拟天然骨软骨的细胞外基质(ＥＣＭ)ꎬ而且具有良好的生物相容性ꎬ能够为营养物质的转运和细胞黏附㊁增殖和立体生长提供良好的网状骨架ꎬ为全层软骨缺损的治疗提供新的选择ꎮ关键词:组织工程ꎻ支架ꎻ全层软骨缺损ꎻ丝素蛋白ꎻ壳聚糖ꎻ明胶ꎻ羟基磷灰石中图分类号:ＴＳ１０２.１ꎻＱ８１３㊀㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号:１００１７００３(２０２３)１１０００１０９引用页码:１１１１０１ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１￣７００３.２０２３.１１.００１收稿日期:２０２３０１２８ꎻ修回日期:２０２３１０１１作者简介:谷明西(１９９２)ꎬ男ꎬ医学硕士ꎬ主要从事骨关节炎和组织工程方面的研究ꎮ通信作者:郭林ꎬ教授ꎬｇｋｙｓｇｌ＠１２６.ｃｏｍꎮ㊀㊀关节软骨主要由嵌有软骨细胞的细胞外基质(ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｉｘꎬＥＣＭ)组成ꎬ具有承载和缓冲作用ꎬ覆盖和保护骨骼免受数倍于身体质量的承重力的影响[１]ꎮ与大多数其他组织不同ꎬ软骨组织结构特殊ꎬ由于缺乏血管化和神经支配ꎬ软骨细胞少㊁增殖能力低ꎬ导致软骨损伤后的自我修复能力差ꎬ当损伤从软骨表层延伸到软骨下骨时ꎬ即发生全层软骨缺损(Ｆｕｌｌ￣ＴｈｉｃｋｎｅｓｓＣａｒｔｉｌａｇｅＤｅｆｅｃｔꎬＦＴＡＣ)[２]ꎮ组织工程(ＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＴＥ)是一种结合了工程学和细胞生物学的跨学科方法ꎬ旨在恢复㊁改善和维持组织功能[３]ꎬ已成为软骨组织再生和重建最常用的方法之一ꎮ种子细胞㊁支架材料及生长因子是制约软骨组织工程的三个关键性制约因素ꎬ其中作为组织形成模板的支架材料在ＴＥ中起着最重要的作用[４]ꎮ丝素蛋白(ＳｉｌｋＦｉｂｒｏｉｎꎬＳＦ)是一种具有出色机械性能㊁生物降解性㊁生物相容性和生物可吸收性的天然蛋白质[５]ꎮ壳聚糖(ＣｈｉｔｏｓａｎꎬＣＳ)是唯一带正电荷的天然多糖ꎬ与ＥＣＭ中发现的葡糖胺聚糖(ＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎꎬＧＡＧｓ)相似ꎬ不仅能够与带负电的ＧＡＧ发生静电相互作用ꎬ而且还能促进软骨特异性蛋白表达[６]ꎮ明胶(ＧｅｌａｔｉｎꎬＧｅｌ)是胶原蛋白的水解产物ꎬ具有高度的亲水性和出色的生物相容性ꎬ这有助于支架中的营养输送和细胞黏附[７]ꎮ羟基磷灰石(ＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅꎬＨａｐ)是天然骨骼的矿物质成分ꎬ具有骨传导特性㊁骨诱导特性㊁骨结合能力和原位降解缓慢等优势ꎬ已成功应用于临床骨修复[８]ꎮ然而由单一成分制成的支架在水和生理条件下的稳定性差ꎬ因此ꎬ可以将两种或多种聚合物混合以获得新材料[９￣１０]ꎮ本研究为了构建理想的组织工程支架ꎬ充分恢复关节软骨的原始成分㊁结构㊁力学和生物功能ꎬ以明胶㊁壳聚糖㊁丝素蛋白和羟基磷灰石为基础材料ꎬ通过真空冷冻干燥和化学交联开发一种能够满足骨软骨ＥＣＭ和成骨成软骨双向分化要求的三维多孔支架ꎬ探索其用于修复软骨缺损的可行性ꎮ１㊀方㊀法１.１㊀材㊀料蚕茧(西北养蚕工业基地)ꎻ甲苯胺蓝染色液㊁透析袋(北京索莱宝科技有限公司)ꎻ脱乙酰度ȡ９５％的壳聚糖㊁明胶㊁溴化锂㊁Ｎ￣羟基琥珀酰亚胺㊁碳酰二亚酸盐(上海麦克林生化科技有限公司)ꎻＤＭＥＭ/Ｆ１２培养基(海克隆Ｈｙｃｌｏｎｅ生物科技１Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ公司)ꎻ澳洲胎牛血清(美国赛默飞公司Ｇｉｂｃｏ胎牛血清)ꎻＣＣＫ￣８细胞增殖试剂盒㊁活死细胞染色试剂盒(Ａｂｂｋｉｎｅ亚科因生物技术有限公司)ꎻ碳酸氢钠(国药集团药业有限公司)ꎬＩＩ型胶原酶(百普赛斯Ｂｉｏｓｈａｐ生物科技公司)１.２㊀主要实验溶液的配制１.２.１㊀壳聚糖溶液称取３ｇ壳聚糖(脱乙酰度ȡ９５％)粉末溶解于１００ｍＬ１％醋酸溶液中ꎬ磁力搅拌４ｈ直至完全溶解ꎬ然后过滤溶液以除去杂质ꎮ１.２.２㊀明胶溶液称取３ｇ生物明胶溶解于５０ħ１００ｍＬ超纯水中ꎬ水浴加热并持续搅拌至完全溶解ꎮ１.２.３㊀丝素蛋白溶液１)脱胶:挑选优质干净的蚕茧ꎬ将切好的茧块加入沸腾的０.５％Ｎａ２ＣＯ３溶液中ꎬ煮沸６０ｍｉｎꎬ然后用蒸馏水浸泡洗涤１０ｍｉｎꎬ重复２~３次后烘干ꎮ２)溶解:按照１︰６的比例将脱胶蚕丝在６０ħ条件下溶解于９.３ｍｏｌ/ＬＬｉＢｒ溶液中ꎮ３)过滤离心:冷却至室温ꎬ使用不锈钢过滤网过滤去除较大颗粒杂质ꎬ以９０００ｒ/ｍｉｎ速度离心１０ｍｉｎꎮ４)透析:将离心后的丝素蛋白溶液转移至截留相对分子质量１２０００ʃ２０００的透析袋中ꎬ超纯水持续透析３ｄꎬ直至透析袋内水位不再变化ꎮ５)浓缩:将含丝素蛋白溶液的透析袋放入质量分数１０％的聚乙二醇溶液中进行浓缩１２ｈꎬ保存于４ħ冰箱中备用ꎮ１.３㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的制备将质量分数为３％的ＳＦ溶液㊁ＣＳ溶液㊁Ｇｅｌ溶液分别以１︰１︰１体积比混合均匀ꎬ调整Ｈａｐ的量ꎬ根据Ｈａｐ在混合溶液质量分数的不同ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ复合溶液分为５组(Ｈａｐ￣１％㊁Ｈａｐ￣２％㊁Ｈａｐ￣３％㊁Ｈａｐ￣４％㊁Ｈａｐ￣５％)ꎬ磁力搅拌６０ｍｉｎ混合均匀ꎬ然后以每孔１ｍＬ转移至４８孔板内ꎮ在－２０ħ预冻过夜ꎬ放入－８０ħ冰箱中继续冷冻２４ｈꎬ然后真空冷冻干燥４８ｈꎬ经第一次塑形得到规则㊁圆柱状的冷冻干燥支架ꎮ冷冻干燥后每孔中加入２ｍＬ交联剂ꎬ交联剂各成分分别为碳化二亚胺盐５０ｍｍｏｌ/Ｌ和Ｎ￣羟基琥珀酰亚胺２５ｍｍｏｌ/Ｌꎮ在４ħ条件下充分交联过夜ꎬ然后用７５％乙醇和去离子水清洗数次ꎬ加入７５％乙醇溶液浸泡２４ｈꎬ１ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ溶液浸泡中和６ｈꎬ去离子水洗净ꎮ再次放于－２０ħ冷冻过夜ꎬ－８０ħ冷冻２４ｈ后行真空干燥４８ｈꎬ进行第二次塑形ꎮ干燥完成后ꎬ将支架收集密封ꎬ置于４ħ冰箱ꎬ保存备用ꎮ１.４㊀物理性能表征１.４.１㊀大体外观将不同类型的３Ｄ支架从４８孔板中取出进行拍照观察ꎮ１.４.２㊀扫描电镜观察使用手术刀片将每个支架样品切成合适厚度ꎬ常规涂覆金膜后ꎬ通过Ｒｅｇｕｌｕｓ８１００扫描电子显微镜(日本日立公司)对支架的内部结构和形貌进行分析ꎻ采用ＩｍａｇｅＪ图像可视化软件对样品进行孔径分析ꎬ平均孔径是通过测量在样品中心部分至少随机选择的２０个孔的最大和最小直径来获得ꎮ１.４.３㊀Ｘ射线衍射(ＸＲＤ)分析将支架研磨成粉末ꎬ使用Ｄ８ａｄｖａｎｃｅ全自动Ｘ射线衍射仪(美国布鲁克海文仪器公司)对粉末样品进行表征ꎬＸ射线衍射仪在３５ｋＶ和１０ｍＡ的条件下用Ｃｕｋα辐射(λ＝１.５４２)记录样品的衍射图ꎬ扫描２θ角范围为５ʎ~６０ʎꎬ扫描速率为５ʎ/ｍｉｎꎮ１.４.４㊀溶胀率用常规重量法测定各组支架的吸水溶胀率ꎮ将冷冻干燥后的支架后称重记为Ｍ１ꎬ然后浸泡于ＰＢＳ缓冲液(ｐＨ７.４)中２４ｈ后ꎬ取出样品ꎬ用纱布吸去支架表面多余的水分ꎬ称重记为Ｍ２ꎮ每组实验进行３次ꎮ吸水溶胀率Ｓ计算如下式所示:Ｓ/％＝Ｍ２－Ｍ１Ｍ１ˑ１００(１)１.４.５㊀孔隙率采用比重瓶法测定各组复合支架的孔隙率ꎮ用手术刀片将各支架切成统一大小的样品ꎬ以无水乙醇为液体介质ꎬ称量充满无水乙醇的比重瓶ꎬ质量记为Ｍ１ꎬ将干重Ｍ０的支架浸入无水乙醇中ꎬ真空脱泡３０ｍｉｎꎬ直至支架完全被无水乙醇所饱和ꎬ加入乙醇直至比重瓶充满相同刻度ꎬ再次称重ꎬ记为Ｍ２ꎮ取出充盈乙醇的样品ꎬ称量剩余的液体与比重瓶质量ꎬ记为Ｍ３ꎮ支架孔隙率ε计算如下式所示:ε/％＝Ｍ２－Ｍ３－Ｍ０Ｍ１－Ｍ３ˑ１００(２)１.４.６㊀生物降解率支架的体外酶降解实验根据支架在含酶的磷酸盐缓冲液中孵育后的残留量百分比来评价支架的降解行为ꎮ真空干燥后的支架质量记录为Ｍ１ꎬ然后用含１０ｍｇ/ｍＬ溶菌酶的ＰＢＳ缓冲液(ｐＨ７.４)３７ħ浸泡４周ꎮ在规定的时间间隔(７㊁１４㊁２１㊁２８ｄ)取出样品ꎬ真空干燥２４ｈꎬ称重记为Ｍｔꎮ生物降解率δ计算如下式所示:δ/％＝Ｍ１－ＭｔＭ１ˑ１００(３)１.４.７㊀机械性能使用ＥＴＭ系列通用万能试验机(深圳万测试验设备有限公司)进行压缩机械测试ꎮ在每次测试之前测量样品大小ꎬ支架样品为直径约１０ｍｍ㊁高１５~１８ｍｍ的圆柱体ꎬ水平头速度设定为２ｍｍ/ｍｉｎꎬ当压缩位移达到１０ｍｍ时停止加压ꎮ然后绘制应力应变曲线以评估支架的机械性ꎬ应力应变曲２第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估线初始线性阶段的斜率为弹性模量ꎬ每组３个平行样ꎮ１.５㊀生物性能表征１.５.１㊀软骨细胞的提取和鉴定本研究经大连大学附属中山医院伦理委员会批准(伦理审查批件２０２１０７３１)ꎬ并获得所有研究对象的知情同意ꎮ纳入２０２１年１１月因骨关节炎行全膝关节置换术的患者１例(年龄５２岁ꎬ职业木工)ꎮ收集膝关节置换术中切除的股骨髁软骨ꎬ无菌条件下转移至在超净工作台ꎬ使用含无菌ＰＢＳ缓冲液连续漂洗２~３次ꎬ分离出光滑透亮的透明软骨组织薄片ꎬ切成２ｍｍ大小的组织块ꎬ之后使用５倍体积的０.２％Ⅱ型胶原酶消化过夜(３７ħ和５％ＣＯ２恒温培养箱)ꎮ消化结束后使用１００μｍ细胞滤器过滤ꎬ然后终止消化ꎬ将获得的细胞悬液在室温下以１５００ｒ/ｍｉｎ的速度离心５ｍｉｎꎬ收集细胞沉淀ꎬ重悬后接种到Ｔ２５ｃｍ２培养瓶ꎬ在３７ħ和５％ＣＯ２的细胞孵箱中培养ꎬ２４ｈ后更换一次培养液以去除未贴壁的细胞ꎮ此后每３ｄ换液一次ꎬ建立原代培养ꎬ当贴壁细胞达到９０％汇合时ꎬ用无菌ＰＢＳ缓冲液洗涤后使用胰蛋白酶(含ＥＤＴＡ)进行消化处理并将细胞以１︰２的传代比例重新接种以进行传代培养ꎬ直到细胞达到第２代ꎬ使用甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定ꎮ１.５.２㊀支架接种前的处理将支架样品切成直径１０ｍｍ㊁厚度１~２ｍｍ的薄片ꎬ在紫外光下用７５％酒精消毒过夜ꎬ然后用无菌ＰＢＳ缓冲液彻底冲洗３次ꎮ在细胞培养之前ꎬ通过在３７ħ的培养箱中浸入ＤＭＥＭ中２ｈ将支架预润湿ꎮ１.５.３㊀黏附率取传代培养至第２代的软骨细胞悬液ꎬ将含有１０５个/ｍＬ细胞(Ａ０)的细胞悬液１００μＬ接种在预先润湿的支架上ꎬ然后添加培养基至３００μＬꎬ并在接种２㊁４㊁６ｈ后测量黏附率ꎮ从孔中取出支架ꎬ用细胞计数板(Ａ１)计数细胞数ꎬ去除所有培养基溶液后ꎬ消化并计算黏附在孔壁上的细胞(Ａ２)ꎮ细胞黏附率θ计算如下式所示:θ/％＝Ａ０－Ａ１－Ａ２Ａ０ˑ１００(４)每组进行３次实验ꎬ得到平均黏附率ꎮ１.５.４㊀增殖率使用ＣＣＫ￣８法检测支架上软骨细胞的增殖ꎬ将软骨细胞接种在支架上(每个支架１０４个细胞)ꎬ４８孔板每孔添加培养基至３００μＬꎮ每３天更换一次培养基ꎬ经过１㊁４㊁７㊁１０ｄ培养后ꎬ３０μＬＣＣＫ￣８的反应溶液加入到每个孔中ꎬ并在３７ħ温育４ｈꎮ然后将１００μＬ含有ＣＣＫ￣８反应液的培养基转移到９６孔细胞培养板中ꎬ使用Ｂｉｏｔｅｋ８００ＴＳ酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)在４５０ｎｍ处读取吸光度ꎬ绘制生长曲线ꎬ所有实验一式三份进行ꎮ１.５.５㊀活死细胞染色细胞接种３ｄ后使用Ｌｉｖｅ/Ｄｅａｄ试剂盒进行染色ꎬ观察细胞在支架样品上的分布ꎮ该试剂盒分别用碘化丙啶和ＣａｌｃｅｉｎＡＭ对死细胞㊁活细胞进行染色ꎬ并在细胞培养箱中孵育３０ｍｉｎ后ꎬ使用ＴＸＭ￣５００Ｃ荧光显微镜(上海天省光学仪器有限公司)观察ꎮ１.６㊀统计分析多组样本间的比较使用ＳＰＳＳ２０.０软件进行ＡＮＯＶＡ单因素方差分析ꎬ然后进行Ｔｕｋｅｙ ｓ检验ꎬ以确定组间测量数据的差异ꎮ独立样本数据的比较使用ｔ检验ꎬ重复测量数据使用球形检验ꎬ认为ｐ<０.０５具有统计学意义ꎮ置信度记号标为:∗表示ｐ<０.０５ꎬ∗∗表示ｐ<０.０１ꎬ∗∗∗表示ｐ<０.００１)ꎮ２㊀结果和分析２.１㊀物理性能２.１.１㊀大体外观５组ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架均为直径１０ｍｍ左右的白色圆柱体ꎬ随着支架内Ｈａｐ质量分数的增加ꎬ支架底部可见少量沉积的羟基磷灰石ꎬ质量分数越高沉积越多ꎬ如图１所示ꎮ图１㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架大体外观Ｆｉｇ.１㊀ＧｅｎｅｒａｌａｐｐｅａｒａｎｃｅｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.２㊀扫描电镜观察各组支架扫描电镜图像如图２所示ꎮ由图２可见ꎬＨａｐ￣１％支架㊁Ｈａｐ￣２％支架㊁Ｈａｐ￣３％支架㊁Ｈａｐ￣４％支架具有多孔结构ꎬＨａｐ￣１％支架的平均孔径最大ꎬ为(２２５.１４ʃ５３.６３)μｍꎻＨａｐ￣２％支架㊁Ｈａｐ￣３％支架㊁Ｈａｐ￣４％支架的孔径分别为(２１２ ８９ʃ６２.２２)μｍ㊁(１７１.３０ʃ３１.８７)μｍ㊁(１６９.７３ʃ２６ １９)μｍꎻＨａｐ￣５％支架的平均孔径最小ꎬ为(１３６.１１ʃ２０ ４６)μｍꎮ当支架内Ｈａｐ的质量分数在１％~４％变化时ꎬ支架能保持高度多孔的网络结构和良好的孔间联通性ꎬ随着Ｈａｐ在支架中质量分数的增加ꎬ多孔材料的孔径有所减小ꎬ支架的联通性下降ꎻ当Ｈａｐ的质量分数达到５％及以上时ꎬ可以明显看到过量的羟基磷灰石沉积在多孔支架的孔壁上ꎬ逐渐堵塞支架的孔道ꎮ合适的微观结构和孔径ꎬ能够提供迁移细胞㊁运输营养物质和代谢物㊁信号分子和细胞废物[１１￣１２]ꎮ３Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ图２㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架电镜图像Ｆｉｇ.２㊀ＥｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.３㊀ＸＲＤ晶型分析通过ＸＲＤ对ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的晶型结构进行了分析ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的ＸＲＤ图谱如图３所示ꎮ由图３可见ꎬ２θ在２５.７ʎ㊁３２.２ʎ㊁３３.０ʎ㊁３４.３ʎ㊁４０.３ʎ㊁４６.６ʎ和４９.６ʎ附近能观察到羟基磷灰石的特征峰ꎮ对比低质量分数和高质量分数Ｈａｐ的复合支架材料的ＸＲＤ图谱ꎬ还可以观察到羟基磷灰石少量水解和新的磷酸钙化合物生成ꎮ这是因为冰乙酸溶解壳聚糖为溶液提供了酸性环境ꎬ微酸条件下部分羟基磷灰石发生水解ꎬ从而形成新的磷酸钙化合物(２θ＝２８.４ʎ和２９ １ʎ)ꎬ有研究指出磷酸钙化合物的存在不会干扰支架的生物活性或生物相容性[１０ꎬ１３]ꎮ图３㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架ＸＲＤ图谱Ｆｉｇ.３㊀ＸＲＤａｔｌａｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.４㊀元素分析电镜扫描和ＸＲＤ晶型分析证实ꎬ在多孔复合材料表面沉积层中存在结晶簇聚集体ꎬ如图２(ｆ)所示ꎮ为了确保添加的Ｈａｐ颗粒确实存在于复合材料中ꎬ本研究对ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架进行了元素分析ꎮＸ射线能谱分析仪(ＥｎｅｒｇｙＤｉｓｐｅｒｓｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＸ￣ｒａｙｓꎬＥＤＡＸ)元素检测的结果表明ꎬ结晶簇的主要元素是Ｃａ和Ｐꎬ如图４所示ꎮ检测到的结晶簇聚集体内的Ｃａ/Ｐ比值约为１.７４ꎬ其值与化学计量羟基磷灰石中的Ｃａ/Ｐ比值１.６７接近[１４￣１５]ꎬ据文献报道稳定的Ｈａｐ相对应的Ｃａ/Ｐ比值在１.３~１.８[１６]ꎬ表明Ｈａｐ在支架基质内能够稳定存在ꎮ图４㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架元素分析Ｆｉｇ.４㊀ＥｌｅｍｅｎｔａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ４第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估２.１.５㊀吸水溶胀率支架的保水性能对组织工程有重要意义ꎬ吸水溶胀率影响细胞的迁移㊁增殖和分化ꎬ也影响营养物质的运输和机械性能[１７]ꎮＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的吸水溶胀率如图５所示ꎬ５组支架吸水溶胀率之间的差异有统计学意义(ｐ<０.０５)ꎮＨａｐ￣１％支架和Ｈａｐ￣２％支架的吸水溶胀率最高ꎬ分别为１４６６％ʃ１７９％和１２８６％ʃ１１４％ꎻＨａｐ￣５％支架的吸水膨胀率最低ꎬ为７７１％ʃ８９％ꎮ随着ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ复合支架内羟基磷灰石质量分数的增加ꎬ支架的吸水溶胀率明显降低ꎬ即使是Ｈａｐ￣５％支架的平均溶胀率依然大于７００％ꎮ图５㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架溶胀率比较Ｆｉｇ.５㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｗｅｌｌｉｎｇｒａｔｅｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.６㊀孔隙率多孔复合支架的营养运输能力除了受材料本身亲水性能的影响外ꎬ还与支架的孔隙率㊁孔径大小及孔道联通性密切相关[１７￣１８]ꎮ因此孔隙率也是组织工程支架的重要特征之一ꎮＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ复合支架的孔隙率如图６所示ꎬ５组支架孔隙率之间的差异有统计学意义(ｐ<０.０５)ꎮＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐ支架的孔隙率最高ꎬ约为８７.２５％ʃ２.２８％ꎮＨａｐ￣２％的支架和Ｈａｐ￣３％的支架具有相似的孔隙率ꎬ分别为７６.５２％ʃ２.３１％和７２.２７％ʃ２.２８％ꎮＨａｐ￣５％支架的孔隙率最低ꎬ只有４９.４１％ʃ５.９２％ꎬ多孔支架的孔隙率随着支架内部Ｈａｐ质量分数的增加而明显降低ꎮ分析认为ꎬ这是随着复合支架内羟基磷灰石质量分数的增加ꎬ过量的羟磷灰石会沉积在多孔支架的孔壁内ꎬ堵塞孔径ꎬ使多孔支架结构通道的联通性降低ꎬ从而导致支架的孔隙率下降ꎮ孔隙率大于７０％的多孔支架被认为是细胞生存的良好空间和维持细胞生长的营养运输通道[１８]ꎬ高度多孔的结构可以提供足够的营养和气体交换ꎬ以及足够的空间供细胞增殖和附着[１９￣２０]ꎮ掺杂低质量分数Ｈａｐ的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ的多孔支架ꎬ不仅可以提供高度多孔的结构ꎬ为细胞的黏附㊁迁移和生长提供了很大的表面积ꎬ还能兼顾保持Ｈａｐ的生物活性和促成骨作用ꎬ也许更适合骨软骨缺损的修复ꎮ图６㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架孔隙率比较Ｆｉｇ.６㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.７㊀生物降解率本研究使用溶菌酶对ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架进行了体外降解实验ꎬ如图７所示ꎬ５组支架生物降解率之间的差异有统计学意义(ｐ<０.０５)ꎮＨａｐ￣１％支架降解率最高４１.８％ʃ２.４７％ꎬＨａｐ￣５％支架的降解率最低２４.８９％ʃ１.１６％ꎬ支架生物降解率随着羟基磷灰石质量分数的增加而降低ꎮ这一结果与软骨下骨层多孔支架孔隙率结果一致ꎬ这可能是因为低质量分数Ｈａｐ的复合支架具有较高的孔隙率ꎬ多孔结构提供了较大的比表面积ꎬ导致溶菌酶更容易渗透进支架内部与壳聚糖㊁明胶等有机材料发生反应ꎻ另一个可能的原因是羟基磷灰石是天然骨骼的矿物质成分ꎬ本身具有优良的结合能力和原位降解缓慢等优势[１４￣１５]ꎬ因此适当添加Ｈａｐ可以改善多孔复合支架降解速度快的缺点ꎬ从而使多孔支架的生物降解速度与组织的再生重建相匹配ꎮ图７㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的生物降解率(ｐ<０.０５)Ｆｉｇ.７㊀ＢｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ(ｐ<０.０５)２.１.８㊀机械性能机械强度也是评估软骨修复生物材料性能的最关键因素之一ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的应力应变曲线如图８所示ꎮ这５Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ次实验通过比较多孔支架的弹性模量(线性应力应变部分的斜率)和２０％形变量的抗压强度评价多孔支架的力学性能ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐ支架的抗压强度最低(１４.４４ｋＰａ)ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣５％Ｈａｐ支架的抗压强度最高(４０.２８ｋＰａ)ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架抗压强度随Ｈａｐ的质量分数增加而增大ꎬ高质量分数的Ｈａｐ的有助于提高支架的抗压强度ꎮ然而ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的弹性模量变化与抗压强度变化并不完全一致ꎬ此次实验结果显示ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐ支架的弹性模量最低ꎬＨａｐ质量分数在２％~５％的多孔支架拥有相似的弹性模量ꎬ并不随Ｈａｐ质量分数的增加而发生明显改变ꎮ支架的机械性能影响细胞的增殖和分化ꎬ在较硬结构上生长的细胞比在较软基质上的细胞增殖更快ꎬ迁移更慢[２０]ꎮ因此用于软骨修复的支架需要足够坚固㊁有弹性和坚韧ꎬ以容纳种子细胞或从宿主组织迁移的细胞ꎬ同时具有足够的容量以抵抗反复的动态冲击而不会倒塌或压碎[２１￣２２]ꎮ图８㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的应力应变曲线Ｆｉｇ.８㊀Ｓｔｒｅｓｓ￣ｓｔｒａｉｎｃｕｒｖｅｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.２㊀生物性能理想组织工程支架需要具备多种能力ꎬ如高度水合的三维结构和高含水量㊁合适的孔径和孔隙率㊁材料交换能力㊁良好的生物降解性和优越的机械性能ꎬ并能提供合适的微环境和高效的生物相容性和高强度[２２]ꎮ综合本研究的物理性能检测结果ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架更符合全层软骨缺损修复的要求ꎮ该支架具有(２１２.８９ʃ６２.２２)μｍ大小的孔径结构㊁７６.５２％ʃ２.３１％的孔隙率㊁良好的吸水溶胀率１２８６％ʃ１１４％及３７.０９％ʃ１.４１％生物降解速率与良好的机械性能ꎮ因此将ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架与骨关节炎患者的软骨细胞共培养ꎬ以进一步检测支架材料的生物性能ꎮ２.２.１㊀软骨细胞的培养和鉴定原代软骨细胞形态大多为梭形和多角形ꎬ细胞在贴壁２ｄ后开始较好地附着在细胞培养瓶表面并开始增殖ꎬ并在７~９ｄ后达到９０％的汇合状态ꎮ传代细胞表现出相似的形态ꎬ绝大数细胞表现为多角形ꎬ表面多树突状突起ꎬ随着培养时间增加ꎬ树突状突起伸展为细长触丝ꎬ如图９所示ꎮ使用甲苯胺蓝对提取的原代细胞进行染色ꎬ细胞核被染成紫蓝色ꎬ胞核偏向一侧ꎬ未见肥大样细胞ꎬ符合软骨细胞的特征ꎬ如图９(ｃ)所示ꎮ图９㊀软骨细胞的培养及鉴定Ｆｉｇ.９㊀Ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ２.２.２㊀黏附率理想的生物支架可以改善细胞黏附㊁细胞分化和与周围天然组织的整合[１０]ꎮ本研究比较了ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架在接种细胞２㊁４㊁６ｈ后的黏附率ꎬ如图１０所示ꎮ由图１０可见ꎬ软骨细胞能与支架良好黏附ꎬ细胞种板后６ｈ内可成功黏附于支架网状纤维上ꎬ表明ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架很好地保持材料优良的生物活性ꎮ图１０㊀细胞黏附率Ｆｉｇ.１０㊀Ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｒａｔｅ２.２.３㊀增殖率本研究使用ＣＣＫ￣８法检测软骨细胞在ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架的增殖表达ꎬ如图１１所示ꎮ由图１１可见ꎬ单纯软骨细胞组增殖曲线呈Ｓ形ꎬ而仿生支架共培养组软骨细胞在连续共培养１０ｄ后ꎬ生长增殖曲线仍然呈明显上升趋势ꎬ保持６第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估有良好的细胞活力ꎬ未观察到明显的接触抑制效应ꎮ这主要是因为软骨细胞在普通培养皿表面贴壁生长ꎬ细胞增殖存在明显的接触抑制效应ꎬ但是三维立体培养可以避免这种效应ꎮ结果表明ꎬ本研究制备的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ多孔支架具有良好细胞相容性ꎬ能够为种子细胞提供良好的生长微环境ꎬ三维立体培养比二维平面扩展生长具有更大的增殖效率ꎮ图１１㊀细胞增殖率Ｆｉｇ.１１㊀Ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅ２.２.４㊀活死染色为了直观地观察细胞在支架上的状态和活性ꎬ共培养一段时间后使用Ｌｉｖｅ/Ｄｅａｄ试剂盒进行染色ꎬ然后通过荧光显微镜观察(１０ˑ１０倍)ꎬ如图１２所示ꎬ绿色代表活细胞ꎬ而红色代表死细胞ꎮ由图１２可见ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ支架上的大部分细胞呈现绿色荧光ꎬ少见死细胞ꎬ支架上细胞表现出高存活率和低细胞毒性ꎬ表明本研究所制备的多孔支架具有良好的生物相容性ꎮ图１２㊀活/死细胞染色Ｆｉｇ.１２㊀Ｌｉｖｅ/ｄｅａｄｃｅｌｌｓｔａｉｎｉｎｇ３㊀结㊀论基于明胶㊁壳聚糖㊁丝素蛋白和纳米羟基磷灰石制备的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ三维多孔复合支架不仅可以模拟天然骨软骨的ＥＣＭꎬ而且具有良好的生物相容性ꎬ能够为营养物质的转运和细胞附着㊁增殖和立体生长提供良好的网状骨架ꎬ从而为全层软骨缺损的治疗提供新的选择ꎮ«丝绸»官网下载㊀中国知网下载参考文献:[１]ＤＡＯＵＦꎬＣＯＣＨＩＳＡꎬＬＥＩＧＨＥＢＭꎬｅｔａｌ.Ｃｕｒｒｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄａｒｔｉｃｕｌａｒｃａｒｔｉｌａｇｅ:Ａｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｏｎｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｉｔｓｒｅｃｅｎｔｃｌｉｎｉｃａｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０２１ꎬ１５(１):３１.[２]ＴＨＵＮＳＩＲＩＫꎬＰＩＴＪＡＭＩＴＳꎬＰＯＴＨＡＣＨＡＲＯＥＮＰꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅ３Ｄ￣ｐｒｉｎｔｅｄｂｉｌａｙｅｒ ｓｂｉｏａｃｔｉｖｅ￣ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓｓｃａｆｆｏｌｄｆｏｒｆｕｌｌ￣ｔｈｉｃｋｎｅｓｓａｒｔｉｃｕｌａｒｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓｔｒｅａｔｍｅｎｔ[Ｊ].Ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０２０ꎬ１３(１５):１￣２６.[３]ＴＳＡＮＡＫＴＳＩＤＯＵＥꎬＫＡＭＭＯＮＡＯꎬＫＩＰＡＲＩＳＳＩＤＥＳＣ.Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ￣ｂａｓｅｄｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｐｏｌｙｍｅｒｓꎬ２０２２ꎬ１４(４):８３９.[４]ＲＡＤＵＬＥＳＣＵＤＭꎬＮＥＡＣＳＵＩＡꎬＧＲＵＭＥＺＥＳＣＵＡＭꎬｅｔａｌ.Ｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｏｆｓｃａｆｆｏｌｄｓｂａｓｅｄｏｎｈｙｄｒｏｇｅｌｓｉｎｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].Ｐｏｌｙｍｅｒｓꎬ２０２２ꎬ１４(４):７９９.[５]ＳＵＮＷＺꎬＧＲＥＧＯＲＹＤＡꎬＴＯＭＥＨＭＡꎬｅｔａｌ.Ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎａｓａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２１ꎬ２２(３):１￣２８.[６]ＬＩＹＳꎬＺＨＡＮＧＹＬꎬＷＥＩＹꎬｅｔａｌ.Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｂａｓｅｄｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｈｙｄｒｏｇｅｌｓａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎ３Ｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｓｕａｌｉｚｅｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓꎬ２０１７(１２７):ｅ５６２５３.[７]ＬＩＪＱꎬＷＡＮＧＱＫꎬＧＵＹＢꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎꎬｃｈｉｔｏｓａｎꎬａｎｄｇｅｌａｔｉｎｆｏｒ３Ｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅＭｏｎｉｔｏｒꎬ２０１７ꎬ２３:５３１１￣５３２０.[８]ＳＨＡＮＧＬＬꎬＭＡＢＪꎬＷＡＮＧＦＬꎬｅｔａｌ.Ｎａｎｏｔｅｘｔｕｒｅｄｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃｂｉｌａｙｅｒｔｏｕｇｈｓｔｒｕｃｔｕｒｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ/ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｏｒｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌｒｅｐａｉｒ[Ｊ].ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎꎬ２０２０ꎬ５３(１１):ｅ１２９１７.[９]ＧＲＡＢＳＫＡ￣ＺＩＥＬＩＳＫＡＳꎬＳＩＯＮＫＯＷＳＫＡＡꎬＣＡＲＶＡＬＨＯÂꎬｅｔａｌ.Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓｗｉｔｈｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅｉｎｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ￣ｃｏｌｌａｇｅｎ/ｃｈｉｔｏｓａｎ/ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎｓｃａｆｆｏｌｄｓｃｒｏｓｓ￣ｌｉｎｋｅｄｂｙＥＤＣ/ＮＨＳ[Ｊ].Ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０２１ꎬ１４(５):１￣２０.[１０]ＹＥＰꎬＹＵＢꎬＤＥＮＧＪꎬｅｔａｌ.Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｃｈｉｔｏｓａｎ/ｎａｎｏ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｔｈｅｒｅｐａｉｒｏｆｒａｂｂｉｔｒａｄｉａｌｂｏｎｅｄｅｆｅｃｔ[Ｊ].ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１７ꎬ１４(６):５５４７￣５５５３.[１１]ＸＩＡＯＨＬꎬＨＵＡＮＧＷＬꎬＸＩＯＮＧＫꎬｅｔａｌ.Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌｒｅｐａｉｒｕｓｉｎｇｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｉｔｈｇｒａｄｉｅｎｔｐｏｒｅｓｉｚｅｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｉｔｈｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎꎬ７Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓｃｈｉｔｏｓａｎꎬａｎｄｎａｎｏ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌＮａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１９ꎬ１４:２０１１￣２０２７.[１２]ＡＳＡＤＰＯＵＲＳꎬＫＡＲＧＯＺＡＲＳꎬＭＯＲＡＤＩＬꎬｅｔａｌ.Ｎａｔｕｒａｌｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｂａｓｅｄｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓｆｒｏｍｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎꎬｇｅｌａｔｉｎａｎｄｃｈｉｔｏｓａｎｔｏｗａｒｄｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０２０ꎬ１５４:１２８５￣１２９４. [１３]ＡＢＰＥＩＫＡＲＺꎬＭＯＲＡＤＩＬꎬＪＡＶＤＡＮＩＭꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ/ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｇｅｌａｔｉｎ/ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓａｎｄｉｎｖｉｖｏｒｅｓｕｌｔｓｉｎａｒａｂｂｉｔｍｏｄｅｌｆｏｒｍｅｎｉｓｃｕｓｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｐａｉｒ[Ｊ].Ｃａｒｔｉｌａｇｅꎬ２０２１ꎻ１３(２):１５８３Ｓ￣１６０１Ｓ. [１４]ＱＩＸＮꎬＭＯＵＺＬꎬＺＨＡＮＧＪꎬｅｔａｌ.Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ/ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄａｎｄｉｔｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｏｂｉ￣ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｃａｆｆｏｌｄｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭａｔｅｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｔＡꎬ２０１４ꎬ１０２(２):３６６￣３７２.[１５]ＲＡＴＮＡＹＡＫＥＪＴＢꎬＭＵＣＡＬＯＭꎬＤＩＡＳＧＪ.Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｓｆｏｒｂｏｎｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ:Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｃｕｒｒｅｎｔｔｒｅｎｄｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭａｔｅｒｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｔＢ:ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０１７ꎬ１０５(５):１２８５￣１２９９.[１６]ＤＨＩＶＹＡＳꎬＳＡＲＡＶＡＮＡＮＳꎬＳＡＳＴＲＹＴＰꎬｅｔａｌ.Ｎａｎｏｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ￣ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄｃｈｉｔｏｓａｎｃｏｍｐｏｓｉｔｅｈｙｄｒｏｇｅｌｆｏｒｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅｒｅｐａｉｒｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ１３:１￣１３.[１７]ＢＡＯＷＲꎬＬＩＭＬꎬＹＡＮＧＹＹꎬｅｔａｌ.Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓａｎｄｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｔｈｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｎａｔｕｒａｌｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０２０ꎬ８:１￣１８. [１８]ＰＵＰＰＩＤꎬＣＨＩＥＬＬＩＮＩＦꎬＰＩＲＡＳＡＭꎬｅｔａｌ.Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒｂｏｎｅａｎｄｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｐａｉｒ[Ｊ].ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１０ꎬ３５(４):４０３￣４４０.[１９]ＶＯＬＰＩＭꎬＰＡＲＡＤＩＳＯＡꎬＣＯＳＴＡＮＴＩＮＩＭꎬｅｔａｌ.Ｈｙｄｒｏｇｅｌ￣ｂａｓｅｄｆｉｂｅｒｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＡＣＳＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ２０２２ꎬ８(２):３７９￣４０５.[２０]ＣＯＳＴＡＮＴＩＮＩＭꎬＴＥＳＴＡＳꎬＦＯＲＮＥＴＴＩＥꎬｅｔａｌ.Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｍｕｓｃｌｅｎｅｔｗｏｒｋｓｉｎ３Ｄｇｅｌａｔｉｎｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｈｙｄｒｏｇｅｌｓ:Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｔｉｆｆｎｅｓｓａｎｄｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ５:１￣８.[２１]ＨＡＦＥＺＩＭꎬＫＨＯＲＡＳＡＮＩＳＮꎬＺＡＲＥＭꎬｅｔａｌ.Ａｄｖａｎｃｅｄｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ:Ｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｐｏｌｙｍｅｒｓꎬ２０２１ꎬ１３(２３):１￣３５.[２２]ＭＥＬＬＡＴＩＡꎬＦＡＮＣＭꎬＴＡＭＡＹＯＬＡꎬｅｔａｌ.Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ３Ｄｃｅｌｌ￣ｌａｄｅｎｔｈｅｒｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｍｉｍｉｃｋｉｎｇｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ２０１７ꎬ１１４(１):２１７￣２３１. [２３]ＬＩＬꎬＹＵＦꎬＺＨＥＮＧＬＭꎬｅｔａｌ.Ｎａｔｕｒａｌｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ:Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎꎬ２０１８ꎬ１７:２６￣４１.８第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓＧＵＭｉｎｇｘｉ１ＷＡＮＧＣｈａｎｇｃｈｅｎｇ２ＴＩＡＮＦｅｎｇｄｅ３ＨＡＯＲｕｉｈｕ３ＡＮＮｉｎｇ３ＧＵＯＬｉｎ３１.ＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃａｌ ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｈｅｎｚｈｅｎＨｏｓｐｉｔａｌ Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０００Ｃｈｉｎａ ２.ＦａｃｕｌｔｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ ＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｌｉａｎ１１６０８１Ｃｈｉｎａ ３.ＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃＫｎｅｅＪｏｉｎｔａｎｄＢｏｎｅＴｕｍｏｒｓ ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＺｈｏｎｇｓｈａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｄａｌｉａｎ１１６００１ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ Ｔｏｔａｌａｒｔｉｃｕｌａｒｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓａｒｅｕｓｕａｌｌｙａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄｂｙｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌｂｏｎｅｄａｍａｇｅ ａｎｄｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｓａｎｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓｎｅｗｉｄｅａｓａｎｄａｐｐｒｏａｃｈｅｓｆｏｒｔｈｅｒｅｐａｉｒｏｆｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ ｗｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｔｈｅｒｅｐａｉｒｏｆｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓｂｙｕｓｉｎｇｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎＳＦ ｇｅｌａｔｉｎＧｅｌ ｃｈｉｔｏｓａｎＣＳ ａｎｄｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＨａｐ ａｓｔｈｅｂａｓｅｍａｔｅｒｉａｌｓｔｏｍｅｅｔｔｈｅｎｅｅｄｓｏｆｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘＥＣＭ ａｎｄｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ￣ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃｂｉｐａｒｔｉｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ.ＦｉｖｅｇｒｏｕｐｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓＨａｐ￣１％Ｈａｐ￣２％Ｈａｐ￣３％Ｈａｐ￣４％ａｎｄＨａｐ￣５％ｗｉｔｈｏｕｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｇｒａｄｉｅｎｔｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｖａｃｕｕｍｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｙｉｎｇａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｒｏｓｓ￣ｌｉｎｋｉｎｇｂｙａｄｄｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｔｏｔｈｅｃｏ￣ｂｌｅｎｄｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｔｏｓａｎａｎｄｇｅｌａｔｉｎ.Ｔｈｅ３Ｄｐｏｒｏｕｓｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｉｔｈｓｕｐｅｒｉｏｒｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｘ￣ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｙＸＲＤ ａｎｄｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｐｏｒｏｓｉｔｙ ｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｓｗｅｌｌｉｎｇ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ.Ｔｈｅｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｅｒｅｔｈｅｎｃｏ￣ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ.Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｒａｔｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｅｌｌｌｉｖｅ￣ｄｅａｄｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄＣＣＫ￣８ｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｓｓａｙｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｉｒｕｓｅｆｏｒｒｅｐａｉｒｉｎｇｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓ.Ａｌｌｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓｏｆｓｃａｆｆｏｌｄｓｈａｄｐｏｒｏｕｓｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄｔｈｅｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｗｅｌｌｉｎｇａｎｄｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇＨａｐｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｓｃａｆｆｏｌｄ ｗｈｉｌｅｔｈｅｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｇｒａｄｕａｌｌｙｓｌｏｗｅｄｄｏｗｎｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇＨａｐｃｏｎｔｅｎｔ.ＴｈｅＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｓｗｅｌｌｉｎｇｒａｔｅａｎｄｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆ１４６６％ʃ１７９％ａｎｄ８７.２５％ʃ２.２８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｕｔｉｔｈａｄｔｈｅｆａｓｔｅｓｔａｎｄｌｅａｓｔｓｔａｂｌｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｐｏｏｒｍｅｃｈａｎｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ.ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｈａｄａｐｏｒｅｓｉｚｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ２１２.８９ʃ６２.２２μｍ ａｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆ７６.５２％ʃ２.３１％ｇｏｏｄｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｓｗｅｌｌｉｎｇｒａｔｅｏｆ１２８６％ʃ１１４％ａｎｄａｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ３７.０９％ʃ１ ４１％.ＴｈｅｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｗｅｒｅｍｏｒｅｉｎｌｉｎｅｗｉｔｈｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｆｕｌｌ￣ｌａｙｅｒｅｄｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｒｅｐａｉｒ.Ｄｕｒｉｎｇｉｔｓｃｏ￣ｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓｐａｔｉｅｎｔｓｔｈｅＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｓｈｏｗｅｄｂｅｔｔｅｒｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｉ.ｅ.ｇｏｏｄｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＣＣＫ￣８ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｓｓａｙａｎｄｌｉｖｅ/ｄｅａｄｃｅｌｌｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔａｉｎｉｎｇａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｈａｄｇｏｏｄｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｌｏｗｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｐｏｒｏｕｓｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｐｒｅｐａｒｅｄｂａｓｅｄｏｎｇｅｌａｔｉｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎａｎｄｎａｎｏ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｃａｎｎｏｔｏｎｌｙｍｉｍｉｃｔｈｅＥＣＭｏｆｎａｔｕｒａｌｂｏｎｅｃａｒｔｉｌａｇｅ ｂｕｔａｌｓｏｈａｓｇｏｏｄｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｇｏｏｄｒｅｔｉｃｕｌａｒｓｋｅｌｅｔｏｎｆｏｒｎｕｔｒｉｅｎｔｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｄｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｓｔｅｒｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｎｅｗｏｐｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔ ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｇｅｌａｔｉｎ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ９。
丝素蛋白材料的制备及应用
丝素蛋白材料的制备及应用丝素蛋白是从蚕的丝腺中提取出来的一种高分子蛋白质，是一种具有优异性能和多种应用领域的材料。
丝素蛋白具有优异的生物相容性、生物降解性和可降解性，因此被广泛用于医疗保健、药物传递、组织工程、纺织品和食品工业等领域。
本文将探讨丝素蛋白材料的制备方法及其在各个领域的应用。
一、丝素蛋白的制备方法1.1从蚕茧中提取：最常用的方法是利用蚕茧提取丝素蛋白。
首先要将蚕茧煮沸，使蚕蛹死亡，然后将蚕茧浸泡在碱性水溶液中，使丝素蛋白的结构产生变化，最后提取出丝素蛋白并进行纯化处理。
1.2培养蚕卵细胞：通过培养蚕卵细胞或转基因蚕来生产丝素蛋白。
这种方法可以大量生产丝素蛋白，但需要技术上的支持和长时间的研究。
1.3培养细胞工程技术：利用培养细胞工程技术，将丝素蛋白基因导入细胞中，并在体外培养细胞以生产丝素蛋白。
这种方法可以实现定制化生产丝素蛋白，并可以控制其质量和纯度。
二、丝素蛋白的应用2.1医疗保健领域：丝素蛋白具有良好的生物相容性和可生物降解性，可以用于制备医疗敷料、生物组织支架、蛋白荷载纳米颗粒等。
丝素蛋白具有优异的生物降解性，可在人体内迅速降解，减少对患者的创伤。
2.2药物传递领域：丝素蛋白可用作药物传递的载体，可以将药物包裹在其内部，通过调控丝素蛋白的结构和性质，可以实现药物的缓释和靶向传递。
丝素蛋白在药物传递领域的应用有望为药物疗效提供新的途径。
2.3组织工程领域：丝素蛋白具有优异的力学性能和生物相容性，可以用于制备生物支架、组织工程膜、人工皮肤等。
丝素蛋白支架可以为细胞的生长和增殖提供支持，并促进组织再生和修复。
2.4纺织品领域：丝素蛋白具有优异的光泽和柔软性，可以用于制备高档纺织品，如丝绸、面料、围巾等。
丝素蛋白纤维具有良好的吸湿性和透气性，可以调节人体温度，是一种理想的纺织材料。
2.5食品工业领域：丝素蛋白可以用作食品添加剂，具有增稠、凝胶和乳化等功能。
丝素蛋白可以用于制备果冻、奶酪、蛋糕等食品，提高其质地和口感。
丝素蛋白支架的制备及其在组织工程中的应用
丝素蛋白支架的制备及其在组织工程中的应用
孔令玲;李延报
【期刊名称】《材料科学与工程学报》
【年(卷),期】2013(031)004
【摘要】作为一种天然的纤维蛋白,蚕丝具有良好的力学性能、生物相容性和可降解性,这使其在生物医学方面的应用不断拓展.多孔支架能够为细胞的粘附和增殖提供有利的微环境,在重塑和修复组织的过程中起着至关重要的作用.本文综述了丝素蛋白支架的多种制备方法,如静电纺丝法、冷冻干燥法、沥除法和发泡法等,阐述了丝素蛋白支架的表面改性方法,总结了丝素蛋白支架在组织工程中的应用.
【总页数】7页(P614-620)
【作者】孔令玲;李延报
【作者单位】南京工业大学材料科学与工程学院,江苏南京210009;南京工业大学材料科学与工程学院,江苏南京210009
【正文语种】中文
【中图分类】R318.08
【相关文献】
1.聚乳酸/丝素蛋白复合组织工程支架的制备及生物学性能的评价 [J], 邢帅;夏亚一;袁凌伟;鲁茂森
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文芳
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形孔 隙结 构 ， 横 截面微 孔结构 的平 均孔 径为 （ １ １ ２ ． ４ ３ ± １ ２ ． ６ ５ ） Ｉ ｘ ｍ， 孔 隙率高 达 （ ９ ０ ． ２ ５ ＋ ＿ ２ ． Ｏ ５ ） ％， 支架压 缩弹 性模 量为 （ ５ ２ ． ４ ８ ＋ ＿ ５ ． ７ ８ ） ｋ Ｐ ａ ； 复合脂肪干细胞 培养 ， ＨＥ染色和扫描 电镜 可见细胞均匀黏附在支架表 面及 孔隙 内， 分泌大量沿微 孔结构取 向分布 的细胞外 基质 ； Ｃ Ｃ Ｋ ８检测结果显示 细胞在支架上增 殖 良好 ； Ｌ Ｉ Ｖ Ｅ ／ Ｄ Ｅ Ａ Ｄ染 色显示细胞保持 良好的 活性 ， 未见死 细胞 。结论 取 向性 丝素蛋 白支架具有均 匀的仿生 取向微孔结 构 ， 具 有合适 的孔 径 、 孑 Ｌ 隙率和生 物相 容性 ， 力学强 度 良好 ， 可作为 软骨组织 工程的支架载体 。
关键词 ： 组织 工程 ； 软骨 ； 丝素蛋 白； 取 向微孔 ； 脂肪干细胞 中图分类号 ： Ｒ ３ ２ ９ － ３ ３ ， Ｒ ３ １ ８ ． １ 文献标志码 ： Ａ ＤＯＩ ： １ ０ ． １ １ ９ ５ ８ ０ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ０ ２ ５ ３ — ９ ８ ９ ６ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ７ ． ０ ０ ２
天津 医药 ２ ０ １ ５ 年７ 月第４ ３ 卷第 ７ 期
７ Ｄ ９
取 向性丝素蛋 白仿 生软骨支架 的制备及其 生 物相容性评估
杨强 ， 丁晓明 ， 徐宝 山 ， 赵艳红 ， 刘越 ， 张扬 ， 马信龙
摘要： 目的 方法 利用定 向结 晶技术制备 具有仿生 取向微孔 结构 的丝 素蛋 白支架 ， 探讨其 作为软骨支 架的可行性 。
ｍｉ Ｃ ｒ Ｏ ｓ ｔ ｒ Ｕ Ｃ ｔ Ｕ ｒ ｅ ｆ ｏｒ ｃ ａ ｒ ｔ ｉ ｌ ａ ｇ ｅ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ
Ｙ Ａ Ｎ Ｇ Ｑ ｉ ａ ｎ ｇ ， Ｄ Ｉ Ｎ Ｇ Ｘ ｉ ａ ｏ ｍ ｉ ｎ ｇ ， Ｘ Ｕ Ｂ ａ ｏ ｓ ｈ ａ ｎ ２ ， Ｚ Ｈ Ａ Ｏ Ｙ ａ ｎ ｈ ｏ ｎ ｇ ‘ ， Ｌ Ｉ Ｕ Ｙ ｕ ｅ ２ ， Ｚ ＨＡ Ｎ Ｇ Ｙ ａ ｎ ｇ ， ＭＡ Ｘ ｉ ｎ ｌ ｏ ｎ ｇ 。 ｉ ｎ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｔ ｉ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ ３ ０ ０ ０ ７ ￣Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｍｉ ｎ ｉ ｍａ ｌ ｌ ｙ Ｉ ｎ ｖ ａ ｓ ｉ ｖ ｅ ｉ ｎ ｅ Ｓ ｕ ｒ ｇ ｅ ｒ ｙ ， Ｔ ｉ ａ ｎ ｉ ｆ ｎ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ；
以丝素蛋 白为原料 ， 采 用定 向结 晶技术制成 具有仿生 取向微孔结 构的支架 ， 扫描 电镜观察支架 结构 ， 测量支
架 的孔径 、 孔 隙率 和力学性能 。从兔颈 背部分离 出脂肪干 细胞 ， 培养后获取第 ３代细胞 ， 接种到支架上 。Ｃ Ｃ Ｋ ８检测 支架 上细胞 增殖 情况 ； ＨＥ染色 和扫 描 电镜 观察 细胞在 支架上 的黏 附能力 ； Ｌ Ｉ Ｖ Ｅ ／ Ｄ Ｅ Ａ Ｄ染 色观察 支架上 的细 胞活
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Ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｓ ｐｏ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ Ａｕ ｔ ｈ ｏ ｒ Ｅ— ｍａ ｉ ｌ ： ｍａ ｘ ｉ ｎ ｌ ｏ ｎ ｇ ８ ６ ８ ６ ＠ｓ ｉ ｎ ａ ． ｃ ｏ ｍ
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