蚊虫对有机磷和氨基甲酸酯抗性相关羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶基因研究进展
蚊虫抗药性检测方法 生物测定法
蚊虫抗药性检测方法生物测定法1 范围本标准规定了测定蚊虫对有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类等杀虫药剂抗药性的诊断剂量法和敏感基线法。
本标准适用于淡色库蚊、致倦库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊等蚊虫抗药性的生物测定。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1敏感基线所测蚊虫的敏感品系对某种杀虫剂的毒力回归线。
2.2诊断剂由敏感品系的敏感基线计算得到的与死亡率99%或99.9%相对应的杀虫药剂剂量值(LC99或LC9⒐9),一般以2倍LC99或LC9⒐9值区别抗性和敏感种群。
2.3 F1代采集的样本繁殖后的第一代蚊虫。
3 试虫样本多点采集。
幼虫浸渍法采用F1代四龄幼虫。
成蚊接触筒法采用野外采集的幼虫或蛹羽化后,3d~5d 未吸血雌蚊。
4 试剂丙酮、乙醚、白油、杀虫剂原药等。
5 仪器蚊笼、滤纸、吸蚊器。
6 测试条件温度:25℃±1℃,光周期:⒕L:10D,相对湿度:60%~80%。
7 敏感基线法7.1 原理依据杀虫剂应用剂量和死亡机率值关系建立毒力回归方程,以敏感品系得到的杀虫剂毒力回归线作为敏感基线。
以待测昆虫种群得到的杀虫剂毒力回归线与敏感基线对比,来确定待测种群的抗性水平。
具体是比较两条毒力回归线的D 值变化以及回归线计箅得到的半数致死量的变化。
7.2 操作步骤7.2。
l 幼虫浸渍法每只烧杯量入149mL脱氯自来水。
待测药用丙酮等比例或等差稀释至一个系列浓度,通过预实验确定药剂浓度系列范围最低浓度时幼虫死亡率小于20%最高难度大于8O%,然后吸取1mL已配制好的药液滴入水面上，用玻璃棒搅匀，然后把另一杯中预先挑选的幼虫（30只）连同50mL%~80%的水全部注人烧杯内,合计200mL水溶液整个实验保持在25℃±1℃, 相对湿度60%~80%的温室内,24h后检查死亡数死亡率剂量取对数、将死亡率转换为概率单位进行回归，求出LD50值。
7.3 死亡判断7.3.1 幼虫浸渍法轻轻触动幼虫,以不能逃避剌激视7.4 结果表述结果用抗性倍数表述,抗性倍数=待测种群LC50值/敏感种群LC5°值。
昆虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展
Entomology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China; 2 Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China) Abstract: Recent advances in the studies of acetylcholinesterase ( AChE, EC 3 1 1 7) genes from insects were reviewed. The gene structure, including ten extrons of insect AChE gene ( ace ) , was discussed. All the ace genes reported from insects were summed up, and the phylogenetic tree was constructed based on the reported complete sequences of ace genes from insects. The ace structure characterist ics, the functional sites of ace genes, the effect of ace mutation ( s) on insecticide resistance and their relationships were also discussed. Finally, the problems and prospects in the studies of insect ace were analyzed. Key words: Acetylcholinesterase; acetylcholinesterase genes; molecular evolution; mutation; resistance 自 Dale ( 1914) 提出在马血清中存在乙酰胆碱 酯 酶 ( acetylcholinesterase, AChE, EC3 1 1 7 ) 以 来, 对乙酰胆碱酯酶的研究已有 80 多年。乙酰胆 碱酯酶是一种丝氨酸水解酶, 它的主要功能是在胆 碱能神经突触处通过快速水解 神经递质乙酰 胆碱 ( ACh) 而中止神经冲动的传递。AChE 又是有机磷 ( OP) 和氨基甲酸酯 ( CB) 类杀虫剂的作用靶标 , 这两类杀虫剂是 AChE 的强力抑制剂 , 通过与活性 位点 的 丝 氨 酸 ( Ser ) 残 基 形 成 共 价 键 而 抑 制 AChE 。因此, AChE 的研究已涉及医学、军事 ( 化 学武器) 、化学、农药和植物保护等学科。近年来 研究发现 AChE 的抑制剂可用于治疗各种疾病, 如 重症肌无力、青光眼和老年性痴呆症阿尔次海姆症 ( Alzheimer) ( 唐振华和毕强 , 2003) ; 还发现 AChE 与神经生长和细胞凋亡有关 ( Duysen et al . , 2002) 。
昆虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展
昆虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展1林同，李立娜华南农业大学林学院，510642E-mail：lintong@摘要：昆虫乙酰胆碱酯酶是有机磷杀虫剂和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，乙酰胆碱酯酶基因突变可导致乙酰胆碱酯酶对杀虫剂不敏感而是昆虫产生抗药性。
黑腹果蝇和家蝇等昆虫只有一个乙酰胆碱酯酶基因，但冈比亚按蚊等昆虫乙酰胆碱酯酶基因有两个或多个拷贝。
本文还综述了昆虫乙酰胆碱酯酶基因的结构和表达调控等。
关键词：乙酰胆碱酯酶基因；基因点突变；抗药性；基因拷贝乙酰胆碱酯酶（AChE）是在神经系统中的一种主要的酶，能通过催化神经传递介质胆碱酯酶的水解而终止神经冲动。
AChE是有机磷酸酯类(OP)和氨基甲酸酯类杀虫剂的主要靶标[1]，数量和性质的改变会使昆虫对杀虫剂产生抗性[2，3]。
1. 昆虫乙酰胆碱酯酶基因的结构与表达调控人们已经研究了20多种昆虫乙酰胆碱酯酶生化特性[4]，并对一些昆虫乙酰胆碱酯酶基因(Ace)结构进行了分子分析，这些昆虫包括黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）[5]、印度按蚊（Anopheles stephensi）[6]、埃及伊蚊（Aedes aegypti）[7]、马铃薯叶甲（Leptinotarsa decemlineata）[8]、、家蝇（Musca domestica）[9]、尖音库蚊（Culex pipiens）[10]、黑尾夜蝉（Nephotettix cincticeps）[11]、铜绿蝇（Lucilia cuprina）[12]、麦二叉蚜（Schizaphis graminum）[13]、油橄榄果实蝇（Bactrocera oleae） [14]、棉蚜（Aphis gossypii）[15]和冈比亚按蚊（A. gambiae）[16]等。
铜绿蝇AChE序列和其他双翅目昆虫的高度同源，尤其是和家蝇和黑腹果蝇。
铜绿蝇序列与家蝇的AChE有92.4%的氨基酸相似性，与黑腹果蝇的有85.3%氨基酸相似性，近似于按蚊和伊蚊之间的相似性[6，7]。
蚊虫对杀虫剂抗药性机理的研究进展
己酸萘酶（ — Ａ 及 Ｂ ａ Ｎ ） 一己酸萘酯 （ 一Ｎ ） 为底物来测定 １ Ａ作 ３
酶活性。据现有资料 ， 尖音库蚊复合 组 （ 谖色 库蚊和 致倦库 蚊 ） 的高 活性 酯酶为 Ａ 、 ２ Ａ 、 ５ Ｂ 、 ２１ Ｉ Ａ 、 ４ Ａ 、 ＩＩ 、４及 Ｂ ， １ ３ ５醇酶 Ａｌ 主要
Ａ ４对 ａ ＮＡ的 Ｋｍ值相 同， 明三者 的活性部位相似 。即抗 —Ｄ 说
性 与敏感蚊的酯酶在结构上没有质 的差异 ， 活性 的差别 可 酶 Ｂ 主要分布 于北 美及东亚 ， 醇 ｌ
醇酶 Ａ ／ 最初在 亚 洲及 非洲 发 现 ． ２ｍ 随后 又 在美 国及欧 洲 出 现， 酶酶 Ａ ／ ４ ｇ５Ｂ ４ Ｂ 、． ５主要分布 于地 中海地 区． ／ 日本 的谖色 库 蚊扰 乱亚种 （ ａ． 胁 ／ ｔｓ 的高活性 酯酶 为 Ｃ Ｃ＂ ｍｏｅ ｕ ） ￣ Ｅ—Ｂ 跗 ， 斑库 蚊（ ｘ．ａｓｌ ） Ｃ ｔ ａｉ 的高活性 酯酶 为 Ａ 、３ ｒ ｓ ３１ 。 ３
Ｍｏｅｅ 用醇 酶 Ａｌ Ｂ 抗体对抗性及敏感品系的酶酶作 ｕｈｓ 及 ｌ 免疫 印蔼分析 ， 发现淡色库蚊抗毒死蜱品 系（５ ） ￥ ４ 的醇 酶 Ａ１ 古 量比敏感 品系高 ７ ， Ｓ ４的 １０倍 抗性平 行 ； ０倍 与 ５ ０ 伺样 ， ｒ— Ｔｅ ｎ Ｒ品系的醇 酶 Ｂ 含量是敏感 品系的 ５０倍 ， Ｔ ｒ —Ｒ的 ８０ ｌ ０ 与 ｅ ｎ ０ 倍抗性一 致 ； 另一方面他们 用醋酶 Ｂ １抗体 沉淀 了 １ 一Ｒ 幼 － 锄 虫与敏感幼虫 的 ｍ Ａ俸 外翻译 产物 。 现 Ｔ ｒ ＲＮ 发 ｅ ｎ—Ｒ蚊 虫 的 ６７ ０ ×ｌ３多肚 （ 与天然 ６７×１ ３ 白质 相对应 ） 量 明显高 于 ． ０蛋 音 敏感 品系 。接着他们 用 ｘ ｔｌ ｇｌ 构建 了 Ｔｅ ｒ ｎ—Ｒ 的 ｅ ＮＡ库 。 Ｄ 从 中筛选 出一个表 达１３ ×１＇ 半乳糖 苷 酶融合 蛋 白的重 组 ．５ ０ 一Ｂ
昆虫对杀虫剂的抗性机制概述
昆虫对杀虫剂的抗性机制概述摘要: 昆虫抗性机制的研究对于抗性监测、治理等具有重要意义, 综述了昆虫对几种杀虫剂的抗性机制。
关键词: 杀虫剂; 抗药性; 苏云金杆菌; 阿维菌素随着杀虫剂长期、大量、广泛地使用, 昆虫对杀虫剂产生的抗性也越来越引起人们的关注。
尽管在杀虫剂的更新、混合、交替使用方面做了大量工作, 延缓了杀虫剂抗性的产生, 但昆虫对杀虫剂的抗药性上升趋势仍不可遏制。
综述了昆虫对化学农药、苏云金杆菌、阿维菌素的抗性机制。
1 昆虫对化学农药的抗性机制1. 1 表皮穿透性的降低昆虫表皮对药剂穿透性降低, 可延缓杀虫剂到达靶标部位的时间, 使昆虫有更多的机会来降解杀虫剂。
虽然表皮穿透下降只表现低水平抗性, 但作为其它抗性因子的修饰者则很重要, 如与解毒作用相结合, 就可大大影响死亡率而增加抗性。
表皮穿透性降低机制在家蝇、埃及伊蚊、致倦库蚊、淡色库蚊等均有发现[ 1] 。
不同的杀虫剂或不同的昆虫表现出的穿透性降低在程度上存在差别, 但穿透性降低是所有昆虫抗性普遍存在的一个因素, 杀虫剂穿透性的降低是受Pen 基因所控制的[ 2] 。
1. 2 解毒酶活力的增强与杀虫剂代谢相关的解毒酶的解毒作用增强是抗性产生的主要原因之一。
这些解毒酶主要包括细胞色素P450 介导的多功能氧化酶、谷胱甘肽转移( GST ) 、水解酯酶等。
多功能氧化酶是昆虫体内参与各类杀虫剂以及其它外源和内源化合物代谢的主要解毒酶系,可使杀虫剂降低或失去杀虫活性, 从而使昆虫产生抗药性。
P450 酶系的解毒代谢能力增强是因为抗性昆虫体内P450 过表达。
与抗性相关的P450 基因主要有6 个: CYP6A1、CYP6A2、CYP6A8、CYP6A9、CYP6B2 和CYP6D1[ 3] 。
多功能氧化酶是多种昆虫对拟除虫菊酯、辛硫磷、吡虫啉、有机磷、氨基甲酸酯类以及生长调节剂定虫隆等多种杀虫剂产生抗性的主导因素。
杀虫剂中许多有机磷化合物是被虫体的GST 所解毒。
蚊虫抗药性研究主要进展
第24卷第6期口岸卫生控制媒介生物调查与分析蚊虫抗药性研究主要进展姜陆邹玉梅高玉峰大连国际旅行卫生保健中心(辽宁，大连,116001)摘要蚊虫抗药性机制的研究对抗药性监测、治理等具有重要意义。
随着分子生物学、基因组学的发展，蚊虫抗药性的分子机制得到普遍验证。
蚊虫的抗性机制主要有代谢抗性、靶标抗性和行为抗性。
现主要针对代谢抗性和靶标抗性进行综述，了解广泛使用杀虫剂之后蚊虫抗性产生的分子机制。
关键词蚊虫抗药性代谢抗性靶标抗性中图分类号R384.1文献标识码B doi10.3969/j.issn.1008-5777.2019.06.018Major Advances in Mosquito Resistance ReserachJiang Lu Zou Yumei Gao YufengDalian international travel healthcare center(Dalian,Liaoning,116001)Abstract The study on the mechanism of mosquito drug resistance is of great significance to the monitoring and management of drug resistance.With the development of molecular biology and genomics,the molecular mechanism of mosquito resistance has been widely verified.The main resistance mechanisms of mosquitoes are metabolic resistance,target resistance and behavioral resistance.Metabolic resistance and target resistance are reviewed to understand the molecular mechanism of mosquito resistance after extensive use of insecticides.Key words Mosquito Insecticide resisatance Metabolic resistance Target site resistance蚊虫可传播多种疾病，如疟疾、登革热、丝虫病等，是重要的病媒生物之一，其行为与人类生活息息相关，对人类健康威胁巨大。
实验三杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
实验三杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用一、试验原理和目的在昆虫中枢神经系统的兴奋性突触中，乙酷胆碱是主要神经递质，它通过生物合成、释放以及与受体的结合，使得神经传导能正常进行。
当神经接受到某一刺激时，冲动传导到突触处，就由突触前膜释出含有乙胆碱的小囊胞，一次冲动可释出小囊胞100-150个，每个小囊胞含有乙酰胆碱(ACh)分300-2000个。
在突触后膜上约有乙酰胆碱分子900个就可产生局部膜电位的去极化，致神经传导正常进行。
多余的乙酰胆碱分子及完成刺激受体后而解离的乙酰胆碱分子应立即被突触间隙的乙酰胆碱酯酶(AChE)所水解，使神经又处于静止状态而有利于迎接下一个刺激。
因此，比较乙酰胆碱酯酶的活力和性质，可以作为测定神经递质的一个指标。
有机磷酸酯和氨基甲酸酯类杀虫剂在昆虫体内主要作用于神经系统，抑制胆碱酯酶的活性，导致神经传导的阻抑而引起昆虫中毒死亡。
研究其毒理机制，胆碱酯酶活力是重要指标之一。
其活力测定方法较多，发展较快，有测压和测pH法、比色法、电化学法、荧光法、放射法等。
其中比色法中由于应用的底物和显色剂不同，又有不同的测定方法。
本实验主要介绍一种常用的比色测定方法乙酰硫代胆碱一二硫双对硝基苯甲酸法(ASCh一DTNB法)。
该法是Ellmanl961年创制的方法，其原理是应用乙酰硫代胆碱(ASCh)为底物，在胆碱酯酶作用下水解为硫代胆碱及乙酸，然后以二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂，形成黄色产物，在412nm处有最大吸收峰。
生成物浓度和光密度在一定范围内密切相关，故用分光光度计可以进行定量测定，以此代表AChE的活性。
本实验通过测定有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对昆虫乙酰胆碱酯酶活力的影响，以理解该两类杀虫剂的作用机理，并熟练掌握该酶活性测定方法。
二、仪器、试剂和材料1. 仪器721型分光光度计、冰箱、离心机、恒温水浴、匀浆器、具筛刻度试管、吸管等。
2. 供试昆虫5或6龄的粘虫或家蝇成虫。
昆虫对化学杀虫剂的抗性产生机理及防治对策
ＯＣＣＵＰＡＴＩＯＮ1262010 8自１９９３年，瑞典发现ＤＤＴ对家蝇具有明显滞留杀虫作用以来，各类农药在世界范围内广泛应用于农业和卫生害虫的防治，对除害灭病确保人体健康起到了非常显著的作用，也曾经挽救过成千上万人的生命。
但是许多用巨额开发出的新型杀虫剂由于使用不当，几年中就导致药效减退或是失效现象，这不仅直接影响了杀虫剂的工业发展前途，而且威胁到人类的健康，日益引起世界各国的重视。
在过去的几年中，Ｒａｔｈｍａｎ等人做了四种品系鸟蝇科拟寄生虫的生测实验，发现杀线威和灭多威对抗性品系及敏感品系的最大抗性比分别达２０和２１；高希武等人发现，北京地区马连洼种群对抗蚜威和未曾使用过的灭多威、呋喃丹均产生了高抗性，抗性倍数为３９～２４５倍。
可见昆虫对部分杀虫剂的抗性已很强，研究昆虫的抗药性机理及提出可行的解决办法成为当务之急。
一、抗药性的产生机理关于昆虫抗药性的产生机理分为选择学说和诱变学说。
选择学说认为昆虫对杀虫剂的抗性发展是昆虫在杀虫剂的选择下，带有抗性基因的个体存活下来衍繁后代的结果；诱变学说认为是昆虫种群中某些个体的抗性基因并不是先天存在的，而是由于杀虫剂的直接作用，使得种群中的某些个体发生了突变，因而产生了抗性基因。
所以他们认为昆虫的抗药性是一种后适应现象，杀虫剂不是选择剂而是诱变剂。
但是，无论是选择学说还是诱变学说，在抗药性的形成是由于杀虫剂作用的结果这一点上是相同的。
昆虫的抗药性机理大致可分为行为抗药性和生理生化抗药性。
行为抗性国内外研究均较少，而对生理生化抗性研究相对较多。
关于昆虫的生理生化抗性主要有以下三个方面：表皮穿透作用的降低，代谢解毒作用的加强，靶标敏感性降低。
1.表皮穿透作用的降低降低穿透速率的原因至今尚不完全清楚，Ｓａｉｔｏ认为抗三氯杀螨醇的螨对该药穿透速率较慢是由于几丁质较厚引起的，Ｖｉｎｓｏｎ则认为抗ＤＤＴ的烟芽夜蛾幼虫，ＤＤＴ穿透较慢是由于凡丁质内蛋白质与脂类物质较多而骨化程度较高而引起的。
有机磷和氨基甲酸酯类的免疫学检测研究进展
有机磷和氨基甲酸酯类的免疫学检测研究进展作者：赵晓明来源：《农民致富之友（上半月）》 2019年第16期对近年有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的免疫学检测方法进行综述，阐述了不同方法的检测原理。
以期为农药残留检测研究与应用提供了参考。
我国是农业大国，也是农药生产和使用大国。
由于农药品种结构存在不合理，以及使用者违规或者大剂量的使用农药，这使得农药残留问题在我国仍比较突出。
目前我国食品农药残留最为主要的是有机磷和氨基甲酸酯类。
食品中农药残留量超标，直接影响食用者的身体健康。
目前，对于农药残留的检测涉及多种手段，如紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、免疫分析技术、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用技术、酶抑制法、生物传感器法、毛细管电泳法等，其中，免疫分析技术利用抗原、抗体反应，具有高度专一性和特异性的优势，在农药残留分析中具有广泛的应用前景。
本文对有机磷和氨基甲酸酯类农药目前使用的免疫学检测方法进行综述，以期为技术人员选择检测方法提供启示。
1、直接免疫学检测①酶联免疫法由于有机磷和氨基甲酸酯类均为小分子，往往仅有一个抗体结合位点，因而，通常采用竞争ELISA方法对其进行检测。
刘运清等建立了3种有机磷农药的间接竞争ELISA检测方法。
王华建立了直接竞争ELISA方法用于检测甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷。
②荧光偏振免疫检测荧光偏振免疫检测（FluorescencePolarizationImmunoassay，FPIA）是一种将荧光偏振原理和小分子竞争免疫原理相结合的免疫分析方法，通过检测荧光标记小分子抗原与抗体结合前后荧光偏振值的变化来间接反映样本中目标分析物的含量。
目前已报道了FPIA用于百草枯、西玛津、三嗪等20多种农药的检测。
③免疫层析免疫层析法是基于毛细作用、抗原抗体反应的固相检测方法，其优点在于结构简单，检测方便，不需要专用仪器设备，通过观察检测带的颜色即可直观的确定目标物是否存在。
昆虫对杀虫剂的抗性机制概述
昆虫对杀虫剂的抗性机制概述昆虫对杀虫剂的抗性机制概述摘要: 昆虫抗性机制的研究对于抗性监测、治理等具有重要意义, 综述了昆虫对几种杀虫剂的抗性机制。
关键词: 杀虫剂; 抗药性; 苏云金杆菌; 阿维菌素随着杀虫剂长期、大量、广泛地使用, 昆虫对杀虫剂产生的抗性也越来越引起人们的关注。
尽管在杀虫剂的更新、混合、交替使用方面做了大量工作, 延缓了杀虫剂抗性的产生, 但昆虫对杀虫剂的抗药性上升趋势仍不可遏制。
综述了昆虫对化学农药、苏云金杆菌、阿维菌素的抗性机制。
1 昆虫对化学农药的抗性机制1. 1 表皮穿透性的降低昆虫表皮对药剂穿透性降低, 可延缓杀虫剂到达靶标部位的时间, 使昆虫有更多的机会来降解杀虫剂。
虽然表皮穿透下降只表现低水平抗性, 但作为其它抗性因子的修饰者则很重要, 如与解毒作用相结合, 就可大大影响死亡率而增加抗性。
表皮穿透性降低机制在家蝇、埃及伊蚊、致倦库蚊、淡色库蚊等均有发现[ 1] 。
不同的杀虫剂或不同的昆虫表现出的穿透性降低在程度上存在差别, 但穿透性降低是所有昆虫抗性普遍存在的一个因素, 杀虫剂穿透性的降低是受Pen 基因所控制的[ 2] 。
1. 2 解毒酶活力的增强与杀虫剂代谢相关的解毒酶的解毒作用增强是抗性产生的主要原因之一。
这些解毒酶主要包括细胞色素P450 介导的多功能氧化酶、谷胱甘肽转移( GST ) 、水解酯酶等。
多功能氧化酶是昆虫体内参与各类杀虫剂以及其它外源和内源化合物代谢的主要解毒酶系,可使杀虫剂降低或失去杀虫活性, 从而使昆虫产生抗药性。
P450 酶系的解毒代谢能力增强是因为抗性昆虫体内P450 过表达。
与抗性相关的P450 基因主要有6 个: CYP6A1、CYP6A2、CYP6A8、CYP6A9、CYP6B2 和CYP6D1[ 3] 。
多功能氧化酶是多种昆虫对拟除虫菊酯、辛硫磷、吡虫啉、有机磷、氨基甲酸酯类以及生长调节剂定虫隆等多种杀虫剂产生抗性的主导因素。
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第13卷 第1期2006年3月寄生虫与医学昆虫学报Acta Parasitol.Med.Entomol.Sin.Vol 13,No 1Mar.,2006收稿日期:2005 06 07*通讯作者Email:zhaoty@蚊虫对有机磷和氨基甲酸酯抗性相关羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶基因研究进展李春晓 赵彤言*(军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京 100071)摘要 对杀虫剂产生抗药性日益成为媒介蚊虫防治中心突出问题,有机磷和氨基甲酸酯是害虫防治中主要使用的杀虫剂类型。
本文主要针对蚊虫对有机磷和氨基甲酸酯抗性相关羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶基因的研究进展进行了阐述。
关键词 蚊虫;抗性;羧酸酯酶;乙酰胆碱酯酶媒介蚊虫严重危害人类的健康,除了吸血骚扰之外,还能传播诸如疟疾、登革热、黄热、淋巴丝虫病等多种疾病。
随着人类交往的日益频繁,发现了许多新的和重新出现的由媒介昆虫传播的疾病。
化学防治不仅在目前,甚至在最近10年、20年内,仍然是防治蚊虫的重要手段。
然而,随着杀虫剂的长期和大量的使用,特别是防治农林害虫的杀虫剂的广泛应用,在导致目标害虫产生抗性的同时,也导致在其周围环境孳生的蚊虫的抗性越来越严重。
而且,杀虫剂对环境及其对自然生态平衡的影响,也有增无减,它们都成为现代蚊虫防治中的突出问题。
蚊虫由于自然迁飞和被动迁移等因素,从一个地区扩散到另一个地区,同时携带着抗性基因。
这种抗性基因的扩散传播直接导致了另一个地区的蚊虫也对杀虫剂产生了一定程度的抗性(Raymond et al .,1985,1987),这些都直接威胁着病媒蚊虫的控制。
世界各国每年都投入大量的人力、物力来防治蚊虫。
对于蚊虫抗性的研究可以为蚊虫治理提供指导,预测抗性发展趋势,为制定更经济、更有效的治理策略以及延缓抗性的发展提供一些参考,因而具有重要的意义。
有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂自上个世纪中叶被开发合成以来,由于其具有合成简单、杀虫谱广、价格便宜等优点,被广泛的应用于对害虫的防治中。
由于其广泛和长期的使用,许多害虫对此产生了抗性,尤其是在那些重要经济作物和农业作物的种植区,长期大量的使用单一品种的有机磷杀虫剂,使害虫对这些杀虫剂产生了几十倍甚至高达数百倍的抗性(洪波等,2000;谢佳燕等,2001)。
与此同时栖息在这些地区的蚊虫由于长期接触杀虫剂而对此类杀虫剂也会产生或高或低的抗性(刘俊娥和乔传令,2001)。
不同昆虫在产生抗性的过程中进化的生理和生化机制是不尽相同的,目前关于有机磷和氨基甲酸酯的抗性研究主要集中在乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽 S 转移酶、细胞色素P450等的活性和敏感性上。
大量的研究结果表明大部分昆虫对有机磷和氨基甲酸酯的抗性主要只与羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶有关。
1 羧酸酯酶蚊虫体内羧酸酯酶是对杀虫剂解毒的重要水解酶之一,它普遍存在于蚊虫体内各种组织中,参与酯类杀虫剂的解毒作用。
酯酶在对有机磷杀虫剂抗性中起着极为重要的作用,在对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性中也起到一定作用。
酯酶介导的抗性通过两种方式起作用:与杀虫剂快速结合而产生的广谱抗性;通过一个普通的酯键快速代谢而产生对小部分杀虫剂的抗性51(Herath et al.,1987;Karunaratne et al.,1995)。
1 1 数量变化已经在许多种节肢动物中发现在有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的选择压力下,昆虫体内非特异性酯酶会过量产生,这些节肢动物包括蚊虫、牛蜱、蚜虫和蜚蠊等。
已经详细研究过这种抗性机制的蚊虫种类包括库蚊属的尖音库蚊(Culex pipiens pipiens)、致倦库蚊(C x.pipiens quinquefasciatus)、环跗库蚊(Cx.tarsalis)和三带喙库蚊(Cx.tritaeniorhynchus)(Karunaratne et al.,1998;Mouches et al.,1986;Hemingway and Karunaratne,1998)。
在抗性尖音库蚊中羧酸酯酶的过量表达机理是被研究得最为详细的。
尖音库蚊中Est 3和Est 2位点上的酯酶Est 和Est 基因的单独或协同扩增导致相应酯酶的过量产生是蚊虫对有机磷杀虫剂产生抗性的主要机制。
被扩增的酯酶基因有Est 11、Est 12、Est 2 Est 2、Est 4 Est 4、Est 5 Est 5、Est 6、Est 7、Est 8 Est 8和Est 9 Est 9(Mouches et al.,1986;Raymond et al., 1989,1991;Poirie et al.,1992;Xu et al., 1994;Vaughan et al.,1995;Rooker et al., 1996;Qiao et al.,1999;Weill et al.,2001)。
其中Est 2 Est 2、Est 4 Est 4、Est 5 Est 5、Est 8 Est 8和Est 9 Est 9是共扩增的基因。
Guillemaud等(1997)采用点杂交分析常见酯酶基因的扩增水平,发现TE M R系中Est 11基因扩增了20倍(该品系中Est 基因未发生扩增), SELAX系中Est 2 Est 2基因扩增了30~40倍, VI M系中Est 4 Est 4基因扩增了6~8倍, CYPRUS系中Est 5 Est 5基因扩增了40~60倍。
这些抗性库蚊品系基因拷贝数显示,酯酶结构基因发生扩增导致酯酶蛋白质含量有不同程度的增加,因而使库蚊对有机磷杀虫剂产生不同程度的抗性。
同时研究表明库蚊体内酯酶基因的扩增是酯酶活性升高的主要分子机制。
Raymond等(1989)用Est 11基因的cDNA探针对各筛选种群和野外自然种群的蚊虫基因组DNA做Southern 印迹分析。
结果显示不管是致倦库蚊还是环跗库蚊,其Est 基因都有一定程度的扩增。
Paton等(2000)应用荧光定量PCR技术对致倦库蚊抗性品系和敏感品系的Est 2和Est 2进行定量分析,结果显示抗性品系基因组中Est 2和Est 2基因拷贝数要高于敏感株中80倍左右。
这些研究结果说明酯酶基因扩增在抗性蚊虫中是一个普遍现象,正是由于酯酶结构基因发生扩增,而导致酯酶蛋白含量有不同程度的增加,使蚊虫对杀虫剂产不同程度的抗性。
1 2 质的变化在某些具有抗性的蚊虫种类中,酯酶的活性增强表现在能够快速的水解杀虫剂而不是结合能力的增强。
这种机制经常在与马拉硫磷有关的抗性中发现,还可以引起较之过量产生非特异性酯酶要小得多的交互抗性谱(某些时候只针对马拉硫磷类型的杀虫剂)。
马拉硫磷酯酶抗性已经在库态按蚊(Ano pheles culici f aces),斯氏按蚊(An. stephensi)和阿拉伯按蚊(An.arabiensis)中发现(Hemingway,1982a,1982b,1983;Herath et al.,1987)。
目前在蚊虫中还没有发现基因的改变造成酯酶质的变化的现象,但是来自其它昆虫的数据显示,酯酶结构基因上1个或者2个氨基酸的突变就有可能导致抗性的产生,这种点突变会显著的改变酯酶的底物特异性。
酯酶质的变化导致对马拉硫磷产生抗性的现象已在几种昆虫中的酯酶基因中发现,包括家蝇(Musca do mestica)、丝光绿蝇(Lucilia cuprina)和寄生性胡蜂(Anisopteromalus calandrae)(Claudianos et al.,2002;Ca mpbell et al.,1998;Zhu et al., 1999)。
在这几种不同的昆虫中中,有1个突变位点是相同的(Trp251),在家蝇和丝光绿蝇中突变为Leu,而在胡蜂中则突变为Gly。
第2个点突变发生在Gly139,在丝光绿蝇中突变为Asp,导致对除了马拉硫磷以外很多有机磷杀虫剂的交互广谱抗性(Campbell et al.,1998),该点突变在家蝇中也有发现(Claudianos et al., 1999)。
这留给我们一个思索,如果在蚊虫相同基因位点上也发生相同的突变是否也会导致对马拉硫磷产生抗性。
2 乙酰胆碱酯酶对几种蚊虫的生物化学检测结果显示,造成抗性的原因是不敏感的乙酰胆碱酯酶(Acetylc holinesterase,AChE),这是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的靶标位点。
AChE在神经系统中具有重要的作用,通过水解乙酰胆碱传递神经冲动。
杀虫剂通过共价结合活性位点沟的丝氨酸,将其磷酰化或者氨基甲酰化来抑制酶的活性52寄生虫与医学昆虫学报第13卷第1期(Corbett,1974)。
对美国中部An.albimanus的研究发现一个变构的AChE是造成对有机磷和氨基甲酸酯抗性的主要机制(Ayad and Georghiou, 1979;He mingway and Georghiou,1983),同时在墨西哥的相同蚊虫种群中也有同样的发现(Penilla et al.,1998)。
不敏感的AChE已经在尖音库蚊、致倦库蚊、三带喙库蚊、最黑按蚊An. nigerimus、An.atroparvus和萨氏按蚊An. sacharovi等蚊虫中有报道(Villani and Heming wa y,1987;Bisset et al.,1990;He mingway, 1982a,1982b;Hemingway et al.,1985,1986),但是在冈比亚按蚊An.gambiae中直到最近才有不敏感AChE的报道(N Guessan et al., 2003)。
纵观所有昆虫种类,有两种截然不同的靶标抗性类型,导致产生对氨基甲酸酯高抗和对有机磷低抗,或者对有机磷高抗和对氨基甲酸酯相同或者是相对低的抗性(Russell et al.,2004)。
至今为止所有蚊虫的靶标抗性均属于前者。
在黑腹果蝇(Droso phila melanogaster)中只有一个基因编码AChE(Ace)(Fournier et al., 1989),已经在抗性种群中发现了不同的点突变(Mutero et al.,1994)。
这些突变的氨基酸中的两个也在抗性家蝇中有发现:其中一个在橄榄实蝇(Bactrocera oleae)抗性种群中发现,该突变导致了对有机磷杀虫剂的抗性(Vontas et al., 2001)。
单独的点突变导致低水平的不敏感性,不会显著的影响神经递质水解的速率,而不同点突变的结合会导致抗性的增强。
这些突变使活性位点沟的颈口缩小,从而限制分子量比底物乙酰胆碱要大的杀虫剂接近活性位点沟底部的催化位点氨基酸而乙酰胆碱仍可正常水解。
在尖音库蚊和三代喙库蚊中,发现AChE介导的抗性基因位于染色体 上,而以往克隆的AChE基因(Ace2)都是性连锁的,由此推断至少存在着两个编码AChE的基因(Bourgue t et al.,1996;Malcolm et al.,1998;Mori et al., 2001)。