E.Coli 感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定

在胶中的位置。 色，可确定DNA在胶中的位置。 可确定 在胶中的位置 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素： 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素： DNA迁移率的因素
DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象 电场强度； 构象； DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 的分子大小 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。
镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水纸，一次性塑料手套等； 吸水纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5α受体菌 -M-)， pGEX-PDIP-r质粒 受体菌(R 受体菌 ， 质粒 (AmpR) 2、试剂： LB培养基: 10g/L， 5g/L， LB培养基:蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， 培养基 10g/L， 15g/L（固体培养基）， ），用 NaCl 10g/L，琼脂粉 15g/L（固体培养基），用10 mol/L的NaOH调节pH为7.0，高压灭菌； 调节pH mol/L的NaOH调节pH为7.0，高压灭菌； 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 50 含有抗菌素的LB平板培养基：将配置好的LB LB固体培 含有抗菌素的LB平板培养基：将配置好的LB固体培 LB平板培养基 养基高压灭菌后，冷却到60度左右， 60度左右 养基高压灭菌后，冷却到60度左右，加入氨苄青霉素 终浓度为50µg mL浓度50-100µg／mL）； 50µg／ 浓度50 （终浓度为50µg／mL浓度50-100µg／mL）；
影响核酸限制性内切酶活性的因素：
DNA的纯度； DNA的甲基化程度 的甲基化程度； 酶切消化反应的温度； DNA的纯度； 的纯度 DNA的甲基化程度； 酶切消化反应的温度； DNA的分子结构 溶液中离子浓度及种类； 的分子结构； pH值 DNA的分子结构；溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的 pH值。
二.实验原理 实验原理
感受态细胞制备: 1 、 感受态细胞制备 : 所谓感受态是指受体细胞处 于容易吸收外源DNA的一种生理状态， DNA的一种生理状态 于容易吸收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理 与化学方法诱导形成， 也可以自然形成， 与化学方法诱导形成 ， 也可以自然形成 ， 在基因工 程技术中通常采用诱导的方法。 程技术中通常采用诱导的方法 。 用于转化的受体菌 Restriction细 胞 一 般 是 限 制 - 修 饰 系 统 （ RestrictionModification） 缺陷的变异株， Modification ） 缺陷的变异株 ， 以防止对导入的外 DNA的切割 用符号R 表示。 其基本原理是： 的切割， 源 DNA 的切割 ， 用符号 R-M- 表示 。 其基本原理是 ： 细 菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞 菌处于0 低渗溶液中，会膨胀成球形， 膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNA DNA形成 膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成 DNase的羟基 钙磷酸复合物黏附于细胞表面， 的羟基抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经
复合物， 过 42℃ 短时间的热激处理 ， 促进细胞吸收 ℃ 短时间的热激处理， 促进细胞吸收DNA复合物 ， 复合物 在丰富的培养基上生长数小时后， 在丰富的培养基上生长数小时后 ， 球状细胞复原并分 裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。 裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。 2、 碱裂解法小量制备质粒 、 碱裂解法小量制备质粒DNA： 碱裂解法是基于 ： 线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒 与小分子环形质粒DNA的变性 线性大分子染色体 与小分子环形质粒 的变性 复性的差异达到分离目的的， 复性的差异达到分离目的的 ， 在 pH12.0～ 12.6的碱性 ～ 的碱性 环境中，线型染色体DNA和环型质粒 和环型质粒DNA氢键会发生 环境中，线型染色体 和环型质粒 氢键会发生 断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型 断裂 ，双链解开而变性 ，但质粒 由于其闭合环型 结构，氢键仅发生部分断裂， 结构 ， 氢键仅发生部分断裂 ， 而且其互补链不完全分 当将pH值调节到中性并在高盐浓度下 值调节到中性并在高盐浓度下， 离；当将 值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的 染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结 染色体 互补链不能复性而交联形成不溶的网状结 通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子 构，通过离心，大部分染色体 、
三．实验材料与设备： 实验材料与设备：
1、用品与与仪器： 用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、 恒温振荡器、移液器、微型离心管等、 箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速 离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪， 离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝 胶成像仪、冰箱、制冰机等； 胶成像仪、冰箱、制冰机等； tip头 烧杯、 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒
RNA和蛋白质 和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而 复合物等一起沉淀下来而被除去， 和蛋白质 复合物等一起沉淀下来而被除去 部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复 在中性条件下很快复 部分变性的闭合环状的质粒 性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中， 恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中， 离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。 。 离心后上清中便含有所需要的质粒 3、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一 、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶， 类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的 分子特异性核酸序列的DNA水解酶， 水解酶， 类能识别双链 分子特异性核酸序列的 水解酶 是体外剪切基因片段的重要工具， 是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物 中。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具 根据限制酶的识别切割特性， 有修饰酶活性可分为Ⅰ 有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、III型三大类，Ⅰ类和III III型三大类， 类和III 型三大类 类限制性内切酶， 类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及 依赖ATP的限制性内切酶活性。 依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合 的限制性内切酶活性 于特定识别位点， 于特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合
5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 × 缓冲液： －硼酸， 缓冲液 mol/L EDTA, pH 8.0； ； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50 × 溴酚兰， ： 溴酚兰 的甘油； ％的甘油； 无水乙醇； 无水乙醇； 70％乙醇； 70％乙醇； 标准分子量片段； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； ； EcoR I酶解缓冲液 × buffer H)； 酶解缓冲液(10× ； 酶解缓冲液 琼脂糖； 琼脂糖； 溴化乙啶（ ）染色液(10mg/ml)。 溴化乙啶（EB）染色液 。
实验54 实验54
E.Coli 感 受 态 细 胞 的 制 备 、 质 粒 DNA的转化、 DNA的转化、提取与酶切鉴定 的转化
制作人： 制作人：刘如石
一. 实验目的和要求
1、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感 、
受态细胞和质粒DNA转化受体菌细胞的原理与技术； 受态细胞和质粒DNA转化受体菌细胞的原理与技术； DNA转化受体菌细胞的原理与技术 的特性， 2、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌 了解质粒 的特性 的方法； 细胞中分离、提取质粒DNA的方法 细胞中分离、提取质粒DNA的方法； 3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电 、掌握限制性内切酶的特性、 泳的操作方法； 泳的操作方法； 通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、 通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、DNA 转化、 转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作 用。
4、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖溶化再凝固后能形成 、琼脂糖凝胶电泳 带具有一定形状、 带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 (密度与 密度与 琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子的糖-磷 琼脂糖浓度相关 ；而生理条件下，核酸分子的糖 磷 酸骨架中磷酸基团呈离子化状态， 酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置 于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在 于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在 结构上的重复性，相同数量的双链DNA几乎具有等量 结构上的重复性，相同数量的双链 几乎具有等量 的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。 的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸 在一定的电场强度下， 分子的迁移率取决于核酸 分子本身的大小和构象。分子量较小的DNA分子，比 分子， 分子本身的大小和构象。分子量较小的 分子 分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其 分子， 分子量较大的 分子 具有较紧密的构型， 电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA 电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环 分子或线性DNA分子要快。直接用低浓度的 进行染 分子要快。 分子或线性 分子要快 直接用低浓度的EB进行染
处的DNA。 类限制性内切酶在识别位点上切割， 处的DNA。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然 后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中 类和Ⅲ 后从底物上解离下来。 基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛 类酶在分子克隆中使用广泛， 基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点 如下： 如下： (1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如 (1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列， EcoR I识别与切割序列为5`····GAATTC····3` I识别与切割序列为 ····GAATTC····3` 识别与切割序列为5` 3`····CTTAAG····5` (2) 、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别 识别的核苷酸数目大多数为4 8～13个； 13个 (3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大 (3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大 ）， 多数酶产生的是具有凸出的粘性末端： 多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：