第四章 外植体的接种和培养

第四节 外植体的褐变及其防止
褐变：是指外植体在培养过程，自身组织从表面向 培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成 褐色，外植体也随之变褐而死亡的现象。
1 褐变的原因
褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物和多 酚氧化酶有关。
通常酚类化合物和多酚氧化酶分隔存在，比较稳定。 当切割外植体后，切口附近的分隔作用破坏，酚类与多酚 氧酶接触，酚类迅速氧化成褐色的醌类物质和水， 醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与体内的蛋白质发生聚 合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致代谢紊乱，生 长停滞，最终衰老死亡。
2）环境湿度： 过低会使培养基丧失大 量水分，渗透势升高， 影响材料对营养物质的 吸收，也会阻碍外植体 的生长。 70－80%。
5 气体(必要条件)
1）培养瓶内氧气的充 足与否与封口材料有 关。
• 可用棉塞或特制的封口 塑料。
• 通气最好的是棉塞，但 棉塞易使培养基干燥， 夏季易引起污染。


5） 控制好温度

培养温度要适宜植物的正常生长发育。 如果培养室的温度过低，应采取增温措 施。

热击处理，可防治玻璃化的发生。
6） 改善培养器皿的气体交换状况 如使用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜 封口。
7） 在培养基中添加其它物质

如添加马铃薯法可降低油菜的玻璃苗的产生 频率， 0.5mg/L多效唑或10mg/L的矮壮素可减少重瓣 丝石竹试管苗玻璃化的发生；
呼吸所需的气体交换。

转床
第四章 外植体的接种和培养
第一节 外植体的接种 第二节 培养方法 第三节 培养条件 第四节 外植体的褐变及其预防措施 第五节 试管植物的玻璃化现象及其预防措施 第六节 试管植物的驯化和移栽
第三节 外植体的培养条件
培养条件包括： 光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。
玻璃苗发生的机理
乙烯的作用

培养环境中的胁迫条件，如水势不当、通 气不畅（造成缺氧）及细胞分裂素量过高 等，导致乙烯产生。 乙烯产生后引发了其他激素质和量上的改 变及酶类的变化。 影响蛋白质、纤维素和木质素的合成，叶 绿素分解黄化，逐渐形成玻璃化症状；


植物光呼吸途径和磷酸戊糖途径与玻璃苗的产生
根据培养对象采取相应合适的接种方法，具体 为： （1）种子和分生组织 （2）接种茎段 （3）接种带腋芽的茎段
（1）种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面， 而不是插到培养基内部，以免供氧不足。
正 确
错 误
（2）接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态 学上端露于空气中
正
确
错
误
（3）接种带腋芽的茎 段：将茎段平放在培
1.5 g/L～2.5g/L的聚乙稀醇也成为防治苹果砧 木玻璃化的措施。 0.3% 的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率， 对防止产生玻璃化有良好作用。



第四章 外植体的接种和培养


玻璃化苗的危害性

由于其组织畸形，吸收养料与光合器官 功能不全，分化能力大大降低，因而很
难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；

加上生根困难，很难移栽成活。
2 玻璃化的原因

玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。 产生因素：主要有激素浓度、琼脂用量、温 度、离子水平、光照时间、通风条件等。
量外溢。 原理：无机盐中的有些离子，如Mn2+、Cu2+ 是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分或辅 因子。

（3）植物生长调节物质

黑暗条件下，生长调节物质的存在会影响褐变。
细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物 的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性。
生长素类如2，4-D和IAA可延缓酚类化合物的 合成，减轻褐变现象发生。

（4）抗氧化剂

抗氧化剂可改变外植体周围氧化还原电 势，从而抑制酚类氧化，减轻褐变。

常用抗氧化剂：半胱氨酸、VC、硫代硫
酸钠等。
（5）吸附剂

活性碳和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为吸 附剂可以去除酚类氧化造成的毒害效应。 0.1%～0.5%活性炭吸附酚类氧化物。

（6）pH值

培养基的pH值较低时，可降低多酚氧化 酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。

密封瓶口、高温、高浓度细胞分裂素等因子加快了生 长速度，加剧了瓶中气体组成的改变。
1）抑制光呼吸途径，减弱了光呼吸对光合的保护作用， 过剩的同化物损坏了光合细胞器，不仅降低了光合作 用，同时也阻碍了乙醇酸的转化，加重了乙醇酸对植 物的毒害作用，从而导致玻璃化的产生。 2）磷酸戊糖途径的中间步骤与戊糖化合物代谢有关（如 核酸合成），也与木质素形成有关。

2 外植体的接种

接种：把经过表面消毒后的植物材料切 碎或分离出器官、组织、细胞，并将它 们转放到无菌培养基上的全部操作过程。
无菌操作
A接种前4h接种室灭菌
B接种前20min打开紫外灯和风机 C接种员洗手，在缓冲间换鞋、穿好实验服
D关紫外灯，开日光灯，擦双手及台面 E擦拭接种工具并反复灼烧， 烘烤培养皿 F接种完，清理台面并标识
接种器皿、用具的灭菌：用具先用95%酒精浸泡后，
于酒精灯外焰灼烧或使用消毒器消毒
灭菌关键性问题
适当的灭菌剂搭配 适当的灭菌剂浓度
注意接种操作
防止污染 分布均匀 注意对象
适当的灭菌时间
分布均匀
外植体必须与培养基紧密接触，且在培养容器内均
匀分布，以保证营养的充分利用，以及光照条件均匀一
致
正
确
错
误
注意对象
1 温度
1）25±2º C。 2）植株种类及外植体的不同， 其最适温度也是不同的。 如百合20℃；月季25-27℃； 番茄28℃。 低于15C或高于35C，对生长 都是不利的。
△
2 光照
1）光强 ★ 影响外植体细胞的增殖、组织和器官的分化。
★ 不同材料的愈伤组织诱导需光或需暗；
★ 光照强度1000lx-5000lx。

外植体插入培养基后，气体交换不畅及排泄物质积累， 影响组织吸收和造成毒害。
受光不均匀，生长不一致。

2．液体培养

分静止培养和振荡培养：
2.1 静止液体培养
优点：培养基中不出现营养物浓度差异的现象， 用来进行许多营养方面的研究工作。 静止培养不需增添专门设备，适合于某些原 生质体培养；
2.2 振荡液体培养 (1) 连续浸没
第一节 外植体的接种 第二节 培养方法 第三节 培养条件 第四节 外植体的褐变及其预防措施 第五节 试管植物的玻璃化现象及其预防措施 第六节 试管植物的驯化和移栽
第五节 试管植物的玻璃化现象及其 预防措施
1

外植体的玻璃化
指组培苗出现的一种生理失调或生理病变，叶、 嫩梢呈水晶透明或半透明、发生异常的现象。 植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲， 脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能 性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织； 体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、 纤维素和木质素含量低。
2 影响褐变的因素
2.1．植物材料 2.2．培养条件 2.3．培养基 2.4．材料转瓶周期
2.4．材料转瓶周期

对于易褐变的材料，转瓶时间长，伤口周围
积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死
亡。
间隔12～24小时培养后，再转移到新的培养 基上，连续处理7～10天后，褐变现象减轻。
第四章 外植体的接种和培养
（2）材料年龄

幼龄材料一般都有比成龄材料褐变轻的趋势。 原理：与其酚类化合物含量少有关。
（3）取材部位

分生部位醌类物质积累少；

分化部位相反。
（4）取材时期

原理：多酚氧化酶活性和酚类含量基本对应， 酶活性在生长季节增强。
（5）外植体大小及受伤害程度
2 影响褐变的因素
2.1．植物材料 2.2．培养条件 2.3．培养基 2.4．材料转瓶周期
2）培养基内氧气充足与否与培养基的 种类和培养方式有关。 ◆固体培养基可加进活性炭来增加通气 度,以利于发根。 ◆液体培养时，采取振荡培养，增加通 气性。
第四章 外植体的接种和培养
第一节 外植体的接种 第二节 培养方法 第三节 培养条件 第四节 外植体的褐变及其预防措施 第五节 试管植物的玻璃化现象及其预防措施 第六节 试管植物的驯化和移栽
2 褐变的防治
2.1 植物材料 2.2 培养条件 2.3 培养基 2.4 材料转瓶周期
2.1 植物材料
（1）基因型

不同种植物，同种植物不同类型、不同品种在 组织培养中褐变发生的频率、严重程度都存在 很大差别。
木本植物一般比草本植物容易发生褐变。 原理：木本植物木质素、单宁含量或色素含量 高。

2.2．培养条件

光照与温度

温度过高或光照过强，诱导多酚氧化 酶的活性提高，从而加速外植体的褐 变。
2.3 培养基
（1）培养基状态

液体培养基可有效克服外植体褐变。

原理：在液体培养基中，外植体溢出的 有毒物质可以很快扩散，因而对外植体 造成的伤害较轻。
（2）无机盐

培养基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大
低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻
璃化苗的比例。

大多数植物在MS培养基上生长良好，玻璃化 苗的比例较低，主要是由于MS培养基的硝态 氮、钙、锌、锰的含量较高的缘故。
4）增加自然光照，控制光照时间

玻璃苗放在自然光下几天后茎、叶变红，玻 璃化逐渐消失。这是因为自然光中的紫外线 能促进试管苗成熟，加快木质化。 光照时间不宜太长，大多数植物以8h～12h为 宜； 光照强度在1000lx～1800lx之间，就此可以 满足植物生长的要求。