PCR技术
PCR技术
PCR技术PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于扩增DNA片段的重要分子生物学技术。
通过PCR技术，可以在体外迅速扩增出特定的DNA序列，使得该技术在基因分型、基因克隆、基因重组、遗传病检测等领域得到广泛应用。
PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
首先，通过高温（通常为94-98°C）将DNA双链变性为两个单链。
然后，通过降低温度（通常为50-65°C）使引物与目标序列互补结合。
最后，通过DNA聚合酶的活性，在适当的温度条件下（通常为72°C），引物通过DNA聚合酶的催化作用将目标序列进行扩增。
PCR技术中，引物的设计起着至关重要的作用。
引物是指在DNA序列两侧能够与目标序列互补结合的寡核苷酸序列。
在PCR扩增的第一步中，引物通过与目标序列的互补性结合来引导DNA的扩增。
因此，引物的设计需要考虑以下几个因素。
首先，引物的长度应该在18-30个碱基对之间，通常为20-25个碱基对。
引物过短可能无法确保特异性扩增，引物过长可能导致目标序列的特异性降低。
其次，引物的Tm（熔解温度）应该在55-65°C之间。
熔解温度是引物与目标序列结合的温度，过低的熔解温度可能导致非特异性产物的扩增，过高的熔解温度可能导致引物无法结合目标序列。
此外，引物的GC含量也是设计引物时需要考虑的因素之一、GC含量的适宜范围通常为40-60%，过高或过低的GC含量可能导致引物的特异性降低。
最后，引物之间不能有自身互补性或引物之间的互补性。
自身互补性可能导致引物形成二聚体，而引物之间的互补性可能导致不特异性产物的扩增。
在引物设计方面，可以借助于计算机软件进行引物的全面评估。
目前常用的引物设计软件有Primer3、OligoAnalyzer等。
通过在这些软件中输入目标序列，可以获得一系列满足上述设计准则的引物。
综上所述，PCR技术是一种重要的分子生物学技术，而引物的设计是PCR技术中至关重要的一环。
pcr四个步骤
pcr四个步骤PCR（聚合酶链反应）是一种常用的生物分子扩增技术，被广泛应用于基因组学、医学诊断、犯罪调查等领域。
PCR通常包括四个关键步骤：变性、退火、延伸和终止。
下面将详细介绍PCR的四个步骤及其在实验中的应用。
第一步：变性（Denaturation）变性是PCR的第一步，其目的是将DNA双链解开，得到两条单链DNA。
这一步通常在94-98℃的高温条件下进行，高温能够破坏DNA 的氢键，使DNA解开。
变性步骤在PCR中非常重要，因为它为后续步骤提供了单链DNA 模板。
在变性后，每个DNA模板都可以与引物（引导DNA扩增的短DNA片段）结合形成PCR产物。
第二步：退火（Annealing）退火是PCR的第二个步骤，其目的是使引物与DNA模板序列特异性结合。
在退火步骤中，温度降至50-65℃左右，使引物与DNA模板的互补碱基序列相互结合。
引物是为了扩增目标DNA序列而设计的短DNA片段，通常包含20-30个碱基。
引物的互补碱基序列与目标DNA序列的两个末端相对应，使引物能够与目标DNA序列的两个末端结合。
第三步：延伸（Extension）延伸是PCR的第三个步骤，其目的是通过DNA聚合酶酶活性，在引物的引导下合成新的DNA链。
在延伸步骤中，温度通常在65-75℃之间，取决于所使用的DNA聚合酶。
DNA聚合酶是一种酶，能够识别引物与DNA模板结合的区域，并在该区域上合成新的DNA链。
延伸步骤会在每个引物结合的DNA模板区域合成新的DNA链，形成两个新的DNA双链。
第四步：终止（Termination）终止是PCR的最后一个步骤，其目的是阻止DNA链的继续合成。
在终止步骤中，温度通常在72℃左右，这是DNA聚合酶的最佳工作温度。
终止步骤中使用的方法是在PCR反应体系中加入一种特殊的终止试剂，该试剂能够在DNA合成链上添加一个无法与其他核苷酸连接的特殊核苷酸。
这样，当DNA链合成到终止试剂所添加的核苷酸时，DNA聚合酶无法进一步合成，从而终止了DNA的扩增。
PCR技术
循环次数 按变性，退火，延伸的程 序进行PCR循环，可以根据需要确定 循环次数。 循环次数决定PCR扩增程 度。PCR循环次数主要取决于模板 DNA的浓度。一般的循环次数选在 30～40次之间。如有需要，可将上次 的PCR产物稀释后，重新进行PCR循 环。
上述过程结束后，从PCR仪中取出PCR管，用微 量移液器从中取10μL ，加入Loading Buffer(12μL)，充分混匀，制成混和均匀的混合物。 六﹒ PCR扩增产物的检测分析 凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺 凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者， 后者主要用来检测小片段DNA。
（1）制胶 琼脂糖凝胶厚度要适中。过薄则加样孔样品 会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有 些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝 胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入 100ml 0.5×TBE液，微波炉加热2-5min， 使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室 温等温度下降至60℃时，加入终浓度 0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排 除气体）。
PCR仪：
冷冻离心机：
核酸电泳仪：
制冰机：
实验步骤：
一.引物设计 引物设计原则： 1. 引物与模板的序列要紧密互补 2. 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 3. 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反 应(即错配)。 使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增 出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带） ，不出 带或出带很弱，等等。
ddH2O 21μL
总计 50μL
三.将装有上述混合物的PCR管放入冷 冻离心机，1000r/m离心10s,用于混匀 反应物。 四.将管置于PCR仪中，设置反应参数： 预变性 95℃ 5min 变性 95℃ 30s
pcr知识点总结归纳
pcr知识点总结归纳PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链反应，是一种用于抑制、合成、扩增DNA的技术。
PCR技术广泛应用于科学研究、临床诊断、法医鉴定和生物工程等领域。
PCR技术的出现不仅提高了DNA的扩增速度，而且在很大程度上解决了DNA分析的难题和可行性问题。
PCR技术的关键在于DNA的扩增，通过特定的引物（primer）和热稳定的DNA聚合酶在不同温度下进行多次循环反应，使目标DNA片段扩增成百上千倍。
PCR技术的应用可以在较短时间内获得充足的DNA，为后续的实验提供了可行性基础。
PCR技术是分子生物学研究的重要工具，掌握PCR技术的原理和操作方法对于分子生物学研究者来说至关重要。
下面将对PCR技术的知识点进行总结和归纳，包括PCR的基本原理、PCR反应体系、PCR引物设计、PCR技术的优缺点以及PCR技术在生物学研究中的应用等方面。
一、PCR的基本原理PCR技术是通过DNA的酶解、DNA的引物延伸、DNA的片段合成来实现DNA扩增。
PCR主要由以下三个步骤组成：变性、退火和延伸。
1. 变性步骤：将DNA的双链解链成两条单链，即使DNA解链。
2. 退火步骤：将引物与DNA模板结合成双链，即使DNA复性。
3. 延伸步骤：在退火变性条件下将引物作为起始核酸，然后DNA聚合酶将其扩增成DNA。
通过以上三个步骤的循环反应即可实现DNA的多次扩增。
二、PCR反应体系PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、四种dNTPs、缓冲液和辅助剂等。
1. DNA模板：PCR反应的起始材料，可以是基因组DNA、cDNA或其他DNA模板。
2. 引物：在退火步骤中将与DNA模板特异性结合，为DNA的扩增提供起始核酸。
3. DNA聚合酶：用于合成DNA，PCR反应中通常采用热稳定的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。
4. dNTPs：即脱氧核苷酸三磷酸盐，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，是DNA聚合的四种脱氧核苷酸单体。
pcr技术课件
对实验数据进行统计分析，如计算Ct值、分析扩增效率等。
04
pcr技术的优化和注意事项
优化pcr反应条件
01
02
03
温度循环
优化pcr反应的变性、退 火、延伸等温度循环，以 提高扩增效率和特异性。
镁离子浓度
调整镁离子浓度，以获得 最佳的pcr扩增效果，镁 离子浓度过高或过低都可 能影响扩增效率。
02
pcr技术的基本原理
核酸的复制
核酸是生物体的遗传物质，负 责携带和传递遗传信息。
在细胞内，核酸通过复制传递 遗传信息，确保遗传信息的稳 定性和连续性。
核酸复制过程中，DNA双链解 开，以母链为模板，r技术基于核酸的复制原理， 通过特定的引物和耐高温的DNA 聚合酶，在体外实现核酸的快速
数字PCR技术具有高灵敏度和高特异性，但设备成本较高；实时PCR技术具有操作简便和 成本较低的优点，但在灵敏度和特异性方面可能略逊于数字PCR技术。
pcr与其他技术的结合
pcr技术与测序技术的结 合
通过将PCR技术和测序技术相结合，可以实 现高通量、高精度的核酸分子检测和分析， 有助于深入研究和理解基因组学和转录组学 等领域。
pcr技术的应用领域
遗传病诊断
通过检测特定基因的突变，对遗传病 进行早期诊断和产前诊断。
微生物检测
用于检测和鉴定细菌、病毒和其他微 生物，在食品安全、环境保护和疾病 控制等领域有广泛应用。
古生物学和考古学
用于分析古代生物遗骸的DNA，研 究物种进化和人类起源。
法医学
用于鉴定个体身份、亲子关系和生物 样本的来源，在犯罪调查和法庭科学 中具有重要应用价值。
扩增。
pcr反应体系中包含模板DNA、 引物、dNTPs和耐高温的DNA聚
pcr技术介绍
PCR技术介绍1、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR），是一项在短时间内采用两引物大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。
每个循环之后，模板量为原来的2倍。
它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞甚至一个分子水平。
2、PCR扩增模式图PCR反应的特点：高度特异性、高度敏感性、高丰度产量3、PCR技术原理循环次数DNA的链数121222243238102101024202201,048,576302301,073,741,82410亿一、PCR的基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成：1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、引物的延伸：DNA模板——引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
4、重复循环变性——退火——延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
（一）普通PCR系统1.PCR反应体系：DNA聚合酶DNA靶序列两端引物脱氧核苷酸dNTPs缓冲液2.DNA的合成方向：5’→3’3.Taq DNA聚合酶4.PCR循环：变性退火延伸（二）PCR循环第一步——变性（93~98℃）：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
PCR技术
Mg2+浓度
Mg2+是激活DNA polymerase的活性中心。 Mg2+对PCR的特异性和产量有显著的影响，在一 般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时，Mg2+浓度以1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩 增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使 反应产物减少。
PCR反应体系的基本成分
• • • • • • •
10×PCR Buffer MgCl2或MgSO4 dNTP Mixture (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 引物 (随机引物或特异引物) 模板DNA Taq DNA polymerase ddH2O
PCR引物设计的基本原则
合理的设计可在扩增的特异性和有效性之间找到一个平衡点。 1 引物长度通常18～30bp； 2 解链温度(Tm); Tm=4(G+C)+2(A+T) 3 GC含量以40%～60%为宜，GC太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非 特异条带；
PCR反应的基本过程
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模 板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以 便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后， 温③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如 TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板， 按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互 补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更 多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增 放大几百万倍。
pcr的原理和应用领域
PCR的原理和应用领域1. PCR的原理PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术。
它是由美国生物学家凯瑟琳·梅利斯（Kary B. Mullis）在1983年发明的，因其在分子生物学领域的重要应用而获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR的原理主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1.1 变性（Denaturation）将待扩增的DNA样品加热至94-98℃，使双链DNA解开成两条单链DNA。
这一步是为了使DNA分子的双链结构完全解链，以便后续的退火步骤。
1.2 退火（Annealing）将待扩增的DNA样品降温至50-65℃，加入引物（寻找特定靶序列的DNA寡核苷酸链），使引物与单链DNA序列互补配对结合。
这一步是为了使引物与待扩增的DNA序列特异性地结合，以启动PCR反应。
1.3 延伸（Extension）将待扩增的DNA样品在72℃下加入DNA聚合酶（如Taq聚合酶），使DNA引物双链结构被DNA聚合酶复制成两条新的DNA双链。
这一步是为了合成新的DNA链，使扩增物数量呈指数倍增。
经过多个循环的变性、退火和延伸步骤，可以在短时间内扩增出大量特定目标序列的DNA片段。
2. PCR的应用领域PCR技术具有高效、灵敏、特异性强等优点，因此在许多领域得到了广泛应用。
2.1 分子生物学研究PCR技术在分子生物学研究中扮演着重要角色，广泛应用于：•基因克隆和表达研究：PCR可以扩增特定基因片段，用于克隆和构建重组DNA。
可以通过PCR检测基因在不同组织和细胞类型中的表达水平，研究基因的功能和调控机制。
•突变检测和基因诊断：PCR可以检测基因突变，用于遗传病的诊断和预测。
例如，PCR可以用于检测致病基因的特定突变，如BRCA1和BRCA2基因突变与乳腺癌的关联。
•DNA指纹和个体识别：PCR可以扩增DNA中的特定序列，用于DNA指纹分析和个体识别。
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电泳分析
找出多态性
RAPD
模板
(Random Amplified Polymorphism DNA)
PCR
Random primer:10bp
Gel
simple economy rapid
材 料 与 试 剂:
本实验采用的大豆不育系和保持系是严格的同 核异质材料 不育系（JLCMS1-1、1-2、1-3 A）
温度对引物和模板 的杂交有重要影响
Priming occurs only at the desired target sites
计 算 一 条 引 物 的 Tm:
Tm = 4(G+C ) + 2( A+T )
* This is not suitable for long primers (eg. 30bp)
Specific primer (专一或特异）
根据序列性质分：
Degenerate primer（兼并） Random primer(随机)
Primer length
引物长度对 PCR的特异 性很关键
48=65536bp
417=17179869184bp
The result of PCRs well-designed and poorly-designed primers
5 cycle = 32 Amplicon
4 5
6 cycle = 64 Amplicon
6 20
7 cycle = 128 Amplicon
30
产物的可视化:
Visualization of the product
PCR product
DNA markers
Agarose gel
PCR 反应: ● 反应缓冲液(×10) ● Template(模板) ● Primers(引物) ● DNA polymerase
No. of
1 cycle = 2 Amplicon
No. Amplicon Copies of Target
2 cycle = 4 Amplicon
Cycles
3 cycle = 8 Amplicon
1
2 3
2
4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
4 cycle = 16 Amplicon
Oligo使用指南
Primer Premier使用指南
人类α 1-球蛋白基因
A pair of primers
2、反应温度：
Working out the correct temperature to use
变 性 (1min)
延 伸 (2min)
退 火 (1min)
(a) Annealing temperature is too high
2 基本过程
TaqDNA聚合酶
模板DNA
dNTP
引物 Buffer
预变性
94oC 5min
模板DNA
dNTP 引物
Buffer
PCR技术的基本过程(1)
后延伸
72 ℃ 5～7 min
Taq 酶
模板DNA
dNTP 引物 Buffer
循 环 仪
94℃ 55 ℃
Taq 酶 模板DNA
72 ℃
dNTP
引物
三、 PCR技术程序及影响因素
作为一种酶促反应，引物、模板、温度、酶、 Mg2+浓度
等因素都影响着PCR反应的结果和准确性，需要我们认真地了 解和掌握。
（一）PCR技术程序
1 PCR反应体系
总体积 50-100 l
Buffer dNTP Primer DNA分子 Taq酶 Mg2+
缓冲液 原料 引物 模板 DNA聚合酶 必需的金属离子
何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错 配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。
5、 模板(靶基因)
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。
一般100μl的反应体积50-100ng的模板DNA量就足够了。
模板浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过 低会则会导致反应产物减少。
板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～35次之间，循
环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
第二节 PCR技术在分子标记中的应用
一、 随机扩增多态性DNA(RAPD)
二、 扩增片段长度多态性(AFLP)
三、 简单序列重复(SSR)标记
（一）RAPD标记的原理
RAPD是以PCR技术为基础，利用人工合成的短核苷酸(通常为 10个碱基)作为引物，以被研究基因组DNA为模板进行PCR扩
伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因”。
2.PCR的实现
美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应
1985年发明
1989年获专利
1993年获Nobel化学奖
Kary B. Mullis（1944－）
Primers and templates remain dissociated
(b) Annealing temperature is too low
温度对引物和模板 的杂交有重要影响
Mismatched -Not all the correct Base pairs have formed
(c) Correct annealing temperature
扩增量达230个拷贝（109拷贝）。
2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定
PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异 性；同时尽可能减少非特异性扩增。
3）操作简便易行：PCR扩增法,只需要数小时,就可以用
电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。
6、3’-end 碱基： T is best, A is worst。
引物设计的方法：
1、引物序列与对应的模板链应该是互补的。 2、上游引物为DNA 5′— 3′链上从5′端开始的正常序列。
3、下游引物为DNA 5′— 3′链上从5′端开始的反向互补序 列。 4、引物的书写方式应按 5′-3′方向进行。
（四）RAPD技术在 农业上的应用 1．利用RAPD对物 种基因组进行遗传 分析
兔子
兔子
松鼠
两个物种的个体之间， 亲缘关系越接近，其 相应的PCR扩增带型 也就越相似，反之则 差异也就越悬殊。
松鼠并不是具有大 尾巴的兔子
应用RAPD分析检测兔子与松鼠的亲 缘关系
2、利用RAPD进行基因定位
（1）近等位基因系的基因定位 （2）集群分离分析法(BSA)的基因定位 3、利用RAPD进行作图 4、RAPD标记在育种中的利用 植物育种中分子标记辅助选择是通过分析与目标基因紧密连锁 的分子标记的基因型来判断目标基因是否存在，在早期进行选 择，从而大大缩短育种周期。
保持系（JLCMS1-1、1-2、1-3 B）
RAPD随机引物选用OPERON公司的10bp的寡聚核苷
酸的随机引物OPA-OPT 20组共计400个。其它试剂购自
鼎国生物工程公司，均为分析纯以上。
方 法:
大豆mtDNA的提取 裂解时
DNase I β-巯基乙醇至终 浓度为5% 终浓度为50μ g/ml 蛋白酶K至终浓度 作用时间为1小时 为200μg/ml SDS至终浓度为2% 37℃反应2h 于冰水浴中冷却
（ 三 ） RAPD 标记的分子基 础
模板DNA扩增区段 上引物结合的碱基序 列发生了突变，因此 不同来源的基因组在 该区段（座位）上将 表现为扩增产物有无 的差异或扩增片段大 小的差异。其中第一 种现象较为常见，因 此RAPD标记通常是 显性的，但有时也会 表现出共显性，即扩 增片段大小的差异。
3.PCR的改进与完善
94℃
55℃
37℃
DNA聚合酶
PCR循环
94℃
55℃
72℃
PCR循环
普通梯度PCR仪
聚合酶链反应（PCR）仪
二、PCR技术的原理
聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）的原理类似于DNA的天 然复制过程，在待扩增DNA片段的两侧与 其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变 性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n倍。
Target Sequence
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使
模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，
以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 “高温下的变性”
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，
Denaturation(变性)
94℃, 30″
Annealing(退火或复性)
40~60 ℃, 1 ′
● dNTPs
● MgCl2
Cycling(循环) 30~35 cycles
Extension(延伸或合成)
72 ℃, 1~3′
PCR技术的特点
1）高度的灵敏性:PCR产物每轮循环增加一倍30轮循环
Tm = 4( 7G+8C) + 2(7A+8T)
3、 酶及其浓度
催化一典型的PCR反应约需酶量2-2.5U(指总反应体积为 100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则
合成产物量减少。
4、 dNTP的质量与浓度
在PCR反应中，dNTP（pH7.0）应为50～200umol/L，尤
其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任