crispr-cas9基因敲除
cas9基因敲除位点
cas9基因敲除位点
Cas9基因敲除位点是指在基因组中选择合适的位置，通过使用CRISPR-Cas9系统来实现基因敲除。
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，可以精确地修改基因组中的特定位点。
要选择合适的Cas9基因敲除位点，需要考虑以下几个方面：
1. 目标基因的功能：确定需要敲除的目标基因的功能和作用，确保敲除该基因对研究或应用的影响。
2. 位点选择：选择一个适合的Cas9敲除位点，通常选择位于目标基因编码区域内的外显子区域，以确保有效敲除目标基因。
3. 效率和特异性：选择能够高效且特异性地敲除目标基因的Cas9位点，避免对其他非目标基因的无意义敲除。
4. 引物设计：设计引物用于引导Cas9与目标位点结合，通常需要选择20个核苷酸序列用于引导RNA的合成。
5. 评估和验证：通过实验验证Cas9基因敲除位点的敲除效果，并进行相应的分析和鉴定。
总之，在选择Cas9基因敲除位点时，需要综合考虑目标基因的功能、位点选择、效率和特异性、引物设计以及实验验证等因素，确保高效和准确地实现基因敲除。
基因编辑细胞实验，看这篇就够了！
基因编辑细胞实验，看这篇就够了！相信在科研上默默努力的小伙伴一定听过或被安利过CRISPR-Cas9基因编辑技术，小编在初次了解到这个技术时，感觉它太强大了！特别是在基因功能研究中，常常会用到CRISPR-Cas9技术，例如构建基因敲除、基因定点突变和基因敲入的细胞等，方便和高效的标签已经牢牢贴在它的身上。
今天带大家一起回顾CRISPR-Cas9在细胞实验上的帮助吧！1.基因敲除基因敲除（Knock out，KO）是基因功能研究中的“减法”套路，也就是基因功能缺失的研究思路，当目的基因被敲除，基因功能丧失后，所出现的细胞表型变化我们便认为与该基因相关。
同时，这个“减法”套路可以用RNAi技术在转录水平上实现，但RNAi技术的调控原理是靶向mRNA，与CRISPR-Cas9技术的KO在效果上存在差异。
那么，下面给大家回顾一下整个敲除实验的流程和注意细节！首先，使用CRISPR-Cas9进行敲除基因有两种策略——移码敲除和片段敲除。
两种策略各有优缺点，需根据敲除细胞的类型和目的基因信息来综合选择。
设计合理有效的sgRNA是我们最终成功实现基因编辑的重要前提。
这里需要注意的是要尽可能选择切割效率高效和特异性好的sgRNA，避免影响其他基因和脱靶等情况。
获取sgRNA后，我们需要将其和Cas9转导到细胞内，常用的方法有RNP法、质粒法和慢病毒法。
三种方法都各具特点，RNP法简便、快捷和敲除效率较好；慢病毒法的敲除效率高，但存在影响其它基因和脱靶的风险；质粒法方便、简易，但效率较低。
编辑过后的混合细胞池存在各种细胞类型，可通过稀释等方法获得单克隆细胞，然后再通过PCR和测序鉴定基因型，筛选目标基因型的单克隆。
如果使用片段敲除的策略（敲除200bp以上），可通过PCR扩增敲除片段附近的区域，通过比较与野生型的电泳结果，能直观地知道敲除结果。
当然也需要对扩增的PCR产物进行测序，进一步明确基因型。
如果是移码突变策略，则需要扩增靶区域进行测序，明确基因型。
大肠杆菌CRISPR-Cas9系统基因敲除简介
1CRISPR-Cas系统的研究进展CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，即串联的、间隔的短回文重复序列，最早在1987年研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时被发现[1]。
随后在细菌和古细菌的基因组中也发现大量存在CRISPR，研究证实它能够保护自身抵御外来病毒和质粒的入侵[2]，作用机制是依靠crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)结合并引导Cas蛋白对外源DNA进行特异性降解[3]。
已发现的CRISPR-Cas系统有三种类型：Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型，其中以Ⅱ型最为简单，只需一种Cas蛋白，即通过RNA 介导核心蛋白Cas9识别并切割靶序列，引起DNA双链断裂[2]。
受自然界中CRISPR-Cas系统的启发，主要对来自于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Ⅱ型CRISPR-Cas系统进行人为改造和利用，目前已经将其发展成为一种新型的基因编辑技术，实现基因敲除、插入、定点突变和组合编辑[4]，并成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、家蚕、果蝇和人类细胞等[5]。
和传统的基因编辑技术相比，这一新技术具有成本低、操作简便、效率高的优点[6]。
2 CRISPR-Cas系统的组成与机制典型的Ⅱ型CRISPR-Cas系统基因座包含tracrRNA基因、Cas蛋白编码基因(cas9、cas1、cas2和csn2)、CRISPR基因座（引导序列、间隔序列和重复序列）这三个部分[6]。
Ⅱ型CRISPR-Cas系统的作用机制可分为三个阶段，第一是高度可变间隔序列的获得（图1），第二是CRISPR-Cas系统基因座的表达，第三是对外源遗传物质的降解[6]（图2）。
Cas1、Cas2和Csn2蛋白与新间隔序列的获得相关。
与间隔序列同源的外源遗传物质上的原间隔序列(protospacer)，其下游存在一段保守序列，被称为PAM(protospacer adjacent motifs)[7]。
Biomics_CRISPR_Cas9_基因敲除技术
CRISPR/Cas9 基因敲除技术CRISPR （ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）RNA，是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，用以抵御病毒和质粒入侵。
在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。
CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。
多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。
Biomics专注于RNA基因调控多年，最新推出基因组编辑工具CRISPR/Cas9专家系统，该系统灵活简单、可以对特定基因组位点进行切割置换，特异性高、细胞毒性低。
CRISPR/Cas9系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。
CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。
其最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点，起到多靶点调控的作用。
z CRISPR与RNAi的区别目前已经广泛应用的RNAi技术的靶标是mRNA，而CRISPR通过RNA识别DNA序列然后再改变DNA序列，是可以遗传的。
由于编码mRNA的DNA序列只占总DNA的极少部分，因此靶向DNA序列的CRISPR的靶标要比RNAi广得多，更有可能筛选出针对某DNA序列的特异CRISPR靶标。
基于CRISPRCas9技术的基因敲入敲除策略
基于CRISPRCas9技术的基因敲入敲除策略一、本文概述随着生物科技的飞速发展，基因编辑技术已成为现代生物医学研究的重要工具。
其中，CRISPR-Cas9技术以其高效、精确的特性，在基因敲入敲除策略中展现出了巨大的潜力。
本文旨在全面介绍基于CRISPR-Cas9技术的基因敲入敲除策略，包括其原理、应用、优缺点以及未来的发展趋势。
通过对这一技术的深入剖析，我们期望为科研人员提供一个清晰、全面的视角，以更好地理解和应用CRISPR-Cas9技术，推动生物医学领域的研究进展。
二、CRISPR-Cas9技术的基本原理CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）技术是一种强大的基因编辑工具，它源自细菌的自然防御机制，即CRISPR系统。
这一系统允许细菌存储并记忆过去遭遇过的病毒DNA片段，以便在未来遇到相同病毒时，能够识别并切割这些病毒DNA，从而抵抗病毒感染。
CRISPR-Cas9系统通过这一机制被改造为一种精确的基因编辑工具，用于在真核细胞（如人类细胞）中进行基因敲除和敲入操作。
CRISPR-Cas9技术的基本原理可以分为三个主要步骤：目标识别、DNA切割和修复。
一个由RNA和Cas9蛋白组成的复合物被设计用来识别特定的DNA序列。
这个RNA分子，通常被称为单链导向RNA（sgRNA），能够与Cas9蛋白结合，并指导Cas9蛋白在目标DNA序列上定位。
sgRNA的设计是关键，它必须能够准确地与目标DNA序列配对，以确保Cas9蛋白能够在正确的位置进行切割。
一旦Cas9蛋白在目标DNA序列上定位，它就会切割DNA双链，产生一个双链断裂（DSB）。
细胞对DSB的修复机制有两种主要方式：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。
NHEJ是一种错误易发的修复方式，它通常会导致DNA序列的插入、删除或替换，从而导致基因功能的丧失，这种机制常被用于基因敲除。
CRISPR Cas9基因敲除技术的原理简介
CRISPR Cas9基因敲除技术的原理简介CRISPR/Cas9 基因敲除原理介绍
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic re peats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。
在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。
Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。
Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。
CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。
融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。
通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。
图示：Cas9通过向导RNA结合到目标DNA上并进行切割。
CRISPR-Cas9精细原理：基因敲除、点突变、基因插入
1.2CRISPR-Cas系统的结构 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列
R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排 列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因cas。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它 与folk酶功能类似，但是它并不需要形 成二聚体才能发挥作用。
真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子 ＶＰ16结合获得。
3、CRISPR-Cas9技术的优势与前景
3.1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因 为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要 替换20个核苷酸就行。
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不 具特异性。
编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单 方便。
较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来 的并发症。
CRISPR-Cas9大PR-Cas系统简介
1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史
1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间 隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年， 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列
2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活
CRISPR／Cas9系统用于转录抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ ＤＮＡ配对
利用crＲＮＡ介导dCas9能够精确识别靶基因的特点，将ｄCas蛋白与 具有转录激活的蛋白质功能域融合则可构建具有转录激活活性的 CRISPR－on系统。
手把手教你利用CRISPR-Cas9系统精准敲除靶标基因
⼿把⼿教你利⽤CRISPR-Cas9系统精准敲除靶标基因科研⼩助⼿轻松科研 | 趣读⽂献 | 前沿资讯 | 实⽤技巧特别鸣谢本⽂由群友Ryan提供！欢迎⼊群交流！⼀CRISPR-Cas系统简介图1 CRISPR-Cas9系统介绍CRISPR-Cas9 系统是⼀种被⼴泛运⽤的基因组编辑⼯具，它来源于细菌的适应性免疫系统。
CRISPR-Cas9系统包括：Cas9酶和⼀个向导RNA。
向导RNA作⽤是引导cas9 到基因组的特异性位点上切割。
如图1所⽰。
⽬前为⽌，CRISPR-Cas9 系统主要有两⽅⾯应⽤: 基因敲除和基因敲⼊。
基因敲除时, ⼀旦DNA的双链断裂反应（DSB）被Cas9切割诱导发⽣, 细胞会启动 NHEJ DNA修复⽅式，这会造成DNA的删除和插⼊。
对于基因敲⼊，加⼊⼀个可同源重组的DNA⽚段, 细胞会将这个⼀段DNA⽚段插⼊进基因组。
⼆两次切割介导的基因敲除与先前的敲除策略并不⼀样，我们改进的这个操作系统可以将基因的删除做到可控的特定长度。
我们正在基因组的⼀个特定的区域两边各引⼊⼀个向导性RNA。
这两个向导性RNA指引Cas9酶在这两个位点进⾏切割。
然后切割后末端通过 NHEJ连接上。
通过这个策略，我们可以将⼀个基因的独⽴外显⼦或者整个基因敲除掉。
如图2所⽰。
图2 Cas9-2hitKO系统三Cas9-2hitKO系统中涉及到的载体为了达到⾼效的敲除效率，我们在同⼀个载体重引⼊cas9 酶和两个向导性RNA。
整个系统包括3个载体： PX458M ，PX459M和EZ-GuideXH。
PX458M ，PX459M 除了含有Cas9和⼀个向导性RNA插⼊位点，还引⼊第⼆个向导性RNA插⼊位点。
EZ-GuideXH是为插⼊第⼆个向导性RNA的辅助性载体。
PX458M 带有 EGFP 荧光标记; PX459M带有 puromycin 抗性筛选标记。
图3 PX458M图谱图4 PX459M图谱图5 EZ-GuideXH图谱PX458M和PX459M 载体是从张峰实验室 PX458 and PX459 载体改造过来的。
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CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。
CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA 的片段整合到CRISPR 中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。
原理
此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。
而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。
作为一种RNA 导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。
将蛋白与无核酸酶的Cas9（Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA ，可靶定任何dsDNA 序列，而sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9 的结合。
因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
应用
基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。
但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。
即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。
2013 年1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。
该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。
通过一系列研究，首先证明了通过RNA 注射的方式将CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。
在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。
此外，还证明了利用CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关G 蛋白偶联受体Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。
该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。
CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。
技术优缺点
CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。
科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。
Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。
他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。
在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。
与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。
但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。
传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。
核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。