抗体筛选新方法
噬菌体展示筛选抗体技术介绍
探索生物医学中的创新应用
目录
01 噬菌体展示筛选抗 体概述
06 噬菌体展示抗体的 发展前景
02 噬菌体展示技术原 理
03 噬菌体展示抗体筛 选流程
0Hale Waihona Puke 噬菌体展示抗体的 应用案例05 噬菌体展示抗体的 优点与缺点
01 噬菌体展示筛选抗体 概述
噬菌体展示筛选抗体概述
1 噬菌体展示筛选抗体技术介绍
疗效果并降低副作用。
05 噬菌体展示抗体的优 点与缺点
噬菌体展示抗体的优点与缺点
噬菌体展示抗体的优 势
噬菌体展示技术能够快速、 高效地筛选出特异性抗体， 大大缩短了实验周期，提高 了研究效率。
噬菌体展示抗体的局 限性
噬菌体展示技术虽然筛选速 度快，但存在假阳性率高的 问题，需要进一步的验证和 优化。
噬菌体展示筛选抗体技术是一种利用噬菌体表面
噬菌体展示筛选抗体的优势 2 展示特定蛋白质，通过生物淘选方法寻找与目标
噬菌体展示筛选抗体技术具有高度灵活性和多样
抗原特异性结合的抗体的方法。
性，能够快速、高效地筛选到具有高亲和力和特
异性的抗体，为免疫学研究和药物开发提供了重
要工具。 3 噬菌体展示筛选抗体的应用前景
噬菌体展示抗体的优 势
噬菌体展示技术具有高度灵 活性和多样性，可以快速、 大量地筛选出特异性强、亲 和力高的抗体，为生物医学 研究和药物开发提供了重要 工具。
噬菌体展示抗体的应 用前景
噬菌体展示抗体技术在肿瘤 治疗、免疫诊断、疫苗研发 等领域具有广泛应用前景， 有望为人类健康事业做出重 要贡献。
谢谢大家
噬菌体展示筛选抗体技术在疾病诊断、治疗和预
防等方面具有广泛的应用前景，包括癌症治疗、
血库输血科抗体筛选试验 (凝聚胺法)
测试（2）：加入被检血清2滴，再加入3-5%筛选红细胞（2）1滴。
ＸＸＸＸ医院
血库
文件编号：
ABCD-SOP-09
抗体筛选试验（凝聚胺法）
版序：abcd
页码：第2页，共2页
2．各加入*1低离子介质溶液0.6ml，轻轻混匀，于室温下静置1分钟。
5．如果不凝集，可能是标本中含有肝素。如洗肾病人的标本或其他干扰存在，此时需多加2-4滴*2凝聚胺溶液以中和肝素或干扰因子。
6．注意离心速度必须达到要求。若离心后，无凝集时，应排除标本是否含有高浓度肝素或干扰因子，检查离心速度是否足够后，重新检测。重做后仍然没有凝集现象出现，可能为试剂失效，更换试剂后重测。
[试剂组成]
1．筛检红细胞
2．凝聚胺试剂：
*1低离子介质溶液：含葡萄糖，乙二胺四醋酸-2钠及稳定剂。
*2凝聚胺溶液：含凝聚胺，氯化钠及稳定剂。
*3复悬液：含柠檬酸钠，葡萄糖及稳定剂。
*4阳性对照血清：含抗D血清，氯化钠及稳定剂。
[试剂保存和稳定性]
1．筛检红细胞，凝聚胺试剂须保存在2-8℃。
2．有效期内可使用。
3．再滴入2滴*2凝聚胺溶液，轻轻混匀，于室温下静置15秒。
4．3400rpm离心1分钟，然后把上清液倒掉，管底保留大约0.1ml的液体。
5．目测红细胞有无变成凝块，如果没有凝块，则必须重做，（请看注意事项5）。重做后仍然没有凝集现象出现，可能试剂失效。
6．各滴入2滴*3复悬液，并轻轻混匀，观察结果。若为凝聚胺引起的非免疫性凝集，应该在1分钟内散开抗体筛选结果为阴性；若是异体抗体所引起的免疫性凝集，则不会散开，抗体筛选结果为阳性，应进一步做抗体鉴定。
抗体设计优化方法完善
抗体设计优化方法完善概述：随着生物技术的发展和对新型疾病治疗的需求增加，抗体设计优化方法成为当前热点研究领域之一。
抗体具有高度特异性和亲和性，因此被广泛应用于治疗、诊断和药物研发领域。
然而，传统的抗体设计方法存在一些限制和挑战，需要不断进行优化和改进。
一、抗体设计的优化方法1. 构建抗体库抗体库是一种包含大量不同抗体序列的资源库。
通过构建抗体库，可以筛选出具有理想功能和性能的抗体。
目前，常见的抗体库包括人源化抗体库、小鼠（或其他动物）源性抗体库等。
构建抗体库可以通过多种技术实现，如脾细胞、B细胞或抗体合成。
2. 序列优化在抗体设计中，通过对抗体序列进行优化，可以增强其抗原亲和力和稳定性。
序列优化包括两个方面：一方面是改变抗体的重链和轻链的可变区序列，以提高其亲和力和特异性；另一方面是改变抗体的框架区序列，以提高其稳定性和生产效率。
3. 合成生物学方法合成生物学是一种利用工程化的方法来设计和构建生物系统的学科。
在抗体设计中，合成生物学方法可以用来合成人工抗体、创造具有特定功能的抗体，或者在特定位点上进行修饰。
合成生物学方法的主要优势在于它可以通过对抗体的基因进行修饰，从而使其具有特定的特性。
4. 体外进化体外进化技术是一种通过人工模拟自然进化过程来筛选出具有理想特性的抗体的方法。
它通过构建抗体库，利用高通量筛选技术来筛选出具有理想结合特性的抗体。
通过不断地进行迭代和演化，可以获得更高亲和力和特异性的抗体。
二、抗体设计优化方法的局限性和挑战1. 抗体多样性由于人体内有数百万个B细胞，每一个B细胞的抗体都是独一无二的，因此抗体的多样性非常庞大。
当前的抗体设计优化方法尚未能够完全覆盖所有可能的抗体序列和变异类型，因此仍然存在一定的限制。
2. 抗体稳定性抗体在体内外环境中容易受到蛋白酶的降解，这限制了抗体的应用。
目前的抗体设计优化方法尚未解决抗体稳定性的挑战，需要进一步研究和改进。
3. 高通量筛选技术虽然高通量筛选技术是抗体设计优化的重要手段之一，但其仍然面临一些挑战。
抗体生产与处理技术的新方法与进展
抗体生产与处理技术的新方法与进展随着科学技术的不断进步，抗体生产与处理技术也在不断发展，新的方法和进展不断涌现。
抗体是免疫反应中最为重要的组成部分，具有精确识别、选择性结合、高度特异性和高亲和力等特点。
在药物研发和治疗方面，抗体已经成为一种重要的策略。
本文将介绍抗体生产与处理技术的新方法和进展，主要包括单克隆抗体人源化、晶体管上的抗体表达技术、抗体工程技术以及高通量抗体生产与筛选技术等方面。
一、单克隆抗体人源化单克隆抗体是目前制备和应用最为广泛的抗体类型之一，具有高度特异性和选择性。
但是，药物研发中使用的大多数抗体是来自小鼠、兔子等哺乳动物的抗体，存在免疫原性问题，同时还可能引起严重的副作用。
因此，单克隆抗体的人源化已成为当前研究的重点。
目前实现单克隆抗体人源化的方法主要包括三种：人-小鼠杂交抗体（chimeric antibody）、人化抗体（humanized antibody）和全人源抗体（fully human antibody）。
其中，最新的技术是通过人工DNA合成技术合成全人源抗体，例如Human CombinatorialAntibody Library（HuCAL）技术。
这种技术是利用人工合成的基因片段，构建全人源单克隆抗体，通过大规模筛选和优化，使其具有较高的特异性、亲和力和稳定性，同时减少免疫原性和副作用的风险。
二、晶体管上的抗体表达技术晶体管上的抗体表达技术（surface expression）是一种新型的抗体生产技术，利用高通量筛选技术，从大规模的克隆群体中筛选出具有较高表达水平和较高性能的抗体。
这种技术可以大幅提高抗体表达的效率和速度，同时避免了传统的转染、克隆、扩增等步骤。
在晶体管上的抗体表达技术中，抗体接替了细胞表面上的蛋白质，然后通过选择性筛选，在群体中筛选出表达最强的克隆。
与传统的抗体生产技术相比，这种技术不需要进行大规模的细胞培养，并且可以利用已有的细胞群体进行后续的筛选和优化。
抗体库筛选技术介绍
抗体库筛选技术介绍导读自从噬菌体展示技术于1985年创立以来,细胞生物学、免疫学、蛋白质工程以及医药行业等领域深受影响。
它从根本上了改变了传统的单抗制备流程(杂交瘤技间接术)，宣告在体外改良抗体的特异性以及进行亲和力成熟。
随着该技术的不断发展,继而出现了核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等多种展示技术.这篇文章主要以噬菌体展示抗体库为例，来介绍抗体库的筛选技术。
抗体库的筛选是指从抗体库中筛选出针对某一抗原的特异性抗体，是获得高亲和力抗体过程中的关键环节。
那什么是抗体库呢？通过PCR和DNA重组技术克隆人类或者动物体内全套抗体可变区基因（关于抗体的具体结构详见抗体的基本结构），并通过展示技术进行表达，得到的全套抗体基因表达文库即为抗体库.图1、抗体库克隆的抗体基因片段（SCFV）图2、噬菌体展示抗体库构建流程由于单抗性质的千差万别，抗体库的筛选需要根据不同的单抗制定严格的筛选条件，优化筛选方法，因此抗体库的筛选技术一直处于发展和改进的状态,根据出现时间的先后,主要分为经典筛选法和新型筛选法。
1、经典筛选法经典筛选法主要包括固相筛选法和液相筛选法，适合针对性质明确并且可纯化的抗原进行抗体筛选。
固相筛选法是通过包被在酶标板或者免疫试管等固相介质上的抗原富集高亲和性的噬菌体；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上，通过磁珠富集能与抗原特异性结合的噬菌体抗体，再通过洗涤、洗脱、回收等步骤。
如此反复筛选数次,可得到高亲和性的噬菌体.这两种方法可通过添加脱脂牛奶或者BSA来减少非特异性结合.2、新型筛选法对于抗原无法提纯或者性质不明确的情况（如癌细胞表面受体），或者经典筛选过程可能造成抗原失活的情况,需要开发新的筛选方法。
目前的新型筛选法主要有细胞筛选法、组织切片或体内筛选法、选择感染筛选法和蛋白质芯片筛选法等。
细胞筛选法:细胞筛选能维持抗原和抗体的天然构象，因此在对肿瘤细胞筛选方面应用较多，该技术还适合于细胞表面受体筛选和抗原鉴定等。
009选择HIV抗体的筛选方法
4、试剂必须贮存在适宜的条 件下，以保证其被正确使用和结果 的可靠。
5、应用新鲜的、完全凝结的 并正确贮存的标本。 6、如果得不到室间质评品， 可以用各个批号不同浓度室内质控 品代替。
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7、无论时间多么有限，必须
在输血前进行HIV抗体的筛选试验，
当时间紧迫时，最适宜的方法是特
异性快速法。
8、筛选方法的开支由许多因
8
强调：无论报导某种筛检方 法的特异性和敏感度如何的 好，它的最终结果还是靠操 作者的熟练操作。
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二、选择试验的种类时要 考虑的因素
1、第一步是在本地或本国找到一种 有售的、适宜的检测试剂。如HIV-1+2 型。 2、灵敏度、特异性。 3、献血员的数量。 4、试剂价格、供应情况。 5、所需的仪器、设备、水、电等。
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EIA 方法的名称 厂 商 样品类别 样品的稀释 最初的孵育时间 孵育温度
颗粒凝集试验
特异性快速法
最初的洗涤步骤
联结剂的组成
联结剂的孵育时间
第二次洗涤步骤 底 物 底物孵育时间
读取结果方式方法
需要的特殊仪器
费
用
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三、影响筛检工作的因素
1、人员培训，内容包括 1）培训实验操作 谁提供培训及培训工作的负责人 培训类别 培训时间 受训者的技能考试情况 培训是否定期进行 2）培训正确记录结果
C 假阴性 a+c
b 假阳性
d 真阴性 b+d
a+b
+d
合计
1
3
4
合计
5
5
10
6
灵敏度= = 特异性= =
×100% 真阳性数+假阴性数
几种常用的抗体检测方法
几种常用的抗体检测方法(1)免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。
由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
A、器材和试剂a. 包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。
Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml 混合，加蒸馏水至1000ml。
b. 洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4&S226;12H2O 2.9g，NaCl8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。
c. 稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。
d. 酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。
e. 底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L 柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。
柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。
f. 底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 0.15ml。
TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。
g. 抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。
抗体检测方法
抗体检测方法抗体检测是一种常见的实验室技术，用于检测人体内特定抗体的存在和水平。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质，可以识别和中和病原体，是人体抵抗疾病的重要组成部分。
在临床诊断和疾病监测中，抗体检测方法被广泛应用。
一、ELISA法。
ELISA法（酶联免疫吸附实验）是一种常用的抗体检测方法。
它利用固相酶标记的抗原或抗体与待测样品中的抗体结合，再通过酶底物的反应产生可测量的信号。
ELISA法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，广泛应用于临床诊断和生物医学研究中。
二、免疫荧光法。
免疫荧光法是一种利用荧光染料标记的抗体来检测待测样品中特定抗体的方法。
在免疫荧光显微镜下观察，可以通过荧光信号来判断抗体的存在和分布情况。
免疫荧光法具有高灵敏度、高特异性和定量性好的特点，被广泛应用于自身免疫性疾病、传染病和肿瘤等领域。
三、免疫印迹法。
免疫印迹法（Western blot）是一种检测蛋白质的方法，也可以用于检测特定抗体的存在。
通过将待测样品中的蛋白质经过电泳分离，然后转移到膜上，再与特异性抗体结合并通过化学发光或染色来检测特定抗体的存在。
免疫印迹法具有高灵敏度和高特异性，被广泛应用于蛋白质相互作用、疾病诊断和药物研发等领域。
四、流式细胞术。
流式细胞术是一种高通量的细胞分析技术，也可以用于检测细胞表面的特定抗体。
通过将待测细胞与荧光标记的抗体结合，然后通过流式细胞仪进行检测和分析。
流式细胞术具有高灵敏度、多参数分析和高通量的特点，被广泛应用于免疫学研究、临床诊断和药物筛选等领域。
五、PCR法。
PCR法（聚合酶链式反应）是一种检测DNA或RNA的方法，也可以用于检测病原体引起的抗体。
通过特异性引物和酶的作用，可以扩增和检测待测样品中的特定基因序列。
PCR法具有高灵敏度、高特异性和快速的特点，被广泛应用于传染病和遗传病的诊断、病原体检测和基因表达分析等领域。
六、蛋白质芯片技术。
蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质分析技术，也可以用于检测特定抗体。
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抗体筛选新方法
肿瘤、炎症、自身免疫性疾病(如:红斑狼疮、类风关、克隆氏病、多发性硬化)、神经退行性疾病、传染疾病等多种疾病中,患者体内都会产生与累积大量的自身抗体,有些自身抗体在特定疾病的早期,甚至就是疾病的可视化症状出现之前就已经出现(图1),这为疾病的早期诊断提供了可靠地生物标志物;而有些自身抗体则就是机体抵抗疾病侵袭的自身保护性抗体,这则为疾病的治疗提供了新的思路,正如全球知名的制药巨头提供的数据显示,大型制药公司利润的60%已经来自属于抗体的药物(图2)。
图1、自身抗体往往出现在疾病的可视化症状之前
图2、大型制药公司60%的利润已经来自抗体类药物
那么,如何发现这些潜在的自身抗体呢？。
目前,最适合筛选自身抗体的方法为蛋白质芯片法,一张蛋白芯片往往有成千上万种蛋白质点,可以一次性筛选一个样本中可以与这些蛋白质相互作用的自身抗体,再通过标有荧光标志物的抗Human IgG的二抗进行孵育以及荧光检测,就可以发现这些自身抗体(图3)。
图3、蛋白芯片筛选自身抗体过程示意图
原理很简单,但就是却很难做好,为什么呢？这就不得不说一下抗体与抗原的结合过程了。
简而言之就就是对应抗体识别抗原上特异的抗原表位,然后结合上去。
而抗原表位分为两种,线性表位(Linear epitope)以及非连续性表位(discontinuous epitope)。
线性表位由一段连续的氨基酸序列组成,识别线性表位的抗体识别这段氨基酸序列并产生抗原抗体的结合反应;而非连续性抗原表位则由不连续的氨基酸组成,通过抗原蛋白质的正确折叠之后,靠近在一起,被相应抗体识别,产生抗原抗体结合反应(图4)。
图4、线性表位与非连续性表位被对应抗体识别并结合示意图
在生物体内,大多数的自身抗体就是识别抗原的非连续性表位的,正确识别筛选出这些自身抗体,就需要蛋白质芯片上的蛋白质就是全长、正确折叠并且有生物功能的。
可就是,传统的蛋白质芯片只能保证芯片上合成的蛋白质就是全长的(有些还不能保证),无法保证蛋白质正确折叠,更无法保证相应蛋白质具有正常的生物功能。
其她影响传统蛋白质芯片筛选自身抗体的问题还包括CV值(coefficient of variation)高(>30%),可重复性不好;分辨率低,背景信号高,无法分辨出表达含量较低的自身抗体等。
用这样的蛋白质芯片筛选自身抗体,就好比用一
张满就是漏洞的大网去捕鱼,自然就是会有大量的漏网之鱼无法被捕到,给科研工作者与企业在自身抗体筛选的研究工作中带来了很大的阻力,白白浪费了许多时间、精力与金钱。
Sengenics公司的Immunome TM蛋白质芯片研究平台,由Jonathan Blackburn教授于1996年在剑桥大学发明,这就是一项牛津与剑桥大学联手合作的项目,就是目前全世界唯一的,全长、正确折叠且功能均验证的蛋白质芯片平台(图5)。
可以筛选出识别非连续性表位的自身抗体,具有其她蛋白质芯片产品无法替代的优势。
图5、Immunome TM相比于其她蛋白质芯片平台的优势
Immunome TM蛋白质芯片研究平台包含1631种全长、正确折叠与功能验证的人类蛋白质,主要覆盖癌症抗原、转录因子、激酶、信号通路分子等,满足用户不同方向的研究需求(图6)。
图6、Immunome TM蛋白芯片平台包含蛋白质涉及领域
同时,Immunome TM蛋白芯片平台相对于传统蛋白质芯片产品,还具有CV值低,分辨率高(达到10 pg/ml,与luminex相同),背景信号低等优势(图7,图8),为用户筛选表达丰度低的自身抗体作为生物标志物提供强大的技术支持。
图7、Immunome TM蛋白芯片CV值(红色)与其她蛋白质芯片(蓝色)对比
图8、Immunome TM蛋白芯片(右)与其她蛋白芯片(左)背景信号对比
相比于传统蛋白质芯片产品在筛选自身抗体应用中的“千疮百孔”,Sengenics Immunome TM蛋白芯片产品可谓“天网恢恢,疏而不漏”,全长、正确折叠、功能验证、覆盖领域广、低CV低背景信号、高分辨率的全新一代蛋白芯片平台技术助力科研工作者与企业用户在自身抗体研究领域“捕获大鱼”,满载而归。