核医学课件第五章体外分析技术课件

固相分离法(测量B)：
将抗体或抗原通过特殊技术联结在固相载体上，免疫反 应在固相载体上完成，达到平衡后形成固相的Ag-Ab 复合 物，可与游离部分分离。 优点：操作简便，迅速，分离效果好，非特异性结合低。
（五）放射性测量仪器
γ井型计数器：测γ射线，125I标记 液体闪烁计数器：测β射线，3H、14C等标记 配计算机系统，自动测量、数据处理、打印结果。
双抗体＋沉淀法(测量B)： 将双抗体和沉淀法两者结合进行分离。 本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间长 和沉淀法非特异性结合高的缺点。
活性炭吸附法(测量F)： 活性炭吸附小分子游离抗原，离心分离后，复合物留 在上清液中，游离抗原在沉淀物中，测量沉淀物中的放射 性 F。 优点：本法操作简便，分离速度快，价格低廉。 缺点：易于解离，分离效果时间和温度的影响较大，非特 异性结合较高。
一、基本原理：
放射性标记的抗原和非标记抗原(标准抗原或被测抗原) 同时与限量的特异性抗体进行竞争性免疫结合反应，这种竞 争关系可用以下反应来表示：
*Ag：标记抗原 Ab：特异性抗体 Ag-Ab：非标记抗原抗体复合物
Ag：非标记抗原 *Ag-Ab：标记抗原抗体复合物
*Ag与Ag的免疫活性完全相同，对Ab具有同样的亲和力；
（3）分离方法主要是使大分子和小分子物质分离。
双抗体法(测量B)： 用抗原免疫动物而产生的抗体称为第一抗体，用第一抗 体再免疫另一种动物所产生的抗体称为第二抗体。
当RIA反应完成后，于反应液中加入第二抗体，第二抗 体则与含有第一抗体的免疫复合物B相结合形成第二抗体复 合物，其分子量比第一抗体复合物大，可用离心方法分离 出来，称为双抗体法（double antibody method）。
基本操作过程：
放免测定一般包括加样、温育、分离B与F、测量与数 据处理五个步骤
放射免疫分析法的必备条件和基本步骤
三、质量控制
质量控制（quality control，QC）包括实验室内质量控 制（internal quality control）与实验室间质量控制， 实验室内质量控制又包括批内质控与批间质控。
二、基本试剂
（一）抗体：
抗体的亲和力
是抗体与抗原之间相互作用的一种结合能力或强度。亲和 力大即免疫结合既快又牢固，不易重新解离。 Ag + Ab
k1
k2
Ag-Ab
亲和力的大小用亲和常数（affinity constant）Ka值来表 示，Ka＝ k1/k2 ，一般要求Ka值在1010～1012 L/mol之 间。
亲和常数Ka的计算最常用的方法是标准作图法：即以B/F 为纵坐标，以［B］为横坐标，得到一条直线，其斜率的负 数即为Ka
标准分析图
抗体的特异性 指抗体分别与相应抗原和抗原结构类似物的结合能力的 比较。 抗体与相应抗原结合能力强，而与该抗原结构类似物结 合能力弱，则特异性高。抗体与抗原结构类似物的结合称交 叉反应（cross reaction） 交叉反应率 = ED50（B）/ ED50（A）× 100%
第五章
体外分析技术
体外分析技术主要是利用放射分析方法或其派生的相 关技术在体外进行肌体内物质种类和含量的分析测定。
体外分析技术的典型代表 ——放射免疫分析（RIA）
竞争性体外放射分析法： 标记抗原和未标记抗原对抗体都有相同的结合能力， 但是当抗体的量有限时，这种结合就出现相互竞争，彼此 抑制。 非竞争性体外放射分析法：
优点：B和F分离较为完全，非特异性结合低，使用方便。 缺点：分离时间长，第二抗体用量多，易受反应环境中蛋 白质及盐含量的影响。
双抗体示意图
沉淀法(测量B)： 某些中性盐和有机溶剂（如聚乙二醇（PEG）或碱金属 中性盐等）在一定条件下，能使抗体与抗原复合物沉淀。 优点：本法操作简便，分离速度快，价格低廉。 缺点：分离效果易受pH值、离子强度、温度、蛋白质含量 的影响，且非特异性结合较高。
用标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体， 待测疫分析(RIA)
RIA特点：灵敏度高(可测水平达10-12—10-15g) 特异性强 操作简便，成本低 应用广泛 目前可用RIA测定的微量物质：激素、蛋白质、环磷酸 腺苷、抗原、抗体、维生素、药物等300多种
当*Ag和Ab为恒定量，Ag和*Ag的总量大于Ab上的有效结合 点时， *Ag-Ab的形成是随着Ag量的增加而减少，剩下来的未 结合或游离的*Ag则随着Ag量的增加而增加；
测定*Ag-Ab或*Ag即可推出被测的Ag量。
放射免疫分析原理示意图
标准曲线 ： 配制一系列已知浓度的标准抗原，分别向其中加入固定 量的标记抗原和抗体，反应平衡后，分离抗原的结合部分和 游离部分，测定*Ag-Ab的放射性B或游离*Ag的放射性F，计 算出结合率B%［B/(B+F)×100%］或其他指标。 以B%或B/B0%为纵座标，标准抗原的浓度为横座标，绘 制曲线即为标准曲线(standard curve)。
抗体的滴度 指抗体实际应用时的稀释倍数，稀释倍数越高，滴度(titer) 越高，表示抗体的效价越高。 将抗血清稀释成不同浓度，分别加入定量标记抗原，充分 反应后分离B、F，以稀释度为横坐标，B0%为纵坐标绘制标 准曲线。 B0%为30%~50%的稀释度为最佳稀释度。
（二）标记抗原：
对标记抗原的要求：
1．比活度(specific activity)：比活度越高，灵敏度越高。
2．放射化学纯度(radiochemical purity)：指具有免疫活性 的标记抗原的放射性占总放射性的百分率，一般要求大于 95%。 3．免疫活性：蛋白质分子上标记过多的碘原子就可能引起 免疫活性的改变，一般以每个蛋白质分子上只标1～2个125I 原子为宜。
4．半衰期：合适，保证制造、运输、分析整个过程。
（三）标准品： 已知含量并呈梯度浓度的系列标准抗原，做标准曲线用。 对标准品的要求 ： 1．标准品(standard)与被测物应属同一种物质
2．在与抗体发生反应时，应与被测物具有相等的活性和亲 和力
3．高度纯化 4．定量精确
（四）分离方法
（1） 分离的目的是使抗原抗体复合物和游离抗原分开，以 便测量B与F； （2）游离抗体及非标记抗原无放射性，不干扰测量；