食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
菌种的保藏与复壮
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
• (2)保护剂 不同种类的保护剂对不同
微生物的作用是不同的，如个别菌种在 脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达 99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时 死亡率大大减少。一般情况下，那些容 易保存的菌种对保护剂的要求不很严格， 而不易保存的菌种对保护剂的要求却很 苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干 燥保存菌种的关键因素。
(六)真空冷冻干燥法
• (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是 新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂， 用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养 基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种， 则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细 胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。 悬液中菌数要求达到10 8～10 10cfu/ml 为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分 装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部， 装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六)真空冷冻干燥法
• (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-
30～40℃下冻结20～60min，也可以用干冰和无水 乙醇冻5～10min。
• (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始
抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下， 并尽快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加 速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。 干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而寂， 以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时 是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空 载时最高真空；样品温度与管外温度接近。 完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频 真空检测真空度。
菌种保藏、衰退及复壮（3）
菌种保藏、衰退及复壮（3）菌种保藏、衰退及复壮（3）来源：青岛海博三、菌种的复壮（一）复壮狭义的复壮是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
由此可见，狭义的复壮是一种消极的措施，而广义的复壮是一种积极的措施，也是目前工业生产中积极提倡的措施。
（二）菌种复壮的主要方法1、纯种分离法通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。
常用的分离纯化的方法可归纳成两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平来说是纯的。
例如采用稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。
另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法。
它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水平。
后一类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作分离室的方法，也有利用复杂的显微操纵器的纯种分离方法。
对于不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管截取菌丝尖端单细胞进行纯种分离。
2、宿主体内复壮法对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。
例如，苏云金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，可用退化的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。
如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率。
根瘤菌属经人工移接,结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。
3、淘汰法将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。
菌种的衰退、复壮和保藏
菌种的衰退、复壮和保藏1. 内容1.菌种的衰退：菌种退化是指由于自发突变的结果，而使某一物种有一系列生物学性状发生量变或质变的现象（群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象）。
具体表现为：⏹原有的形态性状变得不典型了；⏹生长速度变慢，产生的孢子变少，或颜色改变，甚至变形；⏹代谢产物生产能力下降，在生理上常指产量的下降；⏹致病菌对宿主侵染力的下降；⏹对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降；等等。
2.衰退菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择自发的正变个体。
（1）衰退的防止:⏹控制传代的次数⏹创造良好的培养条件⏹利用不易衰退的细胞传代⏹采用有效的菌种保藏方法（2）菌种的复壮⏹纯种分离法⏹通过宿主体复壮对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动、植物宿主体中，通过这种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。
⏹淘汰已衰退的个体（3）菌种的保藏⏹原理人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。
⏹常用的方法：冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法等。
2. 练习一．填空1.某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变的结果，而使该物种原有一系列生物学性状发生衰退性的量变或质变的现象，叫做_____。
答案：衰退2. ______属于第三代的生物武器，包括高致病力的病原体和抗药菌等。
9-2菌种的衰退、复壮和保藏
衰退的原因： 大量群体中的自发突变
菌种衰退的表现
• 对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。 • 其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退。 最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。 • 生长速度缓慢，产孢子越来越少。 • 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。 • 衰退还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗 低温等）能力的减弱等。
实践中复壮方法
• 1．纯种分离 。
• 2．通过宿主体内生长进行复壮 。
• 3．淘汰已衰退的个体
三、菌种的保藏
基本要求： 在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
原理：
采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸 度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好时候它们的休 眠体，使微生物生长在代谢不活泼、生长受抑制的环 境中。
载体法
原理：使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。 常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠 和滤纸片等。 操作方法（砂土管保藏法） （1）河砂处理 取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。 倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗， 烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。 （２）土壤处理 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗 涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部 分丢掉。 (3)砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而 用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小 试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常 采用间歇灭菌2--3次)，最后烘干。
从生长斜面制备菌悬液 从液体培养制备菌悬液
2．控速冷冻
致冷速度为1℃/min
(三)复苏
迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；用巴 氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养 基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.10.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。
菌种繁育—菌种退化与复壮(食用菌生产技术课件)
长，都能会引起食用菌菌种退化。保藏期间如果斜面母种出现子实体，有菌盖形成的情况下，条件 合适就会有孢子弹射到斜面上萌发出菌丝，有性繁殖和无性繁殖混在一起，食用菌菌种发生退化。
二、防衰措施
一、菌种退化
表现
（1）菌丝体生长缓慢、丛生，长势 稀疏、尖端生长不整齐，整齐度下降 。
（2）对环境条件（氧气、温度、酸 碱度、二氧化碳）、杂菌等的抵抗力 变弱，生活力衰退。
（3）品种变劣，出菇迟，产量降低 ，出菇潮次不明显等。
最终都是产量和质量连续性的下降。
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
外因1：培养环境不适合 温度、湿度、通气、光照、PH值、培养基过于丰富或过于贫瘠等，均可造成菌种失去自我调节的能
力，丧失应该具有的优良种性。 外因2：转代次数过多 实际的食用菌生产中，采用不规范的菌种培养和制作，转代的次数越多，引起食用菌菌种退化的可
菌种退化与复壮
目录
一、菌种退化 二、防衰措施 三、菌种复壮
一、菌种退化
概念
食用菌菌种退化是指在正常栽培条件下，食用菌菌种的优良性状及典型 性由于菌丝体的遗传物质发生变异而在传代过程中逐渐丧失的现象。
菌种退化不是某一次转代突然出现的，也不是短时间发生的。只有群体 中退化菌丝在数量上占一定优势后，才有表现，是从量变到质变的渐变 结果，需要较长的时间。食用菌产量和质量的下降是食用菌菌种退化的 最终结果。
菌种的退化与保藏
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• 3.经常进行菌种纯化 • 所谓菌种纯化就是对菌种进行自然分离。首先将菌种 制成单细胞或单孢子悬浮液，经稀释后将其涂布与琼脂平 板上培养，待平板上单菌落培养成熟后挑取单菌落移种斜 面，再经摇瓶 试验后测定其生产能力，从中选出高水平 的菌种。 • 4.采用良好的培养基和培养条件 • 培养基和培养条件可以从多方面影响菌种的性状，因 此，为了防止菌种退化，要选择合适的培养基和培养条件 。 • 5.采用科学的保藏方法 • 在菌种保藏过程中也会发生菌种退化现象，尤其是不 良的保藏条件更易引起菌种退化。因此，要采取科学和有 效的菌种保藏方法以防止菌种优良性状的退化。
• 复壮的方法：
• （1）纯种分离法（pure
稀释分离法 平板划线法 组织分离法
culture isolation）
• （2）通过宿主体复壮
寄生型微生物的退化菌株可接种到相应寄主体内以提高菌株的 活力。
（3）联合复壮
对退化菌株用高剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍（NT藏
二、菌种的复壮
• 定义 • 狭义的复壮： • 是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型性状、生产性 能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢 复原菌株固有性状的相应措施。 • • 广义的复壮： • 在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取 纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。 • 一种积极的措施 一种消极的措施
• 菌种（culture，stock culture）
是一种极其重要和珍贵的生物资源。
• 菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）
是一项十分重要的基础性工作。
菌种的衰退、复壮及保藏
一、菌种的衰退与复壮
1. 衰退 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些 原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象。 衰退的原因：①基因突变 ②菌种不纯 ③ 培养条件不当 常见的衰退现象：
菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 代谢产物生产能力下降；
2. 原理： 选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞
等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难 以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、 缺营养 以及添加保护剂等）
3. 国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务 广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达 到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。
菌种的复壮措施
①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑 取法等）。 ②通过寄主体内生长进行复壮（如杀螟杆菌的复壮）； ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理 ，以杀死生命力较差的已衰退个体）。 ④联合复壮，用高剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍 联合处理
二、菌种保藏
1. 目的： ①存活，不丢失，不污染 ②防止优良性状丧失 ③随时为生产、科研提供优良菌种
2、 菌种的复壮
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分 离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的 个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经 常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产 性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从 生产中选种。
菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）
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食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种
复壮
今天要和大家介绍的是食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮，这是食用菌生产过程中少不了的步骤。
一、菌种贮藏原理
食用菌菌种是国家重要的种质资源。
菌种保藏是食用菌生产中的一项必不可少的环节。
食用菌和其他生物一样，都具有遗传性和变异性。
遗传性保证了子代遗传特征的相对稳定，为菌种贮藏提供了条件；变异性使子代的性状与亲本相比会发生某些改变，给菌种的保藏带来了困难。
食用菌菌种在长期的栽培和保藏过程中，由于传代次数过多或不利环境条件的影响，常常会导致菌种衰退，丧失其优良性状。
因此，要想在一定时间内使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，就应该采取一定的措施，进行菌种保藏工作。
菌种保藏的目的是在特定条件下，降低菌种的代谢速度，使其处于休眠或半休眠状态，在一定的保藏期内，确保菌种的纯度，防止病虫害感染，以保持菌种的优良性状，当条件适宜时又可以重新恢复生长繁殖。
菌种保藏的基本原理是采用低温、干燥、饥饿、缺氧等方法，以抑制菌丝生长，降低代谢速度，使菌丝处于休眠或半休眠状态，并保证菌种的纯度。
二、菌种复壮
从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，进行分离、培养，从而达到恢复菌种优良性状的过程就叫菌种复壮。
在实际生产中，多是在菌种尚未退化之前进行菌种复壮。
(一)菌种复壮原理
生物以遗传变异为基础，通过自然选择和人工选择得以进化。
变异提供了选择的基础，选择保存了适应环境的个体，保存的个体使遗传特征得以遗传。
如此再变异、再选择、再遗传，循环往复，使生物得以不断进化。
菌种复壮就是依据这个原理进行的。
(二)菌种复壮方法
1.挑选健壮菌丝进行接种：每次转接菌种时都挑选健壮菌丝进行接种是防止菌种衰退的有效、简便的措施。
2.进行分离复壮：从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，通过分离进行复壮。
如菌丝分离，用无菌水将斜面上的菌丝稀释，再将菌丝体放入装有无菌蒸馏水的三角瓶中摇匀，然后转接到平板培养基上，使菌丝分布均匀，适宜条件培养至萌发成菌落。
从中挑选生长健壮的菌丝进行转接作为母种。
经过检验证明同原来的菌种性状一致，即说明菌种得到复壮，可以用于生产。
3.定期进行菌种分离：对在生产中应用的菌种应该1~2年进行一次分离，才能起到复壮的作用。
常用的是组织分离法：挑取性状与原菌种一样，生长健壮、无病虫害的子实体进行组织分离。
这是一种比较实用、简便的菌种复壮方法。
也可以采用孢子分离法、基内菌丝分离法进行分离复壮。
但
不管采用何种分离方法，得到的菌种只有经过出菇检验证明其性状优良后，才能应用于生产。