含cry7类基因的苏云金芽胞杆菌菌株的分析

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从崖城农田土壤中发现一种具有杀死植物害虫功能的细菌——苏云金解析

从崖城农田土壤中发现一种具有杀死植物害虫功能的细菌——苏云金芽孢杆菌崖城高级中学高一（1）班龚彩秀指导老师：翟鸿武一次偶然的机会让我在一本生物杂志上接触到苏云金芽孢杆菌（Bacillus Thuringiensis ,Bt）当时的我觉得很神奇——它能杀死农作物害虫。

人类从刀耕火种以来，一直备受害虫的威胁，给人类的生活造成了多种危害，其中虫害是威胁农作物高产的主要原因之一，全世界每年因此损失约数千亿美元，每年世界上因虫害而造成的农产品损失估计为13％。

在我国，水稻每年因虫害减产10％以上，小麦减产近20％，棉花产量损失达20％～30％。

为了控制农林病虫害，人们不得不大量使用化学农药，但长期大剂量地使用化学合成的农药，致使多种害虫对化学杀虫剂产生了一定的抗性，因此不但不能有效地控制害虫，结果还面临着三大难题无法解决，①环境污染，残毒上升，人畜均遭毒害；②用药浓度不断提高，防治费用不断增加，不得不无休止地研制新农药；③杀伤天敌，破坏了生态平衡，引起害虫再猖獗和次虫害虫大爆发，导致自然界中恶性循环。

苏云金芽孢杆菌由于能在生长代谢过程中产生对多种农林害虫具有特异性杀虫毒力的生物活性蛋白，并能由此生产相应的微生物杀虫剂来用于害虫生物防治而受到国内外的广泛重视。

广泛的研究与应用实践证明，与化学农药等其他类型的杀虫剂相比，Bt杀虫剂具有杀虫特异性强，对人、畜及非目标昆虫无毒副作用；安全性能好，不污染环境，由于具有多种类型的杀虫晶体蛋白，昆虫难以产生抗性或产生抗性较缓慢；具较低的生产成本等优点。

目前已推广使用的表达Bt毒素基因的转基因植物都有较为显著的抗虫性能，在大田栽培中无需或只需喷洒少许化学杀虫剂，从而大大减少了对环境的污染。

因此苏云金芽孢杆菌作为新型生物农药解决了一个长期以来让无数劳动农民头痛的问题。

而对生物有着浓厚兴趣的我对它有种相识恨晚的感觉，而这次的“科技创新”活动让我坚定了对它认识的决心，在老师和同学们的帮助下，我开始了我的创新实验。

一株杀虫、抑真菌的苏云金芽孢杆菌菌株及其应用[发明专利]

专利名称：一株杀虫、抑真菌的苏云金芽孢杆菌菌株及其应用专利类型：发明专利
发明人：陈月华,韩苗苗,蔡峻,谢池楚,肖亮,刘东
申请号：CN200810052439.3
申请日：20080314
公开号：CN101245329A
公开日：
20080820
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一株杀虫、抑真菌的苏云金芽孢杆菌菌株及其应用。

本发明菌株为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis 519－1，简称Bt 519－1，保藏号CGMCC No.2327，该菌株携带有杀虫蛋白编码基因cry1Aa，、cry1Ab、cry1Ac、cry1I、cry2及其vip3A以及70kDa几丁质酶编码基因chiB。

所述菌株的孢晶复合物冻干粉对甜菜夜蛾的半致死浓度(LC)仅为8.8μg/mL，能抑制8种常见植物病源真菌菌丝的生长，可100％抑制真菌孢子萌发。

利用这一菌株可生产杀虫抗病的多功能生物农药，用于防治鳞翅目重大害虫甜菜夜蛾和棉铃虫，同时对植物病源真菌也有抑制作用。

申请人：南开大学
地址：300071 天津市南开区卫津路94号
国籍：CN
代理机构：天津佳盟知识产权代理有限公司
代理人：侯力
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转基因抗虫作物中苏云金芽孢杆菌Cry蛋白的食品安全问题

转基因抗虫作物中苏云金芽孢杆菌Cry蛋白的食品安全问题王春玲;Bruce Hammond【摘要】苏云金芽孢杆菌（Bt）微生物制剂是农业、林业和饮用水等领域用来控制靶标害虫幼虫的有效工具,至今已经有50余年的使用历史。

同时其在美国、欧洲和其他一些国家被广泛用于经过认证的有机农业生产之中。

目前已获审批的转基因Bt作物中最常使用的是Cry蛋白。

Cry蛋白的作用机制、食品安全性以及致敏性已经经过啮齿类动物、农场动物和人体内试验和生物信息学研究的严格检验。

Cry 蛋白的杀虫作用只在靶标害虫的碱性消化道内,与中肠上皮细胞的特异蛋白受体结合才能起到杀虫作用,而其他非靶标生物体内（人类、猕猴、小鼠、大鼠和牛等）都被证明没有这种特异蛋白质受体。

美国、欧洲和其他国家的管理机构都已经证实了转基因Bt作物和Cry蛋白在农作物和饮用水中残留的安全性。

食物加工过程能够最大化地减少转基因作物中功能性Cry蛋白的摄入。

转基因抗虫作物有利于降低农药杀虫剂的使用的同时,也能够有效防止玉米中伏马菌毒素的污染。

%Bt microbial insecticides have been used to control larval insect pests that feed on agricultural crops, forest and drinking water for over 50 years. They are also widely used in certified organic agricultural food production in the United States, Europe and other countries. Cry proteins are most commonly introduced in registered Bt crops. Mode of action, food safety and allergenicity of Cry protein have been rigorously tested using rodent, farm animals, and human experiment and bioinformatics research tools. The insecticidal function of Cry protein only works in the alkaline environment of the insect gut where specific receptors on the membranes of midgut epithelial cells present. Other non-target organisms （humans,rhesus monkeys, mice, rats and cows etc.） lack these receptors. Regulatory agencies in US, EU and other countries have confirmed the history of safe consumption of Bt crop and Cry protein residues on crops and in drinking water. Food processing can minimize dietary intake to functionally active Cry proteins. Bt crop contributes to reduce use of insecticides and improves the safe consumption of corn grain by lowering contamination from fumonisin mycotoxins.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2011(001)004【总页数】7页(P235-241)【关键词】转基因;抗虫;苏云金芽孢杆菌;Cry蛋白;食品安全【作者】王春玲;Bruce Hammond【作者单位】孟山都生物技术研究（北京）有限公司,北京100190;孟山都生物技术研究（北京）有限公司,北京100190【正文语种】中文【中图分类】S476.11苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种常见的需氧性细菌,可以生长在不同的环境介质中,包括土壤、水、植物表面、谷物粉尘及昆虫宿主。

苏云金芽孢杆菌基因组研究概况

基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第1期，第202－208页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.1,202－208专题介绍Review苏云金芽孢杆菌基因组研究概况谭寿湖1,3张文飞1,3叶大维2*1广西大学生命科学与技术学院,南宁,530005;2南开大学生命科学院,天津,300071;3海南海德热带农业资源研究所,三亚,572025*通讯作者,yehtawei@摘要迄今为止，全球已有2个Bt 株菌株完成了全基因组测序，1个Bt 菌株正在拼接中，15个Bt 菌株正在进行测序中。

已有22个Bt 质粒完成了全序列测定。

Bt 是作为生物农药使用最广泛的微生物菌株，也是最为成功地将其杀虫晶体蛋白基因应用于植物转基因的微生物。

在基因组进化、新基因发现、基因表达调控等方面一直是科学家研究的热点，并取得了相当多的成果。

本文概述了苏云金芽孢杆菌基因组测序现状、基因组特征及比较基因学等方面的研究进展。

关键词苏云金芽孢杆菌,Bt 基因组,质粒基因组,比较基因组Summary of Research Progress in the Genomics of Bacillus thuringiensisTan Shouhu 1,3Zhang Wenfei 1,3Ye Dawei 2*1College of Life and Technology Science,Guangxi University,Nanning,530005;2College of Life Sciences,Nankai University,Tianjin,300071;3Haide Institute of Tropical Agricultural Resources,Sanya,572025*Corresponding author,yehtawei@Abstract Presently,there are two Bt strains that have completed whole genomic sequencing,while one Bt strain is being assembled,and 15Bt strains are in progress.Furthermore,22Bt plasmids have completed sequencing.Bt is the most widely used microbial strains as a biological pesticide and also have the most successful application in genetically modified plant with the use of its insecticidal protein gene.Scientists have been looking at the genomic evolution,new gene discovery,gene expression and regulation with considerable achievements.This article pro-vides an overview on the latest research development of Bt genome sequencing,genome characteristics and com-parative genomics studies.KeywordsBacillus thuringiensis ,Bt Genome,Plasmid genome,Comparative genome基金项目：本研究由国家863项目(2006AA022189)资助随着基因组测序技术的快速发展，测序成本的降低，对任何生物的基因组进行测序变得现实和可能(Marguerat et al.,2008)。

苏云金芽孢杆菌杀虫方面的研究及运用进展

苏云金芽胞杆菌杀虫方面的研究及运用进展摘要：人类对苏云金芽胞杆菌（Bt）的研究至今已有100多年的历史，因其具有特殊的生理特性，在微生物防治害虫方面具有重要的作用。

利用微生物能直接杀死害虫却又不伤害控制害虫的天敌，最重要的是它不污染环境，害虫也更难以产生抗药性，还能通过遗传操纵改造某些性状，以便对其更好的利用。

同时，随着转基因技术的兴起和发展，Bt成为转基因过程中的重要材料，在应用实践中起着巨大的作用，如今成功的转Bt产物已有：转Bt抗虫棉花、转Bt玉米以及备受争议的转基因水稻等等。

本文主要叙述Bt的某些重要特征和当前的研究进展，旨在达到一种科普宣传让人们更加了解有关转Bt产物方面的知识。

关键词：苏云金芽孢杆菌、微生物防治、转基因、农业生产应用苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis，简称Bt )是一种杆状、革兰氏染色阳性反应、能形成内生芽胞的细菌，广泛存在于各种生态环境中。

其营养体具有周生鞭毛或无鞭毛。

在其芽胞期能形成对特定昆虫具有毒性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)组成的伴胞晶体，此特点成为苏云金芽胞杆菌区别于分泌肠毒素的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)和引起炭疽病的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)的主要特征(喻子牛等，1990)。

由于其独特的杀虫特性，自从1901年日本学者Ishiwata首次分离到苏云金芽胞杆菌以来，苏云金芽胞杆菌得到了广泛的关注和研究，在世界范围内已分离得到超过40000个菌株，对其生物活性谱的了解得到了极大的扩展，由最初对鳞翅目的毒性，逐渐发现对双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf等，1998)。

1.苏云金芽孢杆菌的毒素毒素是苏云金杆菌杀虫的核心，主要有三种：伴孢晶体（杀虫晶体蛋白，Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）即σ-内毒素，苏云金素即β-外毒素，芽孢。

苏云金芽孢杆菌毒素Cry7Aa1三维结构模型

第18卷第3期湖南城市学院学报（自然科学版）V ol.18 No.3 2009年9月 Journal of Hunan City University （Natural Science） Sept. 2009苏云金芽孢杆菌毒素Cry7Aa1三维结构模型赵新民，聂伟安，刘石泉（湖南城市学院化学与环境工程系，湖南益阳 413000）摘要：运用生物信息学软件和网络数据库资源，采取同源建模的方法以毒素蛋白Cry8Ea1为模板预测了苏云金芽孢杆菌毒素Cry7Aa1的三级结构并分析了相关的生物学功能．结果表明，Cry7Aa1为3个结构域组成的近似球状蛋白，Cry7Aa1在氨基酸序列上与Cry8Ea1有40%的同源性，在三维结构上Cry7Aa1与Cry8Ea1有高度的相似性，它们结构域Ⅰ几乎完全相同，在结构域Ⅱ之间和结构域Ⅲ之间存在较小差异. Cry7Aa1与Cry8Ea1的表面电势分布不同．2种毒素具有相似的毒杀机理. 模型经Ramachandran图和Verify 3D检验具有合理性.关键词：苏云金芽孢杆菌；毒素；Cry7Aa1；三维结构；模型中图分类号：Q936文献标识码：A文章编号：1672–7304(2009)03–0057–04 Three-dimensional Structure Model of Bacillus Thuringiensis Cry7Aa1ZHAO Xin-min, NIE Wei-an, LIU Shi-quan（Department of Chemistry and Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyang, Hunan 413000, China)）Abstract: With bioinformatics and internet data resources, homology modeling was used to build the three-dimensional structure model of Bacillus thuringiensis Cry7Aa1 on the template of Cry8EAa1, and the related biological functions were discussed. The results showed that Cry7Aa1 was a compact ball-like protein molecule composed of three domains. The sequence identity of Cry7Aa1 with Cry8EAa1 was 40%. They shared a common three-dimensional structure. The domain I of Cry7Aa1and Cry8EAa1 was very similar, while some distinctions could be found in the domain II and III of the two toxins. The distribution of surface electrostatic potentials of Cry7Aa1 and Cry8EAa1 was different. Two toxins shared the same mechanism of action. The Ramachandran plot indicated that the model was reasonable.Key words:Bacillus thuringiensis;toxin; Cry7Aa1; three-dimensional structure; model苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）是一种革兰氏阳性细菌，它在形成芽孢的同时产生晶体包涵体．包涵体主要为δ内毒素的杀虫晶体蛋白，毒素被敏感昆虫的幼虫吞食后，在幼虫肠道碱性环境和蛋白酶的作用下释放出活性毒素蛋白，活性毒素蛋白与幼虫中肠上皮细胞的特异受体发生结合并形成孔道，破坏细胞渗透压平衡，最终导致昆虫死亡[1].最初苏云金芽胞杆菌用于毒杀在农业和林业等方面危害较大的鳞翅目（Lepidoptera）害虫，经进一步的研究发现苏云金芽胞杆菌的杀虫活性范围从无脊椎动物节肢动物门中的鳞翅目（Lepidoptera）扩大到对双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、直翅目(Orthoptera)等9个目的昆虫有活性，同时还发现对线形动物门(Nemathelminthes)、原生动物门(Protozoa)中某些有害种类有杀虫活性[2-3]. 目前Bt制剂已发展成为目前世界上应用最为广泛的生物杀虫剂.目前已有400多种Bt毒素被报道(/Home/Neil_Crickm ore/Bt/). 在多种Bt毒素中，已通过同晶置换法和X-衍射晶体图谱确定下列了几种晶体蛋白的三维结构[4]：Cry3Aa、Cry1Aa、Cry2Aa、Cry3Bb1、Cry4Ba、Cry4Aa和Cry8Ea1. 这些毒素尽管在一级结构上相差较大，但它们的三维结构表现出高度的相似性. 毒素主要由3个结构域组成，结构域Ⅰ位于肽链的N 端，为1组由6～7个两亲的α螺旋围绕着1个疏水的α螺旋形成的α螺旋束，主要参与细胞膜的穿孔；结构域Ⅱ位于肽链的中间，为反平行的β折叠片层，其顶端的突环参与毒素与受体蛋白的结合；位于C端的结构域Ⅲ是由两组反平行的β折叠片层组成的夹心结构，以β果酱卷(jelly roll)拓扑结构排列，其功能是防止蛋白酶对毒素分子的过度降解[1].Cry7Aa1毒素对马铃薯甲虫(Colorado potato beetle)有很强的毒杀作用[5]，具有较大的应用价值.收稿日期：2009-06-10基金项目：湖南省教育厅科研基金资助项目(08C203)作者简介：赵新民(1962-)，男，湖南湘阴人，副教授，博士，主要从事微生物分子生物学研究．湖南城市学院学报（自然科学版）2009年第3期58同源建模是众多的蛋白质结构预测方法中最成功的一种[6]. 应用计算机软件和网络数据库资源，采取同源建模的方法构建Cry7Aa1三维结构模型，通过比较Cry7Aa1与其它Bt毒素在结构上的差异，对了解毒素作用的分子机理和开展蛋白质工程提高Bt生物农药杀虫效果具有重要意义.1 材料和方法1.1 目标蛋白序列Cry7Aa1氨基酸序列由Genbank数据库获得，登录号为AAA22351.1.2 软件和数据库CLUSTAL W（1.83)平台（/ c-lustalw/#），用于进行多序列对比分析；Swiss-Pdb Viewer Version 3.7sp5用于三维结构预测和分析；Swiss-Model（http://swissmodel. /）：蛋白质结构同源建模服务器，用于三维结构预测图像处理及表面电势计算使用Pymol程序[7]. 蛋白质多序列比对程序BLAST （/BLAST/）进行多序列比对确定模板. 蛋白结构比对Cα根均方偏差（RMSD）计算使用TOPOFIT程序（/topofit/）. 模型的验证采用Ranmachandran 图[8]和Verify 3D[9].Genbank数据库（/），是国际上3大主要蛋白质和核酸序列数据库. PDB蛋白结构数据库是美国Brookhaven国家实验室的PDB (Protein Data Bank)蛋白质三维空间结构数据库.1.3 Cry7Aa1三维结构的构建将Cry7Aa1的序列用BLAST中的blastp suite 对Brookhaven PDB蛋白结构数据库分别进行序列相似性搜索. 确定打分最高的蛋白作为同源建模的模板.以Cry7Aa1 (Genbank登录号：AAA22351) 蛋白为目标，以同源性最高的Cry8EAa1为模板，按文献[10]的方法预测Cry7Aa1的三维结构：首先将目标和模板的序列以CLUSTAL W1.83进行多序列比对，并将结构域Ⅲ的部分序列进行手动优化，然后在Swiss-Pdb Viewer Version 3.7sp5软件中打开Cry7Aa1的序列和模板的PDB文件并进行“magic fit”，然后在“alignment”窗口根据获得的比对结果进行手动调整，未比对到的目标蛋白的N端和C端序列手动删除，然后以“project”提交到Swiss-Model服务器，获得Cry7Aa1蛋白的分子模型 (pdb文件). 2 结果与讨论2.1 模板的确定和序列比对以Cry7Aa1作为目标蛋白序列，用BLAST 对Brookhaven PDB蛋白结构数据库分别进行序列同源性搜索. Cry8EAa1 与Cry7Aa1同源性为40%，为最高值, 故确定Cry8EAa1为构建Cry7Aa1三维结构的模板. 通常情况下用同源性为30%以上的模板，可以构建较为理想的模型，所以确定Cry8EAa1为模板是可行的. Cry8EAa1 与Cry7Aa1的序列比对结果见图1，可见它们的氨基酸序列在起始的N端具有较高的相似性，而在C端具有较大的差异性.图1 Cry7Aa1与Cry8Ea1的序列比对2.2 模型的验证蛋白质氨基酸骨架上的 C-Cα键和 N-Cα键理论上是可以自由旋转的，分别用二面角ψ和φ代表, 而实际上处于某些特定角度时，可能会由于空间位阻使得分子的构象势能特别大. Ranmachandran plot展现出结构中所有氨基酸残基的ψ角和Ψ角之扭转角度对模型进行评价[8]. 结果显示：91.1%以上的氨基酸残基位于图上的黄色核心区域，7.6%的氨基酸残基落在附加允许区域，落在一般也许区域的占0.8%，而落在不也许区域里的只占0.6%（图2）. 利用Verify 3D分析原子模型与自身序列在位置和环境上的兼容性，如果80%的氨基酸残基得分大于0.2，可假定模型是合理的[9]. Cry7Aa1中85.11%氨基酸残赵新民等：苏云金芽孢杆菌毒素Cry7Aa1三维结构模型第18卷59基Verify 3D 打分大于0.2. 以上验证结果说明构建的Cry7Aa1结构模型是合理的.图2 Cry7Aa1的Ramachandran 图2.3 主要结构特征Cry7Aa1的三维结构为3个结构域组成的近似球状蛋白, 由氨基酸全长序列的33~610共578个氨基酸组成. 可及表面积(ASA) 237.956 nm 2，总体积为79.391 8 nm 3 (图3).结构域Ⅰ位于肽链的N 端，由氨基酸全长序列的33～254组成，为1组由7个两亲的 α 螺旋围绕着1个疏水的α5螺旋形成的α螺旋束，暗示着α5可能起着维系整个a-螺旋束结构的作用; α1和α7紧邻第二个结构域，α2A 和α2B 螺旋方向基本一致，中间由5 个氨基酸隔开.结构域Ⅱ位于肽链的中间，由氨基酸全长序列的255~457组成，为3个反向平行的β折叠片构成所谓的β-棱柱(β-prism)，包括β1至β11，其顶端有3个突环.位于C 端的结构域Ⅲ是由氨基酸全长序列的458~610组成，为两组反平行的β折叠片层组成的夹心结构，包括β12至β20，以β果酱卷(jelly roll)拓扑结构排列.图3 Cry7Aa1三维结构的带状模型及其结构域Ⅰ俯视图2.4 Cry7Aa1与Cry8EAa1的结构比较尽管Cry7Aa1的序列与模板的同源性不是很高，它们的三维结构有很大的相似性（图4）. 利用TOPOFIT 程序中的T-Pair Pairwise Comparison 计算表明，RMSD 和Z-Score 分别为0.68和131.84. 二者的结构域Ⅰ几乎完全重合，只在结构域Ⅱ和Ⅲ有少量差异. 特别需要指出的是它们的结构域Ⅱ和Ⅲ在序列上差异更大，但它们三维结构的相似性仍然较高. 晶体蛋白的表面电势分布会影响其与昆虫中肠道细胞膜上蛋白类受体的结合，进而影响到杀虫特异性. Cry7Aa1与Cry8EAa1表面电势分布差异较大，但在结构域Ⅱ上仍有一些差异（图5）.图4 Cry7Aa1(绿)与Cry8Ea1(红)整体结构比较图5 Cry7Aa1(A)与Cry8Ea1(B)表面电势分布（蓝色：正电势，红色：负电势）2.5 各结构域的生物学功能目前还没有有关Cry7Aa1结构与功能的直接研究，本文利用构建的模型并通过与模板的比较和其它毒素的相关研究来探讨Cry7Aa1的生物学功能.但对Cry1Ac 结构域Ⅰ的定点突变研究发现，结构域Ⅰ在膜插入和孔道形成中发挥作用[11]. 如对Cry1Ac R93的突变对毒力影响较大；Cry1Aa α4上带电氨基酸残基突变后，pH 7.5时，通道形成能力大大降低；Cry1Ab 突变子A92E 和Y153D 的孔道形成能力降低[12].α5和α7是高度保守的，Nunez-Valdez 等人[13]实验证明其在离子通道形成中起关键作用. α5上突变H168R 毒力有所提高，K ＋通透性比野生型降低了24倍，R173L 、R173N 则降低了2~3倍，毒力也降低. 突变子H168R 导致结构域Ⅰ稳定性增强，对短环电流的抑制增强，但H168Q 则只增强结构域Ⅰ的稳定性，毒力下降，说明H168R 毒力增强不是由于结构域Ⅰ稳定性增强，而可能是离子通道的改变引起的[14].湖南城市学院学报（自然科学版）2009年第3期60目前已解析结构的毒素的结构域Ⅰ都具有高度的相似性，基于Cry7Aa1 与Cry8EAa1同样在结构域Ⅰ具有高度的相似性. 说明这2种毒素的结构域Ⅰ具有相似的功能，可以假定Cry7Aa1结构域Ⅰ在毒杀昆虫过程中有插入昆虫中肠细胞膜形成孔道的作用.Lee等人[15]曾报道Cry1Ac 结构域α8 loopⅡ上275~293位的Arg 被Ala替换后，R281A和R289A对烟草天蛾(Manduca sexta)和舞毒蛾（Lymantria dispar）毒力都大大降低，与刷状缘膜囊泡（BBMV）的结合亲和力也降低. 还有研究表明R368，R369很大程度上影响了毒力是由于影响了与BBMV结合及对烟草天蛾和舞毒蛾毒素受体氨肽酶N (APN) 的结合，双突变株R368/R369表明带正电荷的氨基酸在与BBMV的初始识别中起重要作用. Cry7Aa1 与Cry8EAa1在结构域Ⅱ上存在少许差异，但差异不大，这可能是Cry7Aa1 与Cry8EAa1具有相似杀虫特异性的原因，即它们都具有毒杀鞘翅目害虫的作用. 另外，Cry7Aa1与Cry8EAa1表面电势分布差异较大，毒素的表面电势分布会影响其与昆虫中肠道细胞膜上蛋白类受体的结合，进而影响到蛋白与DNA的结合. 这可能导致两种毒素产生不同的毒力.结构域Ⅲ具有两个反平行的β片层的三明治结构，功能较多，目前还不是很明确. Lee等[16]用Ala替换Cry1Ac DomainⅢ上503~525位的氨基酸残基检测其在毒力和受体结合方面的作用. 发现Q509NR511、Q509、R511和Y513突变为Ala 后毒力与BBMV的结合亲和力降低，所有突变株在胰蛋白酶或中肠液处理时都能产生稳定的毒素片段，结果表明Q509、Q511和Y513在与受体的初始结合中起作用. 作者以前的研究发现了Cry1Ac5蛋白结构域Ⅲ上的β18-β19 loop结构的特殊性[17]，突变子W544F的原毒素明显地增加了蛋白对紫外线、胰蛋白酶和存贮的稳定性. Cry7Aa1 与Cry8EAa1同样在结构域Ⅱ上存在相对较大差异，可能会导致两者在与受体的亲和力和稳定性方面存在差异. 进而产生不同杀虫效果. 参考文献：[1]Hofte H, Whiteley H. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis[J]. Microbiol Rev, 1989, 53(2): 242-255.[2]Roh J Y, Choi J Y, Li M S, et al. Bacillus thuringiensis as a specific, safe, and effective tool for insect pest control[J]. JMicrobiol Biotechnol, 2007, 17(4): 547-559.[3]Wei J Z, Hale K, Carta L, et al. Bacillus thuringiens is crystal proteins that target nematodes[J]. 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苏云金芽孢杆菌

本文对农业上研究最多、用量最大的两类微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）和昆虫杆状病毒（baculovirus）进行了综述，分别论述了它们的杀虫优势、杀虫的分子机理、目前的研究状况，并对它们的基因工程技术改良路线以及在农业上的应用，提出了一些建议。

由病虫害引起的农作物的减产减收已成为制约农业生产进一步发展的限制因素，全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的13％，而目前对农作物害虫的防治主要依赖于化学农药。

完全依赖化学杀虫剂存在许多弊端，其中最主要的问题是，一种化学物质的广泛使用会使害虫的后代产生选择性进化优势，从而对该化学物质产生抗性。

例如，世界各地的家蝇品系对杀灭它们的每种杀虫剂都产生了抗性。

第二个问题是，有的杀虫剂影响非靶目标品种，产生灾难性后果，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长。

第三问题是在于环境的耐受性和许多杀虫剂的毒性，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁。

上述不利因素促使人们急欲寻求控制害虫的替代方案。

在对农业害虫进行的长期防治实践中，人们逐渐认识到必须采取综合治理的措施，才能有效的控制害虫的危害。

基因工程技术的发展，为防治农林害虫提供了一种有效、减污的新技术手段，微生物农药也因此在世界范围内受到广泛重视。

微生物农药是指非化学合成、具有杀虫防病作用的微生物制剂，如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素，等等。

这一类微生物包括杀虫防病的细菌、真菌和病毒。

杀虫微生物是指其代谢产物或微生物本身对宿主昆虫有致死效应或致病的微生物类群，通常也称为昆虫病原微生物。

目前已知的杀虫防病微生物主要有芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、链球菌科和杆状病毒科等类群。

尽管不同杀虫微生物引起昆虫致病的症状不尽相同，但杀虫微生物对害虫的作用方式主要是通过产生特异性的杀虫毒素来破坏害虫的代谢平衡，或者是通过营养体在虫体内的繁殖复制而引起昆虫死亡和发生流行病。

苏云金芽孢杆菌杀蚊菌株研究进展

基因组学与应用生物学,2020年，第39卷，第10期，第4614-4623页评述与展望R e v i e w a n d Progress苏云金芽孢杆菌杀蚊菌株研究进展周燕朱英芝姜明国^广西民族大学海洋与生物技术学院，广西多糖材料与改性重点实验室，南宁，530008*通信作者,*****************摘要苏云金芽孢杆菌作为生物杀虫剂己有近百年历史，其杀虫谱包括从鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目到线虫甚至是癌症细胞，对农林业生产以及医学领域研究具有非常重要的作用。

全球每年死于蚊媒疾病的数目惊人。

本综述首先介绍了首个被发现对双翅目幼虫具有杀蚊活性的苏云金芽孢杆菌以色列亚种，详细叙述了该菌株的杀虫功能、菌株特点以及含有的多种杀虫毒蛋白基因；随后概述了报道的其他杀蚊菌株和杀蚊毒蛋白；还揭示了苏云金芽孢杆菌杀蚊菌株Cry/C y t杀蚊毒蛋白的作用模式，为有关苏云金芽孢杆菌杀蚊菌株的研究提供借鉴。

关键词苏云金芽孢杆菌，杀蚊菌株，fin'，毒蛋白，杀蚊作用模式Advances Research on Bacillus thuringiensis Mosquitocidal StrainsZhou Y a n Z h u Yingzhi Jiang Mingguo*Guangxi Key Laboratory f or Polysaccharide Materials and Modifications, School of Marine Sciences and Biotechnology, Guangxi University f or Nat i o n a l i t i e s,Nanning, 530008* Corresponding author, *****************DOI: 10.13417/j.gab.039.004614A b stra ct Bacillus thuringiensis has been used as a biological insecticide nearly 100 years,and i t s insecticidal spectrum including Lepidoptera,Coleoptera,Hymenoptera,Diptera,Nematodes and even cancer cells.I t has a very important role in agricultural,forestry production and medical research.The number of death from mosquito-borne diseases every year in the world i s staggering.Here,w e firstly introduced Bacillus thuringiensis subsp.israelensis,the f i r s t strain found insecticidal activity against Diptera larvae,and then described i t s insecticide function,strain characteristics as well as i t s insecticidal protein genes in detail.Subsequently, summarized other mosquito-killing strains and mosquitocidal toxic proteins,finally,w e also comprehensively revealed the m o d e action of Cry/Cyt mosquitocidal toxins of Bacillus thuringiensis strains,which provided a reference for the investigation of Bacillus thuringiensis mosquitocidal strains.K eyw ords Bacillus thuringiensis,Mosquitocidal strain,Bti,Toxic protein,M o d e action of mosquitocidal蚊子是人类可怕疾病的重要传播媒介，世界卫生组织宣布蚊子为“头号公敌”(W H O, 1996, Report of W H O informal consultation on the evaluation and testing insecticides.C T D/W H O P E S/IC/96.)。

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ＡｎｌｓｓｏｃｌｕｈｕｉｇｅｓｓＳｒｉｓＣｏｔｉｉｒＧｅｅａｙｉｆＢａｉｓｔｒｎｉｎｉｔａｎｎａｎｎｇｃｙ７ｌｎ
ＳＮｉｇＧＯＬ—ｅ，ＵＪｎｐｎ，Ｎｉ—ｉｇＷＡＧＨｉＯＧＰｎ，ＵｉｉＳｕ —ｉｇＷＡＧＱｎｙ，Ｎｕｗ０１０）７０１
摘要：我室所保存的１对８株含ｃ７基因的菌株进行晶体形状、物活性和蛋白型基因型等进行分析。结果表ｒ类ｙ生明：些菌株能产生菱形、菱形和不规则形伴胞晶体，Ｄ－ＡＥ检测主要蛋白的分子量是１０ｋａＰＲ扩增得到这小ＳＳＰＧ３Ｄ，Ｃ
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ｌＲＩＵＴＲＥ华北农学报－２２４）：０— ｉＣＬＵＡＢ０１０，５（４４３
含ｃｙｒ７类基因的苏云金芽胞杆菌菌株的分析
宋萍，丽伟，郭苏俊平，勤英，王王晖
ｔｌｓａｅｗｅｅｐｅｅｔｄｉｈｓｔａｎ．ｘｎｆｏＢｔｓｒｉｐｅｒｄｔｏｔｉｒｍｉｅｔｐｏｅｎｂｎｔａｎｏａｈｐｒｒｓｎｅｎｔｅｅｓｒｉｓＴｏｉｍｔａｎａｐａｅｏｃｎａｎａｐｏｎｎｒｔｉａｄａ－ｒ
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１３０ｂ０ｐ条带。对马铃薯瓢虫二龄幼虫的生物活性测定结果表明，株ＷＺ９具有很高的杀虫率，２ｈ校正死亡率达菌－７到了９．％；株ＷＣ一３１菌Ｇ１０活性次之，２ｈ校正死亡率达到４．％，其他菌株杀虫活性低或没有活性。对杀虫活性７４８而最高的ＷＺ９菌株扩增全长基因，到ｃ７ｂ－得ｒＡ３基因（ｅＢｎｕｂｒＢ０５８）ｙＧｎａｋＮｍｅ：Ｉ１１８。１关键词：云金芽胞杆菌；ｙ苏ｃ７基因；铃薯二十八星瓢虫ｒ马中图分类号：７Ｑｓ文献标识码：Ａ文章编号：００一１０
（ｏｌｇｆＰａｔＰｏｅｔｎＡｒｕｔｒｌＵｉｅｓｙｏｂｉＢｏｉｇ００，ｈｎ）Ｃｌｅｏｌｎｒｔｃｉ，ｇｉｌａｎｖｒｉｆＨｅｅ，ａｄｎ７Ｃｉａｅｏｃｕｔ１１０
Ａｂｓｒｃ：ｓｄｏｔａｔＢａｅｎＰＣＲａｍｐｉｃｔｎｕｉｇｕｉｅｓｌｒｍｅｓ，ｓｒｉｓｏｔｃｎａｎｉｇｃｙｅｅｗｅｅｏ－ｌｉａｉｓｎｎｖｒａｐｉｒ１ｆｏ８ｔａｎｆＢｏｔｉｎｒ７ｇｎｒｂ
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