植物激素的测定方法共45页文档
植物激素免疫测定指南
植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。
由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。
目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。
植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式（见下图），一种是在固相载体上直接包被抗体（直接法，先包被二抗，再加一抗），另一种是包被抗原（间接法）。
直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。
间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。
间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。
根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。
材料、试剂及设备1 材料各种新鲜植物材料2 仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。
3 试剂(1) 包被缓冲液：称取１.５g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 0.2g NaN3（可不加）, 用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为9.6.(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。
植物激素 整理
植物激素的检测方法1. 生物测试生物测试法是最早采用的植物激素测定方法它是利用植物激素的生理活性通过某些植物的组织和器官对植物激素产生的特异性反应进行测定的。
优点：简便易行也能反映植物激素的生理活性缺点：专一性较差且植物体内含有生长素类似物~ 拮抗物等影响测定的结果需在前处理中尽可能纯化所要测定的组分过程复杂此外重复性差工作量大2. 免疫检测免疫学技术应用于植物激素的测定有力地促进了激素定量研究的发展它的基本原理是利用抗原和抗体的特异性竞争结合。
优点：了检测灵敏度可检测出10-12 g 的微量物质相应其前处理也得到了简化又改善了测定的专一性。
缺点：抗体的制备较复杂。
3.物理化学方法物理化学方法分光谱法和色谱法两种1）分光谱法：主要有紫外吸收光谱~ 红外吸收光谱和荧光法优点：灵敏度高缺点：专一性差2）色谱法：利用物质在不同介质中的分配原理进行测定的，包括纸上层析，薄层层析(TLC) ，气相色谱(GC) ，高效液相色谱(HPLC) 以及气质联用(GC-MS) 等，将分离和测定结合起来是色谱法的基本特点。
（1）纸上层析和TLC：优点：设备简单易操作缺点：分离效率和灵敏度有限制（2）G C 和HPLC：是在纸上层析和TLC 的基础上装备了商品化的色谱柱和检测器，保证了检测方法的专一、灵敏和准确（3）GC 和HPLC 方法:分析植物激素, 灵敏度和选择性高, 重复性好, 但对前处理要求较高; 又因保留时间的分辨有一定限制, 若达不到所需纯度要求可能会出现多种化合物的保留时间相同或接近而影响测定结果。
（4）在植物激素的理化检测中, 仪器联用是当代的发展趋势：最常用的结合系统是气相色谱-质谱联用(GCMSD，技术, 它是目前最为可靠的激素检测方法, 还可验证其它测定方法的可靠性, 而且还可鉴定未知物质的结构，但需经冗长的样品纯化程序, 设备昂贵, 使用和维护成本高。
此外有气液相色谱( GLCD 配以火焰热离子检测器(FTDD 快速灵敏地对植物细胞分裂素定量测定[25], 也有薄层色谱与气相色谱结合分析ABA。
植物激素检测技术—科标检测【范本模板】
植物激素检测技术——科标检测植物激素是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，它在植物的某一部位产生，运输到另一个或一些部位，在极低的浓度下便可引发生理反应，几乎参与了调控植物从种子休眠、萌发、营养、生长和分化到生殖、成熟和衰老的每个生命过程,既可调控植物自身的生长发育，又通过与植物所生存的外部环境互相作用调节其对环境的适应。
通过调控如细胞分裂素、油菜素内酯和生长素等植物激素的代谢可显著地改良作物的株型结构和产量构成，从而大幅度提高作物产量和品质。
青岛科标检测研究院—-生物实验室，拥有先进的仪器设备和丰富检测经验，根据国内外先进技术，可以根据不同样品不同检测需求，值得最优检测方案为企业和研究机构提供精确、公正的数据支持.1 植物激素主要包括生长素（auxin）、赤霉素(gibberellin，GA)、细胞分裂素（cytokinin,CTK)、脱落酸（abscisic acid，ABA）、油菜素甾醇类（brassinosteroids，BRs）、茉莉酸（jasmonic acid，JA)及其甲酯（MeJA)、水杨酸类(salicylic acids,SA)、乙烯(ethylene)和多肽激素（peptide hormones)等,它们在植物体内的含量极低（通常在ng/g，甚至pg/g水平上),且周围共存的基体成分非常复杂，几乎不可能同时分析所有植物激素.此外,多数植物激素的性质不稳定，对温度等外界条件敏感，在各器官中呈现定的动态分布。
因此精确可靠地对超微量的植物激素进行定性和定量分析尤为重要.本文仅就近年来国内外在茉莉酸及其甲酯、脱落酸、生长素、赤霉素和多肽激素等植物激素分析检测技术的最新发展及应用情况进行综述。
2 主要分析技术生物鉴定法是一类经典的植物激素检测方法,它利用激素作用于植物的组织或器官时产生的特异性反应对植物激素进行测定。
1928年，Went首先将这种方法运用于生长素的测定，利用生长素能使燕麦胚芽鞘弯曲的特性来测定生长素浓度。
植物激素的测定方法-精品文档
二、免疫球蛋白的分子结构
免疫球蛋白的基本结构
• 四肽链结构 ，链间二硫键连接 • 两条重链（H）和两条轻链（L） • 氨基端和羧基端。
可变区与恒定区
• 根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（V）和恒定区（C） • 可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较 大 • 恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序 及 含糖量都比较稳定
注意事项 ：
（ 1 ）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差 较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分 混匀反应。 （ 2 ）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤 不完全。 （3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。 （ 4 ）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴， 否则出现较大误差。
测定标准物各浓度和各样品490nm
处的OD值。
数据分析
在波长 450nm 处分别读取各标准孔和样本孔 OD 值， 以 OD值为横坐标，“标样激素含量的对数”为纵坐
用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的
利用反对数求得ABA的绝对含量。
OD值在标准曲线上查出待测样品的 ABA含量的对数。
植物激素的酶连免疫分析法
几种酶标分析仪
DNM-9602G酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602 标配酶标分析仪
操作步骤
包被---温育---洗涤---竞争--温育---洗涤---加二抗---温育--
-洗涤---显色---比色---计算
包 被
• 每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后
植物激素的测定方法？
生物活性法 气相色谱（气-质联机） 液相色谱（液-质联机） 酶连免疫法（ ELISA 法）
植物激素的测定方法
加 抗体
➢在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加 50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。
➢竞争条件37℃左右0.5h。
洗板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一 次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着 加第2次。共洗涤3次。
加“二抗”
将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释 液中（比如稀释倍数1:1000就加10μl），混 匀后，在酶标板每孔加100μl，然后将其放入 湿盒内，置37℃下，温育0.5h。
4、制备生物导弹用于肿瘤、 移植等的临床治疗。
六、人工制备的抗体
• 多克隆抗体：多个抗原决定基——机体—— 多种抗体的混合物
• 单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）：由一个B细胞克隆产生的、针对 某一特定抗原决定簇的高度特异性抗体
• 基因工程抗体
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免 疫学诊断的敏感性
植物激素的酶连免疫分析法
几种酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602G酶标分析仪 DNM-9602 标配酶标分析仪
操作步骤
包被---温育---洗涤---竞争--温育---洗涤---加二抗---温育--洗涤---显色---比色---计算
包被
• 每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后 将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷 盘内。
间接ELISA
双抗夹心法
放射性同位素：
125I、131I 酶：辣根过氧化物 酶、硷性磷酸酶
荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄 绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹 明（红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA） 液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）
植物激素检测
植物激素检测植物激素是植物体内自身合成的可调节植物生理反应的活性物质。
在植物体内含量甚微且组成复杂，相互共存的干扰组分多。
已知植物体内产生的激素有六大类，即生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯和油菜素甾醇，虽都是简单的小分子有机化合物，但生理效应复杂、多样。
迪信泰检测平台使用高效液相色谱(HPLC)的方法，使用Agilent 1260 Infinity型高效液相色谱仪对样品进行分离，蒸发光散射检测器(ELSD)或DAD检测器对样品进行鉴定，实现对植物激素高效、精准的测定。
此外，迪信泰检测平台还提供LC-MS测定植物激素服务，以及植物激素系列检测试剂盒产品，以满足您的不同需求。
植物激素类检测项目玉米素（ZA）检测赤霉素（GA）检测吲哚乙酸（IAA）检测脱落酸（ABA）检测水杨酸（SA）检测茉莉酸（JA）检测生长素（Auxin）/植物生长激素检测细胞分裂素（CTK）检测玉米素核苷（ZR）/反式玉米素核苷（TZR）检测吲哚丁酸（IBA）/吲哚-3-丁酸检测6-苄氨基腺嘌呤/6-苄氨基嘌呤（6-BA）检测激动素（KT）检测萘乙酸（NAA）检测异戊烯基腺嘌呤（IP/2ip）检测异戊烯基腺嘌呤核苷（IPA/2ipr）检测结合吲哚乙酸检测结合脱落酸检测水杨酸甲酯（MESA）检测茉莉酸甲酯（MeJA）检测油菜素内酯/芸苔素/油菜素甾醇（BR/BL）检测独角金内酯（SLs）检测乙烯（ETH）检测褪黑素(MT)/褪黑激素/褪黑色素检测HPLC测定植物激素样本要求：1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL，测定样品不返还，请您保留备份。
周期：2~3周项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：1. 实验步骤（中英文）2. 相关质谱参数（中英文）3. 质谱图片4. 原始数据5. 植物激素含量信息。
植物激素及其检测技术
植物激素及其检测技术什么是植物激素？植物激素是植物合成的一类痕量有机化合物，他们在极低的浓度下就能引发生理反应，在植物的生长发育和环境应答中具有非常重要的作用。
他们几乎参与了植物的每个生命过程，包括种子休眠、萌芽、营养、生长、分化、生殖、成熟和衰老。
1928年，温特证实了首个植物内源激素——生物素的存在，随后其他植物激素陆续被科学家发现。
以前，人们将植物内源激素分为五大类：生长素（auxins）、赤霉素（gibberellins）、细胞分裂素（cytokinins）、乙烯（ethylene）、脱落酸（abscisic acid）。
前三类激素能促进植物的生长发育，乙烯主要促进植物器官成熟，而脱落酸抑制生长发育。
水杨酸（salicylic acid）油菜素内酯（brassinosteroids）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、多胺（polyamines）、酚类（phenolic compounds）、独角金内酯（Strigolactones）等植物激素陆续被发现。
图1. 植物激素。
表1. 主要的植物激素及其代表化合物的分子结构、名称及含量范围（李艳华2011）。
为什么要检测植物激素？一方面，植物激素对于植物生长、发育和对环境响应起着非常重要的调控作用。
另一方面，植物作为重要的农业产品、园艺产品等，植物激素（如细胞分裂素、生长素、油菜素内酯）能显著调节植物的株型结构和产量构成，从而大幅提升作物的产量和品质，茉莉酸、水杨酸、油菜素内酯等多种激素在植物对抗病虫害中发挥重要作用。
因此植物激素的定性、定量在研究植物激素作用机理、植物生命过程、提高农产品/园艺植株质量、和人类定向植物改造方面起到重要作用。
但是植物激素检测具有以下几个难点：1、作为植物的次生代谢产物，含量极低。
1g鲜样中的通常为ng级植物激素，甚至pg级；2、不同样本含量差异大；样本越新鲜越好。
3、基质效应干扰严重。
基质是样品中分析物以外的组分，常对分析物的分析鉴定产生干扰，影响结果的准确性，这种干扰被称为基质效应。
激素测定方法
激素的测定方法参考王学奎（2015）《植物生理生化实验原理与技术》一书中的高效液相色谱法，以2016年采自尚志市水稻田的野慈姑球茎为材料，6-12月每个月测定一次野慈姑球茎内CA3和ABA的含量。
试验材料的处理称取1-2g样品，在冰浴下研磨匀浆，加入80%的预冷甲醇20ml，保鲜膜密封，在4℃冰箱里冷浸过夜。
浸提液抽滤，10ml甲醇润洗研钵2次，过滤后与浸提液合并，40℃下减压蒸发至没有甲醇残余。
剩余水相完全转移到三角瓶中，用30ml石油醚萃取脱色2次，弃去醚相。
加0.01gPVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮，crosslinked polyvinylpyrrolidone），超声30mim，抽滤用30ml，乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，40℃下减压蒸干。
用甲醇（色谱纯）溶解残留物并定容至2ml，经0.45μm微孔滤膜过滤得待测液，保存于4℃冰箱中。
测定（1）标准曲线的绘制取一定量GA3和ABA标准品，用甲醇（色谱纯）溶解，配制成不同浓度的溶液，点击“运行控制”菜单，再选择“运行方法”，手动或自动进样器进样10-30μL，进行液相检测分析。
在一定浓度范围内，4种激素峰面积与浓度呈良好线性关系时，即可绘制标准曲线。
（2）取同样体积的待测样品，进样。
待样品峰全部出完，冲洗30min待基线平直后，即可分析下一个样品。
（3）定性根据标准品的保留时间判断样品中的对应激素峰。
选择与已知标样具有相同保留时间的样品的峰面积，并根据对应的标准曲线查出对应激素的浓度ρ（μg/mL），然后根据下式计算鲜样（FW）中各激素的含量：样品中激素含量（μg/kg FW）=ρ·V Tm·V S式中：ρ为根据样品峰面积从标准曲线查得的对应激素浓度（μg/mL）；V T为待测样总体积（mL）；V S为进样量（μL）；m为样品鲜质量（g）。
植物激素生物测定
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1、水稻幼苗叶鞘伸长“点滴”法
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2、大麦胚乳法
大麦种子吸水萌动后，胚中产生的赤霉素 将胚乳最外的糊粉层中的α -淀粉酶激活。 无胚的大麦半粒种子不能产生赤霉，因此 没有α -淀粉酶活性。它被成功地应用于 赤霉素类物质的测定。
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2、大麦胚乳法
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3、矮生玉米叶鞘法
以赤霉素浓度的对数为横坐标,叶鞘长度的 对数为纵坐标。
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2、苋红素合成法
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2、苋红素合成法
注意： 1、尾穗苋黄化苗对光十分敏感，整个试 验需在暗室内进行。 2、尾穗苋种子有较长的休眠期，新收获 的种子不能发芽。可放在冰箱中经2-3个 的低温处理后发芽使用。
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3、组织培养鉴定法
经典方法之一。 大豆愈伤组织、烟草茎的髓部、胡萝卜根 韧皮部等都对细胞分裂素有较高敏感性。 此法专一性强，缺点是需时较长。
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第五章：植物激素的生物测定
生物测定法是通过测定激素作用于植株或 离体器官后所产生的生理生化效应的强度， 从而推算植物激素含量的方法。
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第五章：植物激素的生物测定
植物激素的生物测定法要求有较强的专一 性, 较高的灵敏性和较短的实验周期, 尤 其是对粗提物的未知激素的粗筛, 常可得 到定性定量的相对结果。测定时, 对环境 条件和植物材料都有较严格的要求。
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三、细胞分裂素的生物测定法
细胞分裂素(cytokinins)是植物体内普遍存 在的一类激素，其生理作用主要是促进细胞 分裂和扩大，延迟叶片衰老。 细胞分裂素生物测定依据： A：细胞分裂，细胞数目增加或组织增重； B：细胞扩大，即体积的增加； C：延迟叶片衰老，即叶绿素的降解延缓； D：诱导素的合成，即苋红素的合成。
植物激素的检测方法
比色谱法是最早应用于生长 素分析的光谱法，但由于该法选 择性差，现很少被应用。荧光分 析法是进行痕量、超痕量甚至分 子水平上分析的重要手段，它具 有选择性好、取样少、灵敏度高 以及简便快速等优点，近年来在 植物激素分析中得到广泛应用。
电化学分析法
电化学分析法相对于气相色谱(GC)、液相色 谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、免疫法等分析方法具 有简单、方便和仪器价廉等特点. 在早期的研究中, 植物激素的电化学分析方法主要是针对脱落酸、赤 霉素、玉米素和激动素等植物激素标准品的电化学 行为进行探讨. 通过研究发现, 植物激素存在的本底 溶液的性质和pH 对测定结果会产生很大影响。
色谱法和光谱法
色谱法
光谱法
色谱学是利用物质在不同介质中的 分配原理进行测定的, 包括纸上层析、薄 层层析( TLC)、气相色谱( GC)、高效相 色谱( HPLC) 以及气质联用( GC-M S) 等, 将分离和测定结合起来是色谱法的基本 特点。根据色谱学理论, 某种化合物在一 定色谱条件下的出峰时间(保留时间) 是 固定的, 这是色谱学定性的依据； 而色 谱峰面积(或峰高) 与物质的含量(或总量) 成正比, 这是色谱学定量的基础。
植物激素 的 检测方法
目录
CONTENTS
01
02
03
04
植物 激素 定义
植物 激素 分类
植物 激素 检测 方法
参考 文献
1
植物激素的定义
植物激素的定义
天然植物激素或内源性植物激素, 是植 物自身代谢产生的一类具有高度生物活 性的有机小分子化合物. 它们一般先在 植物的某一部位合成, 然后再转运到其 他部位去发挥作用。植物激素虽是小分 子, 却调控着几乎整个植物生命周期, 如 种子萌发、茎叶伸长、果实成熟以及脱 落等生理过程。植物激素还能感应植物 所处生存环境的外界刺激, 如水分、光 照、温度和损伤等, 并作出相应的反应。