(6)植物激素测定法
【论文】高效液相色谱法检测植物激素方法的建立
摘要植物激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的几类微量有机物质。
也被称为植物天然激素或植物内源激素。
它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面，分别或相互协调地调控植物的生长、发育与分化。
由于它在植物体内含量甚微，一般水平为1000 ng/g鲜重，建立一种有效，简便的检测方法对于研究植物激素具有指导性意义。
目前植物激素的定性和定量分析主要以理化方法为主，理化测试法包括气相色谱法、液相色谱法、气象－质谱联用等。
本次研究是利用高效液相色谱法来检测植物体内的酸性激素，即吲哚乙酸IAA,吲哚三丁酸IBA，赤霉素GA3,以及脱落酸ABA。
以HPLC进行分析测试，非常适合用于分析那些不能汽化或者在易于裂解不稳定的物质，用HPLC分析植物激素（IAA、IBA、GA3、ABA），采用二极管阵列检测器检测，本次研究的前处理方法为固相萃取法。
通过本次实验，得到了一种简便易操作的前处理方法，找到了液相色谱的最佳工作条件，并通过检测实际样品，证明了该方法是一种有效可行的植物酸性激素的定性定量分析方法。
关键字：植物激素，提取，高效液相色谱。
AbstractPlant hormone is several kinds of trace of organic matter that synthesized in the plant,and it have significant effect on plant growth. They separately or coordinatively regulate of plant growth, development and differentiation. Because it is a trace contect in plants and general level, 1000 ng / g in fresh weight. Therefore, the establishment of an effective and simple detection method for the study of plant hormones is very significant.Present plant hormones qualitative and quantitative analysis mainly based on physical and chemical methods, physical and chemical testing methods including GC, HPLC, GC-MS.with high performance liquid chromatography, the acidic hormones of IAA, indole-3 butyric IBA, gibberellic acid GA3, and ABA in plants are detected. It is suitable for the analysis of those which do not vaporize easily at high temperatures by HPLC. Analysis of plant hormones (IAA, IBA, GA3, ABA), usually use UV monitor testing, and this study of pre-treatment method for solid phase extraction.A simple and easy pre-treatment methods was established, and found the best conditions for liquid chromatography.With detecting the actual samples, Iit shows that it is the feasible and effective method of the acidic hormones analysis .Key words: plant hormones, extraction, detection, HPLC.目 录第一章 前 言 (1)1.1 植物激素的研究背景与意义 (1)1.2 植物激素的种类及性质 (1)1.2.1植物激素概述 (1)1.2.2植物激素——生长素 (2)1.2.3植物素——赤霉素 (3)1.2.4植物激素——细胞分裂素 (4)1.2.5植物激素——脱落酸 (4)1.2.6植物激素——乙烯 (4)1.3液相色谱法的研究 (5)1.3.1液相色谱仪 (5)1.3.2 液相色谱法的主要类型 (8)第二章 实验材料与方法 (11)2.1仪器与试剂 (11)2.2 实验方法 (11)2.2.1 芽样品激素含量的测定 (12)2.2.2种子样品激素含量的测定 (12)2.2.3 C18柱系统的处理及使用（需临时处理） (12)2.2.4 高效液相色谱分析 (12)2.2.5溶液的配制 (13)2.2.6 标准曲线的测定 (14)2.2.7 稳定性实验 (15)2.2.8回收率的测定 (16)2.2.9 检出限的测定 (16)第三章 实验结果与讨 (17)3.1标准曲线的绘制 (17)3.1.1 IAA标准曲线的绘制 (17)3.1.2 IBA标准曲线的绘制 (17)3.1.3 ABA标准曲线的绘制 (18)3.1.4 GA3标准曲线的绘制 (19)3.2稳定性实验 (20)3.3 实际样品激素含量测定 (21)3.4回收率的测定 (22)3.4.1 GA3回收率谱图 (22)3.4.2 IAA回收率谱图 (23)3.4.3 ABA回收率谱图 (24)3.4.4 IBA回收率谱图 (24)3.5 检出限的测定 (25)第四章 结论 (27)参考文献 (28)致谢 (30)第一章前言1.1 植物激素的研究背景与意义植物激素是存在于植物体内的具有调节植物生长发育作用的微量元素。
植物激素配制实验报告
本实验旨在学习植物激素的配制方法，掌握不同植物激素的溶解特性及其在植物组织培养中的应用。
通过本实验，了解植物激素在植物生长和发育过程中的作用，以及如何根据实验需求准确配制不同浓度的植物激素溶液。
二、实验原理植物激素是植物体内的一种微量有机物质，对植物的生长发育和生理过程起着重要的调节作用。
本实验涉及的主要植物激素包括生长素（IAA）、细胞分裂素（6-BA）、赤霉素（GA3）等。
这些激素在植物组织培养中具有重要作用，如诱导愈伤组织形成、促进生根、芽分化等。
三、实验材料1. 植物激素：IAA、6-BA、GA32. 溶剂：乙醇、蒸馏水、NaOH溶液3. 实验器具：电子天平、容量瓶、移液管、试管、烧杯、玻璃棒等四、实验方法1. 植物激素母液的配制（1）IAA的配制：准确称取IAA 1g，溶于200ml 95%乙醇中，搅拌至完全溶解。
然后转移至1000ml容量瓶中，加水定容至刻度线，摇匀。
此溶液为1000mg/L的IAA母液。
（2）6-BA的配制：准确称取6-BA 1g，溶于50ml 0.5mol/L NaOH溶液中，微热溶解。
然后转移至1000ml容量瓶中，加水定容至刻度线，摇匀。
此溶液为1000mg/L 的6-BA母液。
（3）GA3的配制：准确称取GA3 10mg，溶于1ml 95%乙醇中，搅拌至完全溶解。
然后转移至100ml容量瓶中，加水定容至刻度线，摇匀。
此溶液为100mg/L的GA3母液。
2. 植物激素工作液的配制根据实验需求，将母液稀释至所需浓度。
例如，配制100mg/L的IAA工作液，取10ml 1000mg/L的IAA母液，加水稀释至100ml。
1. 称取适量植物激素，根据实验需求选择合适的溶剂进行溶解。
2. 将溶解后的激素溶液转移至容量瓶中，加水定容至刻度线，摇匀。
3. 根据实验需求，将母液稀释至所需浓度，配制工作液。
4. 使用移液管准确量取所需体积的工作液，用于植物组织培养实验。
六、实验结果与分析1. 通过本实验，成功配制了不同浓度的植物激素母液和工作液。
植物激素(Plant_hormones)
2．物理和化学方法 植物激素的测定分析采用薄层层析、气相
色谱（gas chromatography，GC）、高效液相层析（high liquid performance chromatography，HPLC）、质谱分析（mass spectrography，MS）等，其原理大都是基于不同物质在不同介质中 的分配系数。测定生长素含量可以达到10-12g的水平。如GC测定乙 烯含量；气质联谱（GC-MS）分析赤霉素。
二、植物激素的种类及相互之间的作用 目前公认的植物激素有五大类： 生长素类、赤霉素类、细胞分裂素类、乙烯、脱落酸。 植物体内存在油菜甾体类（BR）、多胺（PA）、茉莉酸 （MJ）、水杨酸（SA）、寡糖素等也具有近似激素的特性。 我国科学家发现玉米赤烯酮等 起初人们认为某一种植物生理作用具有专一性。例如生长素 促进细胞体积扩大；赤霉素促进茎伸长生长；细胞分裂素促 进细胞分裂；脱落酸促进休眠以及乙烯促进果实成熟等。后 来发现上述每一种生理现象的控制因素极为复杂，不是一种 激素起一种作用，是各种激素之间相互作用的综合表现。
2.
不同激素间的拮抗作用
不同激素间的拮抗作用，生长素与细胞分裂素对植物顶端优势有 相反的效应，生长素与乙烯对叶片脱落也有相反的作用，脱落酸对生 长素、赤霉素或细胞分裂素的生理作用也有分别的拮抗作用。
3. 某种激素通过影响其它激素的合成、运输及代谢而改 变后者浓度。
生长素提高乙烯：较高浓度的生长素对植物体内乙烯合成有显著的 促进作用，生长素提高乙烯合成效率，乙烯抑制生长素在植物体内运 输并影响生长素的代谢。 GA与生长素：GA抑制生长素结合态的形成及氧化酶的活性，从而提 高生长素的浓度；赤霉素则能促进生长素的生物合成作用。
激素特点： ①产生于植物体内特定部位，是植物正常生长发育过程中或特殊环境下 的代谢产物；
植物生理学植物激素
存在形式
游离态 —自由生长素
结合态－与IAA形成的羧基衍生物，吲哚乙酸衍生物。
（吲哚已酰葡萄糖、吲哚已酰天氡氨酸、吲哚已酰肌醇）
储藏形式 运输形式
束缚态－与细胞颗粒，受体蛋白，其它高分子化合物以 共价健复合。
4．合成部位、运输和氧化
主要合成部位与分布： 分生组织、正在生 长的幼嫩部分（茎 尖、芽、正在发育 的种子、幼叶） •运输 •被动运输：成熟叶子中 合成的IAA经由韧皮部 向上或向下被运输到其 他部位。无极性，为被 动运输形式。
苄基腺嘌呤 （BA）
2．代谢
合成－通过腺嘌呤合成的途径合成腺嘌呤， 侧链来自类萜途径中所产生的甲瓦龙酸。 乙酰辅酶 A 甲瓦龙酸 异戊烯基
3．合成部位和运输
主要合成部位：根部的根尖（随木质部蒸腾流上升）、嫩 梢。果实和种子里含量虽多，但并没有证明能合成。 运输为非极性的： 外施的CTK向周围运输不显著。
AUX 、CTKS、GAS 促进生长； ABA 抑制生长；乙烯 促进成熟和衰老。
生长调节物：
人工合成的具有类似植物激素生理活性的化合物。 如矮壮素、2.4－D、－萘乙酸等。
第一节 生长素类
1．发现 2．种类 3．代谢和存在形式 4．合成部位和运输 5．生理作用 6．作用机理
（4）针叶树开花：用于种子园。GA3/7＋萘乙酸（100：1）
开花、结实。
第三节 细胞分裂素
1．概况 40 年代， Skoog 等，用烟草茎成熟的髓组织组培时发现细 胞不能进行分裂，加入 IAA 之后，细胞只伸长、增大，不分 裂。认为另有一种促进细胞分裂的物质。 50年代，发现椰子乳等植物组织液能促使髓细胞发生分裂 。Miller首次从动物体液中分离出一种能促使细胞分裂的物质 －激动素，并且证实了其结构，是一种腺嘌呤衍生物。 60年代，先后从植物体中分离出许多类似的腺嘌呤的衍生 物，都能引起植物细胞的分裂，称为细胞分裂素类。目前已 发现20多种。 有玉米素（ 1963年新西兰Letham，玉米）、玉米素核 苷（椰子乳）、二氢玉米素（羽扇豆）、异戊烯基腺苷（菠 菜、豌豆）、苄基腺嘌呤（人工合成的）
植物激素的hplc测定标准曲线的制作
植物激素的hplc测定标准曲线的制作
制作植物激素的HPLC测定标准曲线主要包括以下步骤：
1. 准备工作
- 购买合适纯品植物激素标准品，例如植物生长素（IAA）、生长素酸（IAA）、脱落酸（ABA）等。
- 找到合适的溶剂用于制备标准品的浓度梯度溶液。
一般情
况下，可以选择高纯度的有机溶剂，如甲醇、乙酸乙酯等。
2. 制备标准品溶液
- 使用分析天平称量适量的纯品植物激素到不同容量的瓶中。
- 使用溶剂逐一溶解不同容量瓶中的植物激素，制备出一系
列浓度梯度的标准品溶液。
3. 准备HPLC流动相
- 根据HPLC仪器说明书的要求，配置合适的流动相。
一般
情况下，可以选择有机溶剂和缓冲溶液的混合物作为流动相。
4. 进行HPLC分析
- 调整HPLC仪器的参数，如流速、柱温、检测波长等。
- 依次注入不同浓度的标准品溶液到HPLC仪器中，记录各
自的保留时间和峰面积。
5. 绘制标准曲线
- 将标准品溶液的浓度与相应的峰面积进行线性回归分析。
- 通过线性回归方程计算植物激素在样品中的浓度。
需要特别注意的是，在制作植物激素的HPLC测定标准曲线时，应保证各个工序的操作的高度准确和可重复性。
同时，应注意选择适用的HPLC仪器和柱以及合适的检测波长。
不同的植物激素可能需要不同的分析条件，所以在制作标准曲线之前最好先进行一些预实验以确定最佳的分析条件。
藻类中植物激素的分离、纯化和测定
理 论研 究苑
科２ １ ２年 ６ ０ 巍霾 １第 期 群
藻类中植物激素的分离、纯化和测定
邵曼玮
（ 贵阳护理职业学 院卫管 系，贵州贵阳 ５ ０ ８ ５ ０ １）
摘
要 高等植物 中的激素研 究取得 了大量成就 ，而藻类 中 植物激素 的研究远远落后 于高等植物 ，制约了人们对 海洋植物 资
中含有 乙烯 。 乙烯 在生 物学 系统 中充 当一个 信 号 分子 的角 色 ，具 有 “ 激 遇 而增 ，信息 应 变” 的性 质 和 作用 。近几 年 的研 究 发现 ，各 种 环境 胁 迫 都 能 引 起 乙烯 产 生 量 的 增 加 ，如 ：机 械 胁 迫 、低 温 、水 、
细胞 分类 素又 称 细胞 分 裂素 ，它是 具 有生 理 活性 的 一类 嘌 呤 衍 生物 。早在 １６ 年Ｊｎｉｇ就对 昆布等 褐藻 和沙菜 等 红藻 中 的内 ９ ９ ｅｎｎｓ 源 细胞 分 裂素 的 含量 和其 作 为植 物 生 长调 节物 质 的作 用 进行 了研 究 。 自此 之后 ，这 方 面的研究 报 道不 断增 多。Ｍｏｎｙ Ｖ ｎＳｅｅ ｏｅ和 ａ ｔ ｎ ｄ 在 １８ 年使 用 Ｈ Ｌ 方法 分析 了海 藻 中 主要有 ｔ玉米 素 、二氢 玉米 ９７ ＰＣ 一 素 、异戊烯腺苷嘌呤和ｔ玉米素核苷等细胞激动素 。１９ 年 日本 一 ９１ 科 学家 Ｆｒｏ ｉ 用 Ｎ 技术 再一 次 证实 了海 藻 中除 了含 有 上 述细 ａｏｑ使 ＭＲ
于海 藻上 的微 生 物产 生 的 。１４ 年 ，Ｔ ｉ ａｎ Ｓｏｇ 现生 长素 ９０ ｈｒ ｎ 和 ｃｏ发 ｍ 在 植物 组织 中 以多种 化学形 式存 在 ，但最 可能 的活性 形式 是Ｉ Ａ Ａ 。 ＩＡ Ａ 能在植 物 中起到快 速 的反应 （ 如使细 胞增 长 ），也能 起到 长期 的反 应 （ 细胞 分 裂 和分 化 ）。后来 ，随着 分 离技 术 的发 展 和研 如 究 的深 入 ，陆续 又有 一些 生长素 被 鉴定 来 。 生长 素在 藻 体 中 的含 量与 海 藻 所处 的发 育 阶段 和 藻 体 的部位 有 密切 的关 系 。通 常处 在 发育 阶段 和生 长 季节 的海 藻 中 生长 素 的 含量 较 高 ，其 合成 部位 主要在 植 物 体 的尖端 。生长 素 在 藻体 内具 有结 合 态和 游 离态 两 种形 式 ，能 够 影响 细胞 形 成层 的活 性 ；增 强 细胞 膜的 渗透性 ；诱 导 乙烯的 生成 。
激素测定方法
激素的测定方法参考王学奎（2015）《植物生理生化实验原理与技术》一书中的高效液相色谱法，以2016年采自尚志市水稻田的野慈姑球茎为材料，6-12月每个月测定一次野慈姑球茎内CA3和ABA的含量。
试验材料的处理称取1-2g样品，在冰浴下研磨匀浆，加入80%的预冷甲醇20ml，保鲜膜密封，在4℃冰箱里冷浸过夜。
浸提液抽滤，10ml甲醇润洗研钵2次，过滤后与浸提液合并，40℃下减压蒸发至没有甲醇残余。
剩余水相完全转移到三角瓶中，用30ml石油醚萃取脱色2次，弃去醚相。
加0.01gPVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮，crosslinked polyvinylpyrrolidone），超声30mim，抽滤用30ml，乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，40℃下减压蒸干。
用甲醇（色谱纯）溶解残留物并定容至2ml，经0.45μm微孔滤膜过滤得待测液，保存于4℃冰箱中。
测定（1）标准曲线的绘制取一定量GA3和ABA标准品，用甲醇（色谱纯）溶解，配制成不同浓度的溶液，点击“运行控制”菜单，再选择“运行方法”，手动或自动进样器进样10-30μL，进行液相检测分析。
在一定浓度范围内，4种激素峰面积与浓度呈良好线性关系时，即可绘制标准曲线。
（2）取同样体积的待测样品，进样。
待样品峰全部出完，冲洗30min待基线平直后，即可分析下一个样品。
（3）定性根据标准品的保留时间判断样品中的对应激素峰。
选择与已知标样具有相同保留时间的样品的峰面积，并根据对应的标准曲线查出对应激素的浓度ρ（μg/mL），然后根据下式计算鲜样（FW）中各激素的含量：样品中激素含量（μg/kg FW）=ρ·V Tm·V S式中：ρ为根据样品峰面积从标准曲线查得的对应激素浓度（μg/mL）；V T为待测样总体积（mL）；V S为进样量（μL）；m为样品鲜质量（g）。
酶联免疫法(ELISA)测定植物激素含量
酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量姓名：李希东专业：植物学学号：200808201 日期：09.5.10 成绩：一、实验目的：掌握间接法测定植物激素的原理和方法；了解逆境对玉米根系ABA和IAA含量的影响。
二、实验原理：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbert assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immuno enzymite technique)的基础上发展起来免疫测定技术。
其建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即①抗原抗体反应的高度专一性和敏感性；②酶的高效催化特性。
ELISA把这二者有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。
间接法是将过量的与蛋白质连接的待测植物激素(实验前将该激素与牛血清白蛋白等蛋白质连接成[激素一蛋白质复合物])吸附在固相支持物上，然后加入待测植物激素和相应抗体，使抗体与待测植物激素及激素蛋白质复合物结合，再加入酶标抗体(标记酶与非特异第二抗体的复合物)，就形成〔蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物〕，加入底物后就生成有色产物，测定其吸光率，可计算待测抗原的量。
如果抗体、激素一蛋白质复合物和酶标抗体的量一定，并且[激素·蛋白质复合物]和待测激素的总量超过抗体的量，那么生成的[蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物]的量就受待测激素含量的限制，因此待测抗原的量将与吸光率成反比。
图A表示间接酶联免疫方法的基本原理：A.间接酶联免疫原理示意图示反应板（固相载体）示激素特异抗体（一抗）示激素（抗原）示非特异二抗示蛋白质·激素复合物示标记酶本实验所采取的方法，则是利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争性结合反应，它的原理可用下式表示:Ab十H十HP=AbH十AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白质复合物。
植物激素的配制方法灭菌方法
α-NAA（a-萘乙酸）可用1M NaOH彻底溶解后，再加水定溶到一定浓度。
除菌方式：与培养基高压共灭菌。
0.2g/L
2，4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）用无水乙醇或1M NaOH彻底溶解后，再加水定容至一定浓度。
除菌方式：与培养基高压共灭菌。
0.2g/L
细胞分裂素
KT（激动素6-糖氨基嘌呤）和6-BA（6-苄氨基嘌呤）先溶于少量1M NaOH中，再加水定容。
配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。
配制方法
除菌方式
母液浓度ห้องสมุดไป่ตู้
生长素
IBA（3-吲哚丁酸）用适量无水乙醇或1M NaOH彻底溶解后，再缓慢加入水定容到一定浓度。
除菌方式：与培养基高压共灭菌。
0.2g/L
IAA（3-吲哚乙酸）用适量无水乙醇或1M NaOH彻底溶解后，再缓慢加入水定容到一定浓度。
除菌方式：抽滤除菌。
可高压灭菌: IBA，NAA，6-BA，2,4-D;、KT
不可高压灭菌:ZT、2-IP、IAA，GA3
配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。
细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。
除菌方式：抽滤除菌。
0.2g/L
脱落酸
ABA（脱落酸）可用少量1M NaOH溶解后，再加水定容至一定浓度。
除菌方式：与培养基高压共灭菌。
0.2g/L
植物组培中，有些植物激素不能加入培养基中随之高压蒸汽灭菌，那么这些激素该如何加入培养皿中？
过滤灭菌后，在无菌条件下将其加入到高压灭菌后的温度下降到约50至60度的未凝固的培养基中，或者适当加热（如50~70°C水浴加热）使之溶解后的培养基中，摇匀，待培养基冷却凝固再接种培养物。【下载本文档，可以自由复制内容或自由编辑修改内容，更多精彩文章，期待你的好评和关注，我将一如既往为您服务】
植物激素评测实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过体外培养和观察不同植物激素对植物组织生长和发育的影响，评估植物激素在植物生长调节中的作用，并探讨不同激素之间的相互作用。
二、实验原理植物激素是植物体内的一类化学物质，能够调节植物的生长发育过程。
常见的植物激素包括生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）和乙烯（ETH）等。
这些激素在植物的生长、分化、开花、结实等过程中起着至关重要的作用。
本实验通过比较不同激素对植物组织生长和发育的影响，评估其作用效果。
三、实验材料与仪器材料：1. 植物外植体：取自健康植株的叶片、茎段或愈伤组织。
2. 植物激素：生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）和乙烯（ETH）。
3. MS培养基：含有各种营养成分的植物组织培养基。
4. 其他试剂：琼脂、蔗糖、乙醇、次氯酸钠等。
仪器：1. 培养室2. 高压灭菌锅3. 水浴锅4. 解剖刀5. 三角烧瓶（100mL）6. 烧杯7. 量筒8. 培养皿9. 超净工作台10. 分析天平11. 长镊子12. 剪刀13. 橡皮筋四、实验步骤1. 外植体消毒：将植物外植体用70%乙醇消毒30秒，然后用无菌水清洗3次，再用1%次氯酸钠消毒10分钟，最后用无菌水清洗5次。
2. 培养基制备：按照实验要求配制不同激素浓度的MS培养基，并加入适量的琼脂和蔗糖。
3. 外植体接种：将消毒后的外植体接种到不同激素浓度的培养基上，每个处理重复3次。
4. 培养：将接种后的培养皿放入培养室，在适宜的温度和光照条件下培养。
5. 观察与记录：定期观察外植体的生长情况，包括生长速度、愈伤组织形成、芽和根的形成等，并记录数据。
五、实验结果与分析1. 生长素（IAA）的影响：在低浓度IAA处理的培养基上，外植体生长速度较快，愈伤组织形成较好；而在高浓度IAA处理的培养基上，外植体生长速度明显减慢，愈伤组织形成不良。
2. 细胞分裂素（CTK）的影响：在低浓度CTK处理的培养基上，外植体生长速度较快，芽的形成较多；而在高浓度CTK处理的培养基上，外植体生长速度减慢，芽的形成减少。