DNA提取常用试剂及操作方法_百替生物
实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物
实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物实验十三质粒DNA的提取与鉴定一实验目的1.了解分光光度计测定DNA含量的原理和方法。
2.熟悉质粒的基本特性及质粒DNA提取的基本原理。
3.掌握碱变性法提取质粒DNA的基本操作过程。
二实验原理质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。
质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。
释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。
然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。
离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。
通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA 的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。
（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。
一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。
（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。
三药品器材一器材1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）2.台式离心机与高压灭菌锅3.超净工作台、摇床和各式加样枪二试剂1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mMTris-HCl pH8.0100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
DNA提取常用试剂及操作方法_百替生物
DNA提取常用试剂及操作方法一、真核细胞DNA的制备与定量制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20% SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
⑵将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
⑶加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。
⑷ 60°C水浴1-3hr。
2．培养细胞处理：⑴将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。
⑵离心4000g×5min，去除上清液。
⑶加10倍体积的裂解缓冲液。
⑷ 50-55°C水浴1-2hr。
（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化_百替生物
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 8学时一、实验目的使学生掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。
二、实验原理质粒细菌染色体外的DNA分子，其范围大小在1kb至200kb以上不等。
它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒在基因工程中是最常用的载体。
提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。
提取质粒首先进行大肠杆菌细胞的制备，制备后用碱裂解液进行细胞裂解，使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进行质粒的纯化。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、仪器设备培养皿摇床天平高速离心机（×12000g）微量移液器（2－20μl、20－200μl、200－1000μl）、电泳仪、微波炉。
四、相关知识点本课程知识点综合：涉及到质粒DNA提取过程、质粒纯化过程和琼脂糖凝胶电泳技术。
多课程知识点的综合：微生物学细菌的培养和质粒抽提技术。
五、实验步骤细胞培养接种培养挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
离心取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
DNA提取试剂及提取步骤
DNA提取试剂及提取步骤DNA提取相关试剂5 mol/L KAc (pH 5.2)：称取49.07 g KAc溶解于蒸馏水中，定容至100 mL。
3 mol/L NaAc (pH 5.2)：称取40.81 g NaAc·3H2O溶解于蒸馏水中，调pH值至5.2，最后定容至100 mL。
1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)：称取12.114 g Tris Base溶解于蒸馏水中，定容前用HCl调pH值至8.0，定容至100 mL。
0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)：称取18.612 g EDTA溶解于蒸馏水中，溶解过程中加入6-8块NaOH固体以助溶，定容前用NaOH调pH值至8.0，定容至100 mL。
CTAB缓冲液（Cetyl trimethyl ammonium bromide）：分别称取或量取43.83 g NaCl，4 g CTAB，12.5 g 山梨醇（sorbitol），5 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），10 ml EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0），5 g 十二烷基肌氨酸钠（sarkosyl），依次加样溶解，65 ℃水浴1 h-2 h使其充分溶解后定容至500 mL。
TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/L EDTA (pH 8.0))：分别取1 mL 1 mol/L的Tris-HCl (pH 8.0)，200 μL 0.5 mol/L的EDTA (pH 8.0)，加蒸馏水定容至100 mL，混匀。
PCI（Tris饱和酚：氯仿：异戊醇= 25：24：1）：将3种试剂按上述体积比配制后静置过夜，然后4 ℃避光保存。
CI（氯仿：异戊醇= 24：1）：将2种试剂按上述体积比配制后静置过夜，然后4 ℃避光保存。
50 × TAE电泳缓冲液：称取121 g Tris Base，量取28.55 mL冰乙酸，50 mL的0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)，用蒸馏水充分溶解混匀，定容至500 mL。
DNA提取方法和试剂作用详解
DNA提取方法和试剂作用详解DNA提取是分子生物学和遗传学研究中非常重要的步骤。
其作用是从生物样本中提取出纯度高的DNA，以便进行进一步的实验和分析。
DNA提取的方法和试剂作用有很多种，下面详细介绍一种常用的DNA提取方法和相应试剂的作用。
常用的DNA提取方法有酚/氯仿法、盐酸法、离心法和柱式法等。
下面以酚/氯仿法为例进行介绍。
酚/氯仿法是一种传统的DNA提取方法。
它利用了DNA、RNA和蛋白质在不同溶剂中溶解性的差异来分离DNA。
主要步骤如下：1.细胞破碎：首先将待提取DNA的样本（如动物组织或细菌）进行细胞破碎，使细胞膜破裂释放出细胞质和细胞核。
2.蛋白质沉淀：加入酚/氯仿（以1:1:0.7的比例混合）使细胞膜溶解，并沉淀DNA上层浮游的蛋白质和脂类，然后离心分离。
3.DNA与RNA沉淀：将上层液体转移到新离心管中，加入等体积的异丙醇，使DNA和RNA沉淀，然后离心分离。
4.DNA纯化：将DNA沉淀物洗涤去除残留的溶液和盐类，然后再次离心分离，脱水干燥或用缓冲液溶解。
除了上述步骤外，还需要一系列的试剂来协助完成DNA提取过程。
1.细胞破碎液：用于破裂细胞膜，释放出细胞内的DNA。
破碎液通常是一种含有酶和盐的缓冲液，可以有效地破坏细胞膜结构。
2. 蛋白酶：用于降解细胞核和线粒体中的蛋白质，以达到去除蛋白质的目的。
常用的蛋白酶有蛋白酶K和蛋白酶ase K。
3.酚/氯仿：用于沉淀和去除蛋白质。
酚是一种有机溶剂，它与蛋白质和脂类发生相互作用，从而使它们沉淀到底部。
氯仿能与酚混溶，形成一个界面，便于底部上层液体的分离。
4.异丙醇：用于沉淀DNA和RNA。
异丙醇能够调节DNA和RNA的溶解度，使其在溶液中沉淀下来，从而方便提取。
5.盐溶液：用于洗涤去除DNA沉淀物中的盐类和杂质，以提高DNA的纯度。
常用的盐溶液有EDTA和盐酸。
通过酚/氯仿法，可以得到高质量、高纯度的DNA样品，适用于进一步的PCR、测序和片段长度分析等实验。
DNA提取方法和步骤
DNA提取方法和步骤DNA提取是生物学实验中常见的操作步骤，用于从细胞或组织中提取纯化DNA。
DNA提取的主要目的是获得纯净的DNA样品，以便进行后续的实验，如PCR、限制酶切、测序等。
下面我们将详细介绍DNA提取的方法和步骤。
1.细胞破碎：将待提取DNA的细胞或组织进行破碎，以释放细胞内的DNA。
细胞破碎的方法有很多种，包括机械破碎、酶解、热破碎等。
其中，常用的方法是机械破碎，如用搅拌器或超声波振荡器将样品强力搅拌或振荡，以破坏细胞膜和细胞壁。
2.蛋白质除去：细胞破碎后，通过蛋白酶的作用，将细胞内的蛋白质降解，并与蛋白质结合的DNA一同除去。
常用的蛋白酶有蛋白酶K、丝氨酸蛋白酶等。
需要注意的是，蛋白酶的适宜浓度和作用时间需要根据实验的要求进行优化。
3.DNA纯化：在蛋白质除去后，将细胞产生的碱基、RNA等杂质与DNA分离。
常用的纯化方法有酚/氯仿方法、盐方法和硅胶柱法等。
其中，酚/氯仿方法是最早被使用的DNA纯化方法，其基本原理是将DNA与蛋白质、RNA等杂质分离，从而得到纯净的DNA。
酚/氯仿方法的步骤如下：a.向破碎细胞溶液中加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇晃离心管混匀，使DNA分配在有机相和水相之间。
b.离心管在高速离心机中离心15分钟，使混合液分为有机相、界面层和水相三个层次。
c.使用移液器将上清液（水相）转移到新的离心管中，注意避免吸入有机相。
d. 向上清液中加入1倍体积的冰冷异丙醇（Isopropanol），使DNA沉淀。
使用移液器轻轻颠倒离心管使DNA沉淀。
e.在-20℃冷冻保存30分钟或在室温下沉淀15分钟，以便DNA更好地沉淀。
f.在高速离心机中离心DNA沉淀，沉淀时间约为10分钟，沉淀结束后将上清液倒掉。
g.用70%乙醇洗涤DNA沉淀，然后在室温下晾干。
h.使用适量的缓冲液（如TE缓冲液）重新溶解DNA。
4.DNA沉淀：将纯化后的DNA样品进行沉淀，以去除残留的盐、酚、异丙醇等。
DNA抽提的操作步骤
DNA抽提的操作步骤试剂准备：蛋白酶K、白细胞裂解液、苯酚、氯仿、无水乙醇、70%乙醇1.从冰箱取出冰冻的白细胞，将编号和姓名写在登记本上。
待白细胞融化后，向管内加入5ml白细胞裂解液和50ul蛋白酶K（20mg/ml）。
将管内液体摇匀，或者借助移液枪反复吹打混匀。
然后将管子放入60℃水浴锅内，过夜（可以根据孵育的时间长短适当调整温度）。
在水浴的过程中，每隔2-3小时将试管震荡摇匀一次。
2.把水浴锅内的试管取出，将其中的液体转移到15ml试管内（15ml的试管事先做好标记），并依次向试管内加入等体积（即5ml）的酚-氯仿，然后将盖子拧紧。
轻轻上下颠倒混匀（20次左右），然后离心3000rpm，15min。
离心时将离心机的温度调至室温，温度过低会导致有机溶剂凝固。
离心结束后，可以看到试管内的液体分为三层，上层为水相，中间为变性的蛋白质，下层为有机溶剂（酚氯仿）。
3.然后用钝口Tip吸出上层水相转移到干净的试管中（注意：将1ml的Tip尖端减去2-3mm即可得到钝口的Tip，在吸取上层水相的过程中要尽量避免混入蛋白相，动作要缓慢）多分几次转移），然后再加入等体积的酚氯仿，拧紧盖子，颠倒混匀，离心3000rpm，10min。
4.再次用钝口Tip把上层水相转移到干净的试管中，然后向试管内加入2倍体×2），拧紧盖子，缓慢颠倒，积的无水乙醇（无水乙醇的体积=V所吸出的上清的体积即可看到絮状的DNA沉淀析出。
（如果抽提的数量较少，可以将管子放到Cold Room，等数量多了再一起进行下面的操作）5.用黄色Tip把白色絮状的DNA沉淀挑出来，放到70%乙醇（预先准备0.5ml的小管子，加入400ul70%的无水乙醇，洗涤用）中洗涤，重复两次。
6.最后用黄色Tip将DNA沉淀挑出，将DNA连同枪头一同打到1.5mlEP管中。
敞开盖子，室温放置直到乙醇完全挥发，向EP管内加入400ulTE，用Tip头反复吹打，使DNA完全溶于TE，得到DNA溶液。
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DNA提取常用试剂及操作方法一、真核细胞DNA的制备与定量制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20% SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
⑵将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
⑶加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。
⑷ 60°C水浴1-3hr。
2．培养细胞处理：⑴将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。
⑵离心4000g×5min，去除上清液。
⑶加10倍体积的裂解缓冲液。
⑷ 50-55°C水浴1-2hr。
（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。
2. 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。
3. 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。
5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。
7. 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。
8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。
9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。
(三）DNA定量和电泳检测1.DNA定量：DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。
因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
如用1cm 光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。
DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。
若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。
OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。
2.电泳检测：取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。
电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。
三、注意事项1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。
2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。
4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。
如要求更高，可进行DNA纯化。
二、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。
2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置。
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。
5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。
4℃保存备用。
4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。
缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。
二、操作步骤1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g 振荡培养过夜（约12-14hr）。
2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。
溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min。
7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。
8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。
9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
三、质粒DNA的电泳检测观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。
该物质含有一个可以嵌入DNA 的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。
DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。
这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。
因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。
取制备的质粒DNA 1-2μl，加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。
四、注意事项本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一般无麻烦。
若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。
三、λ噬菌体DNA提取λ噬菌体是最早使用的克隆载体，λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子，它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内λ噬菌体DNA 整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。