@@纤维素酶水解机理及影响因素
纤维素酶的作用机理及进展的研究
纤维素酶的作用机理及进展的研究摘要：纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，本文论述了纤维素酶的性质，重点介绍了纤维素酶的作用机理、应用及其研究进展，并对其研究前景做了展望。
关键词：纤维素酶；纤维素；作用机理；0引言纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。
纤维素占植物干重的35%-50%[1],是世界上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。
对人类而言，它又是自然界中最大的可再生物质。
纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义[2]。
1 纤维素酶的性质纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。
纤维素酶是四级结构，,产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。
由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等。
纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样，遵循双置换机制。
纤维素与酶相互作用中，是酶被底物分子所吸附，然后进行酶解催化，酶的活性较低，仅为淀粉酶的1/100[3] 纤维素酶对底物分子的分解，必须先发生吸附作用。
纤维素酶的吸附不仅与自身性质有关，也与底物密切相关，但纤维素酶的吸附机制总体并未弄清，仍需进一步研究[4]。
2 纤维素酶的作用原理（1）、纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时，可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质有利于动物胃肠道的消化吸收。
（2）、纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌，补充内源酶的不足，并对内源酶进行调整，保证动物正常的消化吸收功能，起到防病，促生长的作用。
木质素与酶的作用机制及其在纤维素酶水解中的影响研究进展
西北林学院学报2021,36(2):142-148J o u r n a l o f N o r t h w e s t F o r e s t r y U n i v e r s i t yd o i :10.3969/j.i s s n .1001-7461.2021.02.21木质素与酶的作用机制及其在纤维素酶水解中的影响研究进展收稿日期:2020-04-01 修回日期:2020-05-29基金项目:国家自然科学基金青年基金 纤维素酶吸附及水解对木质素结构S /G 值的动力学响应 (21704045);江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目(201910298034Y )㊂ 作者简介:黄丽菁,硕士在读㊂研究方向:生物质资源化学与工程㊂E -m a i l :h l j19970314@s i n a .c o m *通信作者:吴文娟,副教授,博士㊂研究方向:生物质资源化学与工程㊂E -m a i l :w e n j u a n w u @n jf u .e d u .c n 黄丽菁,吴彩文,邹春阳,闫雪晴,吴文娟*(南京林业大学江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏南京210037)摘 要:化石燃料的持续开采与使用对环境产生了严重的负面影响,使得开发可再生清洁能源代替传统能源成为必然㊂木质纤维素是一种丰富的可再生资源,可转化为生物乙醇㊁氢气等生物质燃料,被认为是代替化石燃料的理想替代品㊂其中木质纤维原料转化为生物乙醇需经过预处理㊁酶水解以及微生物发酵这3个关键步骤,而纤维素酶水解通常会受到酶㊁水解条件㊁底物等诸多因素的影响㊂针对木质素对纤维素酶水解的影响研究进行综述,大量研究发现,木质素是纤维素酶水解过程中的主要抑制剂㊂木质素既可以吸附纤维素酶,与纤维素酶发生无效吸附;又可以作为物理屏障,阻碍酶对纤维素的生产性吸附㊂尽管通过预处理可以去除大部分的木质素,但依旧无法从根源上缓解木质素对纤维素酶水解的影响,研究木质素的结构单元对酶解效率的影响可能是当前生物乙醇转化中木质素在纤维素酶水解中的研究方向㊂关键词:木质纤维原料;木质素;S /G 比;纤维素酶水解中图分类号:T Q 35 文献标志码:A 文章编号:1001-7461(2021)02-0142-07T h e A c t i o n M e c h a n i s m o f L i g n i n -e n z y m e a n d R e s e a r c h P r o gr e s s o f I t s I n f l u e n c e o n E n z y m a t i c H y d r o l ys i s H U A N G L i -j i n g ,W U C a i -w e n ,Z O U C h u n -y a n g ,Y A N X u e -q i n g ,W U W e n -ju a n *(J i a n g s u C o -I n n o v a t i o n C e n t e r o f E f f i c i e n t P r o c e s s i n g a n d U t i l i z a t i o n o f F o r e s t R e s o u r c e s ,N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,J i a n gs u ,C h i n a )A b s t r a c t :T h e c o n t i n u o u s e x p l o i t a t i o n a n d u s e o f f o s s i l f u e l s h a v e a s e r i o u s n e g a t i v e i m pa c t o n t h e e n v i r o n -m e n t ,w h i c h m a k e s i t i n e v i t ab l e t o d e v e l o p r e n e w a b l ec l e a n e n e r g y i n s t e ad o f t r a d i t i o n a le n e r g y .L i gn o c e l l u -l o s e i s a k i n d o f a b u n d a n t r e n e w a b l e r e s o u r c e s ,w h i c h c a n b e c o n v e r t e d i n t o b i o e t h a n o l ,h y d r o ge n a n d o t h e r b i o m a s sf u e l s ,a n d i s c o n s i d e r e d t o b e a n i d e a l a l t e r n a t i v e t o f o s s i l f u e l s .T h e c o n v e r s i o n o f l i gn o c e l l u l o s i c m a t e r i a l s t o b i o e t h a n o l r e q u i r e s t h r e e k e y s t e p s :p r e t r e a t m e n t ,e n z y m a t i c h y d r o l ys i s a n d m i c r o b i a l f e r m e n -t a t i o n .H o w e v e r ,e n z y m a t i c h y d r o l y s i s i s u s u a l l y a f f e c t e d b y m a n y f a c t o r s ,s u c h a s e n z y m e ,h y d r o l y s i s c o n -d i t i o n s ,s u b s t r a t e a n d s o o n .A l a r g e n u m b e r o f s t u d i e s h a v e f o u n d t h a t l i gn i n i s t h e m a i n i n h i b i t o r i n t h e p r o c e s s o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s .L i g n i n c a n n o t o n l y a d s o r b e n z y m e b u t a l s o a d s o r b n o n p r o d u c t i v e l y wi t h e n z y m e .I t c a n a l s o a c t a s a p h y s i c a l b a r r i e r t o p r e v e n t t h e e n z y m e f r o m a b s o r b i n g c e l l u l o s e p r o d u c t i v e l y.A l t h o u g h m o s t o f l i g n i n c o u l d b e r e m o v e d b y p r e t r e a t m e n t ,t h e e f f e c t o f l i g n i n o n e n z y m a t i c h y d r o l ys i s c o u l d n o t b e r e s o l v e d f r o m t h e r o o t .I n t h i s p a p e r ,r e s e a r c h e s o n t h e i n f l u e n c e o f l i g n i n o n e n z y m a t i c h yd r o l -y s i s we r e r e v i e w e d ,a n d t h e p o s s i b l e r e s e a r c h d i r e c t i o n s of l ig n i n i n b i o e th a n o l c o n v e r si o n w e r e p r o po s e d .K e y wo r d s :l i g n o c e l l u l o s e ;l i g n i n ;S /G r a t i o ;e n z y m a t i c h y d r o l y s i s目前,全世界的能源消耗主要来自于煤炭㊁石油㊁天然气等传统化石能源,社会经济的飞速发展使得人们对能源的需求不断增加,这将导致传统的化石燃料日益枯竭,也会带来严重的环境污染问题[1],为了解决能源供求问题,开发可再生的清洁能源已成为必然趋势,这也将是人类社会可持续发展的重大挑战㊂木质纤维原料是目前资源最为丰富㊁分布最为广泛的生物质,主要包括木材(阔叶材和针叶材)㊁能源植物(竹子㊁高粱等)㊁农业生产或林业加工废弃物(如棕榈树干㊁棉茧壳㊁橄榄壳㊁玉米秸秆等)[2],具有可再生㊁储量大㊁价格低等优势,可转化为乙醇㊁氢气㊁生物柴油等生物质燃料[3]㊂其中生物乙醇的生产是通过酶水解纤维原料中的纤维素㊁半纤维素并发酵而成的,这种生产过程取决于3个关键步骤,包括预处理㊁酶水解以及将释放的糖进行发酵[4],而预处理作为其中的关键环节对后续的酶水解有着重要的影响㊂在木质纤维原料的处理过程中,木质素的存在使得木质纤维原料对纤维素酶水解具有顽抗性,导致细胞壁的3个主要成分(木质素㊁纤维素和半纤维素)难以有效的解离,从而导致酶水解效率的降低[5]㊂因此,研究木质素的结构特点有助于降低纤维原料的顽抗性,实现更高效的酶水解,也为开发经济高效的新型预处理技术提供了方法和技术支撑[5-6]㊂目前,关于木质素对酶水解影响的研究有很多,但由于木质素结构的复杂多样性以及预处理对木质素结构的改变使得难以获得统一而确定的木质素对纤维素酶无效吸附的机理[7]㊂本文拟对纤维素酶水解的影响因素进行介绍,并综述木质素与酶之间的作用机理及其在纤维素酶水解中的影响研究进展㊂1木质纤维原料1.1组成与结构木质纤维原料主要含有纤维素㊁半纤维素㊁木质素等,木质纤维原料来源不同,组成含量也不同[8]㊂通常,木质纤维素原料中纤维素㊁半纤维素和木质素的含量分别在30%~60%㊁20%~40%和15%~ 25%[9]㊂纤维素是由葡萄糖组成的多糖聚合物,通过β-1-4糖苷键紧密连接,其聚合度在500~10000㊂由于纤维素分子间的氢键作用,纤维素分为结晶区和无定形区,结晶区氢键排列规则紧密,无定形区氢键排列松散且没有规则㊂分子间的氢键连接是具有不同取向性的,因此产生了不同程度的结晶度㊂结晶度在纤维素的生物降解过程中起着至关重要的作用,一般来说,结晶度越高,纤维素的生物降解就越困难[10]㊂半纤维素是由2种及以上的糖基组成,往往带有不同数量的支链或侧链㊂木糖㊁阿拉伯糖㊁葡萄糖㊁半乳糖和甘露糖等是组成半纤维素的主要糖基,它们根据半纤维素的来源以不同的比例排列㊂针叶材中的半纤维素以己聚糖为主,阔叶材中的半纤维素以戊聚糖为主㊂半纤维素分子量低,具有无定形区,比纤维素更易溶解,也更易受到化学攻击[11]㊂木质素广泛存在于维管植物中,是由苯丙烷单元通过化学键连接而成的芳香族聚合物,作为粘合剂存在于胞间层与微纤丝之间,从而增强了细胞壁的结构[12]㊂构成木质素的结构单元主要有对-羟苯基结构(H)㊁愈创木基结构(G)和紫丁香基结构(S) 3种,但不同来源的木质素结构差异有很大不同㊂这3种结构单元如图1所示㊂图1木质素3种结构单元[13]F i g.1 T h r e e s t r u c t u r a l u n i t s o f l i g n i n[13]一般来说,针叶木木质素含有丰富的G结构单元,阔叶木木质素同时包含G型和S型2种结构单元,而禾草类木质素则由G㊁S㊁H这3种结构单元构成[14]㊂因此根据所含结构单元的不同,木质素可进一步分为G型(针叶木木质素)㊁G-S型(阔叶木木质素)㊁G-S-H型(禾本科木质素)㊁G-H型(应压木木质素)[15]㊂表1为3种结构单元在不同种类植物中的含量[16]㊂表1不同种类植物中的木质素结构单元含量T a b l e1 C o n t e n t o f l i g n i n s t r u c t u r a l u n i t s i n d i f f e r e n tk i n d s o f p l a n t s%结构单元针叶材阔叶材禾草科G单元90~9525~5025~50S单元0~150~7525~50H单元0.5~3.4<0.0110~25 1.2木质素的来源与应用木质素的分离方式一般有2种:1)溶出木质素,木质素降解为可溶性碎片从原料中分离出来;2)保留木质素,纤维素㊁半纤维素降解溶出,木质素作为固体残渣被保留下来[17]㊂根据分离方法的不同,木341第2期黄丽菁等:木质素与酶的作用机制及其在纤维素酶水解中的影响研究进展质素可分为磨木木质素(M i l l e d W o o d L i g n i n, MW L)㊁碱木质素㊁酶解木质素㊁木质素磺酸盐等㊂磨木木质素又称B jök m a n木质素[18]㊂磨木木质素是使用中性溶剂在无酸㊁无热的条件下进行提取㊂此方法的得率较低,但其化学结构未受到严重的破坏,与原木质素具有最相似的结构,经常被用于木质素化学结构的研究㊂碱木质素是烧碱法或硫酸盐法化学制浆的副产物[19],往往含有大量的小分子糖㊁提取物和无机盐等杂质,因此常用碱溶酸析法进行提纯[20]㊂经过提纯改性后的碱木质素可用于复合材料㊁橡胶等领域㊂酶解木质素源自于生物乙醇的生产过程中的酶解残渣,通过有机溶剂或碱溶酸析法分离提取获得㊂它的结构与磨木木质素相似,但得率更高㊂由于酶解木质素未经过高温高压及酸碱的处理,保留了良好的天然结构,含有丰富的酚羟基,可作为在酚醛树脂中苯酚的替代物[21]㊂木质素磺酸盐来源于亚硫酸盐制浆工艺㊂它能够溶解于一定p H的水溶液中,却不溶于大多数溶剂[22]㊂木质素磺酸盐具有良好的分散性和表面活性,可以被用作混凝土外加剂㊁染料分散剂,以及用于工业废水中重金属吸附的乳化剂和螯合剂[23]等㊂2木质纤维原料的预处理木质纤维素结构复杂,纤维素周围被半纤维素和木质素形成的紧密的空间网状结构包裹㊂这种物理屏蔽阻碍了纤维素与外界的接触,也阻碍了纤维素的酶降解㊂为了增大原料的比表面积和提高酶对底物的可及性,改善纤维素的酶解效率,选择适当的预处理方式是必不可少的方法㊂一方面,可以破坏木质素和纤维素㊁半纤维素之间的连接,减少木质纤维素的顽抗性[24-25];另一方面,在一定程度上破坏了纤维素结晶度,增加原料的孔隙度和比表面积,改善了纤维素对酶的可及性[26]㊂目前,常用的木质纤维素预处理的方法有物理预处理,如机械粉碎法[27]㊁微波法[28]等方法;化学预处理,如酸法[29]㊁碱法[30]㊁有机溶剂法[31-32]㊁离子液体[33-34]等;物理化学预处理,如氨纤维爆破预处理[30]㊁蒸汽爆破预处理[35]等;生物预处理,如微生物预处理等[36-38]㊂每种方法都有其优缺点,可根据实际生产情况进行选择㊂3纤维素酶水解的影响因素在木质纤维素原料酶水解中,影响纤维素酶水解的因素有很多,包括纤维素酶和酶水解条件㊁酶的可及性㊁底物对纤维素的包覆等因素㊂纤维素酶是能够将纤维素降解为葡萄糖的酶的总称,分为内切型葡聚糖酶㊁外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶β[39]㊂在一定的纤维素酶浓度范围内,酶解效率会随着纤维素酶浓度的增加而提高㊂T.K i n n a r i n e n等[40]在研究磨碎的废弃硬纸箱的酶解过程中发现纤维素酶的浓度在很大程度上决定着还原糖的产率,但酶的用量也不是越多越好,当浓度达到一定程度时,水解速度的增加会变得缓慢㊂当纤维素酶的浓度适宜时,其催化反应还需要在合适的温度以及p H值范围内进行㊂J o n等[41]在模拟温度㊁酶和生物量负荷对糖产量影响时发现,在较低的温度和较低的酶负荷下纤维素更易转化为葡萄糖㊂通常情况下,纤维素酶水解最适宜的温度在40ħ~60ħ㊂p H值最适宜的范围在4.5~5.5㊂但也有研究表明[42],p H值>5.5会促进木质纤维素的酶解效率㊂底物对纤维素酶水解也有着重要的影响,主要体现在纤维素的结晶度㊁纤维素可及比表面积以及木质素和半纤维素的空间阻碍等方面㊂在水解过程中纤维素酶首先水解纤维素中较易接近的无定形区,有研究表明[43],破坏纤维素的晶体结构可增加其可及度从而加速纤维素的水解㊂酶对纤维素吸附量的大小往往由可及比表面积的大小决定,当底物的孔隙足够大时,通过纤维素酶系统的协同作用,可显著提高纤维素酶水解的效率[30]㊂增加可及比表面积还可以通过去除半纤维素和木质素的方式来增加木质纤维素原料的孔径和可及比表面积,减少酶的非生产性吸附,提高木质纤维原料的酶水解效率[44]㊂3.1木质素—酶相互作用的机制许多研究表明,木质素对木质纤维原料的酶水解有着显著的抑制作用㊂尽管研究者已经对木质素和水解酶之间的相互作用做了大量的工作,但对这些相互作用背后的机制仍然不够清楚㊂目前认为酶水解中木质素的抑制作用主要来源于:1)木质素引起的非生产性吸附;2)木质素的空间结构[45]㊂3.1.1非生产性吸附纤维素酶和木质素之间的非生产性吸附主要与疏水作用[46]㊁静电作用[47]㊁氢键作用[48]有关㊂3.1.1.1疏水作用疏水作用指的是酶结构中的芳香性氨基酸的残基与木质素表面疏水基团的结合㊂纤维素酶中碳水化合物结合域和木质素之间的疏水作用被认为是纤维素酶催化木质素非生产性结合的主要原因㊂除了碳水化合物结合域以外,纤维素酶催化域上的疏水区域也被认为会导致对木质素的吸附[49]㊂K.T.H o d g s o n等[50]测量了木质素和441西北林学院学报36卷纤维素的接触角,发现木质素的接触角大于纤维素的接触角,说明木质素的疏水性高于纤维素,当木质素与纤维素同时存在时,纤维素酶会优先吸附木质素㊂3.1.1.2静电作用虽然疏水作用是主要的驱动力,但静电作用对蛋白质在固体表面的吸附行为也起着重要的作用㊂水相环境中官能团(如木质素的羧基㊁羟基㊁酶的氨基酸残基)的缔合㊁解离会使木质素和酶产生表面电荷,从而引起它们之间的静电相互作用[51-52]㊂在水溶液中,木质素的基团(羟基和羧基)会发生电离使其表面带有负电;而纤维素酶表面有许多暴露在外的氨基酸残基,这是一种两性基团,它所带的电荷性质会随着p H条件的变化而改变[45]㊂例如,当等电点一定时,β-葡萄糖苷酶在p H <5.5时带正电,几乎完全吸附带负电的木质素;而当p H值增加到6.0时,β-葡萄糖苷酶对木质素的吸附能力显著降低㊂但对于外切型葡聚糖酶和内切型葡聚糖酶来说,p H的变化对木质素-酶相互作用的影响并不明显,因为这2种酶的等电点均<5.0,并且在其应用p H值范围5.0~6.0显示出负电荷[53]㊂3.1.1.3氢键作用氢键作用是通过木质素和酶中的羟基发生的,在这些基团中,酚羟基直接负责酶的吸附,而脂肪族和羧基羟基被认为有助于木质素-酶的离子相互作用[54]㊂目前对木质素与纤维素酶之间的氢键结合的研究较少,因此需要进一步研究氢键对木质素-酶相互作用的影响㊂3.1.2空间位阻除了酶的非生产性吸附外,木质素还可以通过空间位阻来抑制纤维素水解㊂在木质纤维原料预处理的过程中,木质素可以迁移到纤维表面,导致整个生物量基质重新分布;也可以通过溶解的木质素重新凝聚形成液滴沉积在纤维素表面,阻碍酶在纤维表面的吸附,进一步抑制纤维素的水解[46]㊂J.K.K o等[55]在高温液态水预处理混合阔叶木的过程中,用电镜扫描观察了在细胞壁表面形成的球形液滴,发现这些液滴主要是疏水性的木质素,它们沉积在纤维素表面阻碍了水解,直观地解释了空间位阻对纤维素酶水解的影响㊂3.2木质素结构单元对纤维素酶水解的影响木质素结构单元的差异,直接影响木质素的分子结构,是木质素大分子结构差异的最主要的因素㊂木质素的组成因素对酶解过程中有着显著影响,被认为是酶水解的障碍,而在组成因素中,S/G比是研究最多的因素之一㊂S/G比之所以能影响酶水解,是因为它会影响木质素交联,进而影响植物细胞壁的三维结构和酶的纤维素可及性㊂许多研究者发现,S/G比与酶对木质素的吸附量呈负相关,但与纤维素水解产量呈正相关㊂例如, M.H.S t u d e r等[56]在对杨树样本研究的过程中发现,较高的S/G比意味着较高的脱木素率,由于高S/G比的木质素中不稳定的β-O-4键所占比例较高,导致它更容易进行预处理㊂因此在这种情况下,木质素更易水解㊂J.K.K o等[53]经过研究发现,G 单元含量高的木质素能吸附更多的纤维素酶,尤其是β-葡萄糖苷酶,木质素对β-葡萄糖苷酶的吸附间接抑制了阔叶木中纤维素的酶解,表明木质素的S/ G比在纤维素酶吸附木质素和生物质水解中的重要性㊂J.E.K i m等[57]研究了在相同反应条件下,草酸和硫酸催化剂对稀酸预处理生物质中木质素结构变化的影响㊂实验中发现,在草酸预处理的生物质中,由于G型木质素的含量较高,导致其对酶解效率有负面的影响㊂在比较酶在马尾松木质素膜与麦草㊁杨木木质素膜上的吸附量时,发现酶在马尾松木质素膜上的吸附量更高㊂而马尾松㊁麦草㊁杨木的S/G 比分别为0㊁0.5㊁1.47,因此这一结果可以证明G单元含量越高,吸附量越大[58]㊂然而,关于S/G比对于纤维素酶水解的影响还存着一些不同的结论㊂一些研究发现,S/G比与未经处理的木质纤维原料的酶水解呈负相关㊂在磨木木质素对纤维素酶的吸附实验中,L.P.T a n等[59]发现经过酸性亚硫酸盐预处理的磨木木质素显示出更高的S/G比以及更高的酶吸附能力㊂在研究桉树3个突变体及相应野生型在离子液体预处理前后对纤维素水解能力的影响时,G.P a p a等[60]发现,高S/G 比木质素会导致葡萄糖产率降低(r=0.97;P< 0.03;n=4),但不影响离子液体预处理后的葡萄糖产率㊂这是由于离子液体预处理的高效性掩盖了S/G比值改变的影响㊂也有一些研究表明,生物原料的水解能力不受S/G比的影响㊂为了研究S/G 比对苜蓿酶促水解的影响,B.S.D i e n等[61]创建了转基因苜蓿,这种苜蓿的S单位含量低于野生型苜蓿,经过实验未发现S/G比对经过稀酸预处理的苜蓿的酶水解有显着影响㊂N.A.T o b i m a t s u等[62]培育出了G㊁S㊁H单元含量较高的木质素,经过实验发现,G㊁S单元的含量对纤维素酶水解的影响几乎为零,而H单元的增加对纤维素酶水解有促进作用,它所产生的葡萄糖几乎是从前的2倍,因此研究者认为,与G和S单元的含量相比,木质素结构中醛基的含量才是酶水解的决定性因素㊂由于H单元在木材中的含量较少,对于H单元对纤维素酶水解的影响的研究较少㊂有数据表明,H单体可能与β-1-4-葡聚糖链而不是半纤维素541第2期黄丽菁等:木质素与酶的作用机制及其在纤维素酶水解中的影响研究进展连接,从而导致小麦和水稻中纤维素结晶度降低,因此H/G对水稻和小麦木质纤维素糖化有积极影响[63]㊂H单元之所以会产生积极作用,可能是因为木质素分子量降低㊁纤维素结晶度由于H单元与葡聚糖链的连接而降低或者是H单元的结合活性高于G㊁S单元[64]㊂F.F.G u o等[65]却在试验中发现木质素中H单元的浓度可能对吸附量没有影响㊂松木木质素和白杨木质素几乎含有相等的H单元,松木木质素的吸附量大于白杨木质素㊂秸秆木质素比松木木质素具有更多的H单元和较弱的亲和力,红麻木质素比白杨木质素和松木木质素具有更多的H单元和较弱的吸附能力,说明H单元数量的增加并没有增加吸附能力㊂秸秆木质素比红麻木质素具有更多的H单元和更大的亲和力,说明H单元数量的增加也没有降低亲和力㊂这些结果表明,H单元的数量可能与吸附能力无关㊂4展望酶水解是利用木质纤维原料生产生物乙醇的重要途径,而木质素通常被认为对木质纤维原料的酶水解有着显著的抑制作用㊂近年来,随着各种技术的综合利用以及新技术的开发,针对木质素对纤维素酶水解的影响的研究越来越多㊂在木质素对酶水解或酶吸附的研究中,由于木质素结构不同的底物,其生物构造㊁化学组分的构成㊁分子结构和超分子聚集态等也各不相同,传统的研究方法通常只能间接推测木质素对酶的吸附及对底物酶水解的影响㊂这也是目前对木质素结构如何影响酶水解存在不同观点的重要原因㊂如何消除非木质素因素的干扰,是解决这一难题的关键所在㊂未来的工作可以考虑制备具有不同单元构成的木质素样品,运用先进的技术,如耗散型石英晶体微分析天平,进行原位㊁实时研究不同结构单元的木质素,以及纤维素复合物在酶吸附和/或酶水解动态行为,在排除其他干扰因素(即除木质素结构不同,其他条件完全相同)的条件下,深刻认识木质素单一因素的影响,构建木质素结构单元与纤维素酶吸附及其对酶水解糖转化的 构-效 关系,为改进现有预处理方法及开发新的高效的预处理方法提供理论依据和技术支持,并有助于提高木质纤维素的酶解效率,实现以木质纤维素为原料进行生物乙醇高效转化的工业化生产㊂参考文献:[1]张海峰,杨军艳,吴建新,等.木质素氧化降解研究进展[J].有机化学,2016,36(6):1266-1286.Z H A N G H F,Y A N G J Y,WU J X,e t a l.R e s e a r c h p r o g r e s s o fl i g n i n o x i d a t i v e d e g r a d a t i o n[J].C h i n e s e J o u r n a l o f O r g a n i cC h e m i s t r 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纤维素酶水解作用机制
纤维素酶水解作用机制00000纤维素酶由三类组成1)内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase,EC3-2-1-4,也称EG酶或Cx酶);(2)外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase,EC3-2-1-91),又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBH)或C1酶;(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC3-2-1-21),简称BG。
纤维素酶解是一个复杂的过程,其最大特点是协同作用。
内切葡聚糖酶首先作用于微纤维素的无定型区,随机水解β-1,4-糖苷键,产生大量带非还原性末端的小分子纤维素,外切葡聚糖酶从这些非还原性末端上依次水解β-1,4糖苷键,生成纤维二糖及其它低分子纤维糊精,在β-葡萄糖苷酶作用下水解成葡萄糖分子。
这种协同作用普遍存在,除了上述协同作用,还可以发生在内切酶之间,外切酶之间,甚至发生在不同菌源的内切酶与外切酶之间。
一般地说,协同作用与酶解底物的结晶度成正比。
纤维素酶优先作用于纤维素的无定形区域,对结晶纤维素有一定的降解,但难度较大"值得庆幸的是,通过研究,我们对结晶纤维素降解的作用机制已有了一定的认识在纤维素酶解的最初阶段,EG和CBH能引起纤维素的分散化和脱纤化,使纤维素结晶结构被打乱导致变性,纤维素酶深入到纤维素分子界面之间,使其孔壁!腔壁和微裂隙壁的压力增大,水分子介入其中,破坏纤维素分子之间的氢键,产生部分可溶性的微结晶。
纤维素酶中单个组分的作用机制与溶菌酶相似,遵循双置换机制。
2影响纤维素水解的主要因素2.1酶复合物的组分及其比例微生物产生的纤维素酶复合物不一定都有前述三类酶,而是因种类不同,差异较大。
酶复合物的组分及其比例决定了它对纤维素的水解程度,组分较齐,比例适当的酶复合物对纤维素的水解能力较强。
以研究得较多的菌种为例,丝状真菌能产生大量的纤维素酶(20g/L),三类酶都有,而且比例适当,一般不聚集形成多酶复合体,能降解无定纤维素和结晶纤维素。
@@纤维素酶水解机理及影响因素
收稿日期:2007-04-13作者简介:黄翊(1980-),男,广东广州人,助理工程师,现从事石油化工设计工作。
纤维素酶水解机理及影响因素黄翊(广东省石油化工设计院,广东广州 510130)摘要:对纤维素酶水解的机理进行了阐述,并初步探讨了各类因素对水解的影响。
关键词:纤维素酶;水解中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:1008-021X (2007)05-0029-03The HydrolysisM echan ics of Cellulose and I nfluenc i n g FactorHUAN G Yi(Guangdong Petr oche m ical Engineering Design I nstitute,Guangzhou 510130,China )Abstract :This text expound the hydr olysis mechanics of cellul ose,and p reli m inary discuss s ome influencing fact ors on hydr olyzati on .Key words :cellulase;hydr olyzati on 纤维素是自然界中最丰富的可再生资源之一,如将其以工业规模转化成葡萄糖的技术开发成功,那么纤维素资源便可成为人类食粮、动物饲料、发酵工业原料以及能源的新来源。
但目前有效利用纤维素生物量的主要障碍是纤维素酶的酶解效率低,与淀粉酶比较相差2个数量级以上,进而导致纤维素酶解过程中纤维素酶的成本过高,约占纤维素糖化工艺的40%以上,从而严重阻碍了纤维素酶在纤维素糖化中的广泛应用。
酶的固定化技术为提高纤维素酶的使用效率,降低成本,提供了可能性。
因为固定化酶比游离酶具有较好的稳定性,并且可以重复使用和回收,又便于连续化操作,因而可以大大降低成本。
1 反应机理1.1 纤维素酶的作用机制及理化性质纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。
纤维素酶分子结构及作用机理的研究进展
１２ Ｎｏ． ７． ２００７
专题论述
（１．Ｃｏｌｌｅ ｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓ ｃｉｅ ｎｃｅ ， Ｓ ｏｕｔｈｗｅ ｓ ｔ Ｕｎｉｖｅ ｒｓ ｉｔｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１６； ２．Ｃｉｔｒｕｓ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒｃｈ Ｉｎｓ ｔｉｔｕｔｅ ， Ｃｈｉｎｅ ｓ ｅ Ａｃａ ｄｅ ｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１２）
纤 维 素（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）是 植 物 细 胞 壁 的 主 要 组 分 之 一 ， 占 植 物 秸 秆 干 质 量 的４０％～５０％。它 对 增 强 细 胞 壁 的 机械支撑强度、维持不透水性以及抗逆性有重要的 功 能 作 用 ［１］。 纤 维 素 酶 （Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）是 降 解 纤 维 素 的 一 组 酶系的总称， 而纤维素是地球上数量最大但又未得 到充分利用的一类多糖， 微生物对它的降解、转化 是自然界碳素循环的主要环节。近年来随着对纤维 素酶研究的深入， 以及越来越多的性质不同的纤维 素酶的发现， 使得纤维素酶的应用日益广泛。但是 由于对纤维素酶的结构、功能特别是降解纤维素的 作用机制还缺乏足够的了解， 使得对纤维素酶的研 究和高效应用存在很大的局限。由于分子生物学技 术的兴起， 使得人们能在基因水平上对纤维素酶类 多样性的进化起源有了更进一步的研究。
大多数纤维素酶都是这样， 只有少数微生物和 高 等 植 物 产 生 的 纤 维 素 酶 不 具 有 这 类 结 构 域 ， 如Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ的 ＣＢＨＩ 就 没 有 ＣＢＤ结 构 域 。 通 常 认 为 ＣＢＤ对 高 效降 解纤维素起到关键的作 用， 但Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ的ＣＢＨＩ在 没 有ＣＢＤ的 情 况 下 仍 具 有 水 解 纤 维 素 的 活 性 ， 在 Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ的ＥＧ１的 酶 解 过 程 中 也 观 察 到 同 样 的 现 象 。 此 外 ， Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ 的 ＥＧ５ 和 Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｎａｓ ｆｉｍｉ 的 ＣｅｎＥＧ都并未发现具有ＣＢＤ结构， 但仍然具有水解酶 活性。这些实验证明， 在有些外切和内切酶中ＣＢＤ对 酶 的 催 化 活 力 是 非 必 需 的［６］。 ２．１ 催化域的结构（Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ， ＣＤ）
纤维素酶降解影响因素研究
除钻井液对 地层 伤 害 ， 技 术 已经显 示 出巨大 的应 该
用前 景 。但 目前 缺乏对 生 物 酶 的基础 研究 ， 笔
说 ， 首先 由葡 聚糖 内切酶 （ Ｇ 在纤维 素聚合物 的 Ｅ ） 内部起作 用 ， 在纤 维素 的非结 晶部位进 行切割 ， 生 产
新 的末端 。然 后 再 由葡 聚 糖 外 切酶 （ Ｂ 从 非还 Ｃ Ｈ）
个主要原 因 ， 高分 子 量 的 聚合物 及 其裂 解 产 物 而 ， 消 除 为
和滤饼 是 聚合 物 污 染地 层 的 主 要形 式
二 、 响 因素研 究 影
纤维 素酶是 指能 水解 纤维 素 Ｂ一１４葡 萄糖 苷 ，
上述 高分子 钻 井 液对 地层 的伤 害 ， 要 把 滤 饼 （ 需 富 集高分 子 ） 高分子 不 完全 裂解 产 物清 除 掉 。常规 和 的方法是 采用强 酸 或 氧化 剂 ， 但这 些方 法 都 存在 一 些不足 。针对上 述 高分 子 的结 构 特点 ， 们 已经 开 人 始研究采 用生物 酶对 高 分子 深 度 降解 ， 而达 到 消 从
素的降解过程 ， 并考察 了温度 、Ｈ值和表面活性剂等 外界 条件对 生物 酶降解性 能的影响。研 究发现 ， ｐ 温度对 纤维
素 酶 的 活性 的 影 响 规律 是 先升 高后 降 低 的 趋 势 ，ＯＣ 纤维 素 酶 活 性 最 高 的 温 度 ；Ｈ 升 高对 纤 维 素 酶 活性 起 着抑 ５。是 ｐ 制 作 用 ，Ｈ： ｐ ４的 偏 酸 性环 境 最 适 合 纤 维 素 酶 解 。表 面 活 性 剂 十 二 烷 基 硫 酸 钠 、 二 烷 基 苯 磺 酸 钠 和 Ｔｉ ｎＸ一 十 ｒｏ ｔ １０对 纤 维 素酶 的 水 解 活性 均有 抑 制 作 用 。 文 章 的 结论 将 有 助 于 指 导 纤 维素 酶 的现 场 应 用 。 ０ 关 键 词 ：纤 维素 酶 ；温度 ；ｐ 表 面 活性 剂 ；降解 能 力 Ｈ；
纤维素的水解反应方程式
纤维素的水解反应方程式一、引言纤维素是一种在自然界中广泛存在的有机物质，主要存在于植物细胞壁中。
它是由葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成的多糖，具有高度的结晶性和稳定性。
然而，由于纤维素的结构特点，其直接利用价值有限。
因此，研究纤维素的水解反应机理和反应方程式，对于开发纤维素资源、提高纤维素的利用效率具有重要意义。
二、纤维素的结构特点纤维素是由大量葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成的线性高分子化合物。
纤维素的分子结构中存在多个羟基（-OH），这些羟基的存在使得纤维素具有良好的亲水性。
纤维素的结构特点决定了其在水解反应中的一些特性。
三、纤维素的水解反应机理纤维素的水解反应是指将纤维素分解为低聚糖或单糖的过程。
纤维素的水解反应主要发生在酸性或碱性条件下，其中酸性条件下的水解反应较为常见。
以下是纤维素在酸性条件下的水解反应机理：1. 酸催化下的纤维素水解酸催化下的纤维素水解是通过酸催化剂，如硫酸、盐酸等，使纤维素发生酸解聚合反应，最终得到低聚糖或单糖。
具体反应过程如下：1.纤维素与酸发生酸解聚合反应，产生纤维素酸解物。
2.纤维素酸解物进一步水解，生成低聚糖或单糖。
2. 酶催化下的纤维素水解酶催化下的纤维素水解是通过纤维素酶，如纤维素酶、木聚糖酶等，催化纤维素的水解反应。
具体反应过程如下：1.纤维素酶与纤维素结合，形成酶-底物复合物。
2.酶催化下，纤维素发生水解反应，生成低聚糖或单糖。
四、纤维素水解反应方程式纤维素的水解反应方程式可以根据纤维素的水解机理推导得出。
以下是纤维素在酸性条件下的水解反应方程式：1.酸催化下的纤维素水解反应方程式：纤维素 + 酸→ 纤维素酸解物纤维素酸解物 + 水→ 低聚糖或单糖2.酶催化下的纤维素水解反应方程式：纤维素 + 纤维素酶→ 酶-底物复合物酶-底物复合物→ 低聚糖或单糖五、纤维素水解反应的应用纤维素水解反应具有广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1.生物燃料生产：通过纤维素的水解反应，可以将纤维素转化为低聚糖或单糖，进而通过发酵等方法制备生物燃料，如生物乙醇。
纤维素水解
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• 1921年Mener-Willians用浓H2SO4水解纯的棉花纤 维，分离出得率为：90.7%的结晶D-葡萄糖。
• 另外也有人将纤维素先溶于40%HCl或72% H2SO4 中，放置12~24hr，然后冲稀至含酸低于1%的水解 液，再煮沸数小时，纤维素几乎完全成葡萄糖， 其得率达理论值的96%~98%。
终止反应：纤维素末端基变为稳定的偏变 糖酸基，不再产生剥皮反应。
剥皮反应
2 纤维素的碱性降解
2.3 醛酮糖互变及β-烷氧基消除反应
• 纤维素葡萄糖末端基在碱作用下转变为果糖末端基
CHO H C OH HO C H
H C O (G)n
H C OH CH2OH
NaOH
CH2OH
C
HO C
HC
O H
O (G)n
3 纤维素的酶分解
3.4.2 物理化学法 3.4.2.1 蒸汽爆裂
蒸汽爆裂是木质纤维素原料预 处理较常用的方法。蒸汽爆裂法是 用高压饱和蒸汽处理生物质原料, 然后突然减压,使原料爆裂降解。
3 纤维素的酶分解
3.4.2.1.1 主要工艺:
用水蒸汽加热原料至160～260 ℃(0.69～ 4.83MPa) ,作用时间为几秒或几分钟,然后 减压至大气压。由于高温引起半纤维素降 解,木质素转化,使纤维素溶解性增加。蒸 汽爆破法预处理后木质纤维素的酶法水解 效率可达90%。
理论上，在其他条件不变时，酸的浓度提高一 倍，水解时间可缩短。通常采用稀酸常压水解时， 酸的浓度为2~3％；稀酸加压水解时，酸浓度为 0.5~1％。
1 纤维素的酸水解
1.6.3 液比系数
水解时液体和纤维素原料的比例叫比例系数
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收稿日期:2007-04-13作者简介:黄翊(1980-),男,广东广州人,助理工程师,现从事石油化工设计工作。
纤维素酶水解机理及影响因素黄翊(广东省石油化工设计院,广东广州 510130)摘要:对纤维素酶水解的机理进行了阐述,并初步探讨了各类因素对水解的影响。
关键词:纤维素酶;水解中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:1008-021X (2007)05-0029-03The HydrolysisM echan ics of Cellulose and I nfluenc i n g FactorHUAN G Yi(Guangdong Petr oche m ical Engineering Design I nstitute,Guangzhou 510130,China )Abstract :This text expound the hydr olysis mechanics of cellul ose,and p reli m inary discuss s ome influencing fact ors on hydr olyzati on .Key words :cellulase;hydr olyzati on 纤维素是自然界中最丰富的可再生资源之一,如将其以工业规模转化成葡萄糖的技术开发成功,那么纤维素资源便可成为人类食粮、动物饲料、发酵工业原料以及能源的新来源。
但目前有效利用纤维素生物量的主要障碍是纤维素酶的酶解效率低,与淀粉酶比较相差2个数量级以上,进而导致纤维素酶解过程中纤维素酶的成本过高,约占纤维素糖化工艺的40%以上,从而严重阻碍了纤维素酶在纤维素糖化中的广泛应用。
酶的固定化技术为提高纤维素酶的使用效率,降低成本,提供了可能性。
因为固定化酶比游离酶具有较好的稳定性,并且可以重复使用和回收,又便于连续化操作,因而可以大大降低成本。
1 反应机理1.1 纤维素酶的作用机制及理化性质纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。
目前普遍认为:完全降解纤维素至少需要有3种功能不同但又互补的纤维素酶的3类组分:EG (内切葡聚糖酶)、CBH (外切葡聚糖纤维二糖水解酶)和CB (纤维二糖酶或β-葡萄糖苷酶),在它们的协同作用下才能将纤维素水解至葡萄糖。
纤维素的降解过程,首先是纤维素酶分子吸附到纤维素表面,然后,EG 在葡聚糖链的随机位点水解底物,产生寡聚糖;CBH 从葡聚糖链的非还原端进行水解,主要产物为纤维二糖;而CB 可水解纤维素二糖为葡萄糖。
需要这三类酶的"协同"才能完成对纤维素的降解。
其中对结晶区的作用必须有EG 和CBH,对无定形区则仅EG 组分就可以。
纤维素酶分子由催化结构域(catalytic domain,CD )、纤维素结合结构域(cellul ose -binding domain,CBD )和一个连接桥(linker )三部分组成。
不同来源的纤维素酶分子其特征和催化的活性不尽相同。
酶分子都被糖基化,糖基化与蛋白质之间以共价键或解离的络合状态存在。
酶分子糖基化的程度决定了酶的多形性和相对分子质量的差别。
近年来,纤维素酶分子结构与功能的研究取得了一定的进展。
不同来源内、外切酶的CD 晶体结构分析结果表明:纤维素酶遵循溶菌酶的作用机制;真菌和细菌来源的纤维素酶的CBD 的三维结构也得到了解析。
真菌和细菌产生的纤维素酶分子差别很大,但它们的催化区在一级结构上氨基酸数量和二维结构上的大小却基本一致,但它们的连接桥和CBD 却存在明显的差异。
真菌纤维素酶的连接桥一般富含Glu,Ser 和Thr,而细菌纤维素酶的连接桥则完全是由Pr o -Thr这样的重复顺序组成。
另一方面,真菌的CBD 由33～36个氨基酸残基组成,且具有高度的同源;而细菌纤维素酶的CBD 由100～110个氨基酸组成,同源性也较低。
在高级结构的分子形状上,真菌纤维素酶的CD 、连接桥和CBD 呈直线连接,CD 与CBD 间为180°,而细菌纤维素酶的连接桥CD 与CBD 之间呈135°。
有限酶切时,真菌纤维素酶只具有一个酶切位点,在靠近CD 与连接桥边结区,酶切时可将CBD 与连接桥一并切去,而细菌的外切酶具有两个酶切位点,有限酶切时,可将CBD 和连接桥分别切去。
真菌的外切酶的CBD 的结构形状呈“楔型”,一面亲水,另一面疏水;结构中芳香族氨基酸只有3个Tyr,它们位于平坦的亲水面,执行吸附纤维素的功能;细菌外切酶的CBD 很大,且包含很多芳香族氨基酸,它们中的Tr p54和Tr p72暴露于蛋白分子表面,执行吸附功能。
真菌纤维素酶合成后分泌到胞外,它们对纤维素的降解通过内、外切酶之间的协同作用,枯草杆菌、假单孢杆菌、纤维单孢菌可产生胞外内切纤维素酶,而无外切纤维素酶的形成。
高温厌氧纤菌一般形成“纤维素酶小体”(cellul os ome )并在胞壁上形成一个外凸的“小刺”来降解底物。
通常,细菌纤维素酶的降解效率低于真菌。
现代基因克隆技术使纤维素酶系中的单组分酶的分离变得容易,通过基因测序可预推酶蛋白中的功能区及其二级和三级结构[1]。
20世纪80年代至今已有上百种纤维素酶基因被克隆测序,发现氨基酸序列同源性,不只局限于相同来源的同类酶之间,相近种属如细菌、放线细菌、真菌及高等植物的不同类型酶之间,也存在不同程度的同源性。
目前,纤维素酶分解纤维素的分子机制以及结构尚待进一步阐明,将来,以生物化学理论作为依据,采用蛋白质工程方法、构建具有可完全降解结晶纤维素的纤维素酶分子,同时结合底物预处理等技术使其能在生物反应器中高效和重复使用,以提高纤维素酶生物催化活性的效率,应是纤维素酶得以应用的重要途径。
1.2 Sol -gel 法包埋生物分子基本过程S ol -gel 法包埋生物分子的基本过程可参见图1。
图1 Sol -gel 法包埋生物分子过程示意图 首先,前驱体在催化剂作用下发生水解形成均一的溶胶溶液,此时加入生物分子,随着凝胶网络结构的形成和固化,生物分子被逐步包埋于凝胶孔中。
Sol -gel 法是物理包埋过程,凝胶网络是围绕生物分子逐渐形成的,对生物分子尺寸无特殊要求;温和的反应条件和凝胶的非晶态结构都有利于保持生物分子的结构完整性和表面微观结构的各向同性;常用的基质材料Si O 2比有机聚合物具有更好的化学和热稳定性,且坚固、抗磨,不易变形。
另外,Sol -gel 中含有足够多的间隙水(interstitial water ),可以为生物分子提供与水溶液环境相同的微环境,从而保持生物分子的反应活性[2]。
Sol -gel 包埋生物分子(如酶)用于实际反应(如酶促反应)时,反应效果不仅取决于生物分子的活性,还与凝胶网络微观结构密切相关[3]。
作为催化剂的酶是被束缚在固体中的,底物分子必须扩散到含酶的凝胶表面和内部才能与酶接触并发生反应,同样,生成的产物也要不断扩散出凝胶。
因此反应效果还取决于底物和产物在溶液和基质间的分配以及底物到达酶处和产物离开基质的扩散阻力。
Sol -gel 法在基质结构设计和裁剪方面具有巨大的优势。
通过调节反应条件,Sol -gel 法形成的基质孔大小可被控制在适宜的尺寸,既可将生物分子牢固地束缚在凝胶网络中,又便于底物和产物的扩散以及底物与生物分子间的反应。
但目前这一方面的研究大多还只停留在工艺水平,缺乏定量的理论指导。
针对传统Sol -gel 过程在生物分子包埋方法的缺陷,人们提出了如下改进措施:①采用超声波促进前驱体的溶解,提高多组分体系的均一分散度和凝胶化速度而无须再外加醇作共溶剂;②在水解后的溶胶中加缓冲溶液调节pH 值,同时稀释水解过程中产生的醇,创造更适宜生物分子的包埋环境;③在低温下老化。
通过这些改进,至今已有许多种类的酶和其他蛋白质被包埋于Sol -gel 法形成的基质中,如葡萄糖氧化酶、铜锌超氧化物歧化酶、细胞色素C 、肌红蛋白、血红蛋白、过氧化氢酶、脂肪酶、大豆过氧化酶、脲酶等,研究表明包埋生物分子的活性得到了很大提高,一般可达到未包埋时的30%～100%,甚至超过了相同条件下在溶液中的活性。
2 分析讨论由以上机理及性质可知,酶分子容易受外界环境影响,进而影响水解效果,从这种变化关系我们可以总结出酶法水解的影响因素。
2.1 预处理对酶解的影响预处理不同程度上引起了结晶度的下降,一般地说,结晶区难以被纤维素酶破坏、降解。
纤维素结晶度的下降有利于纤维素酶的水解。
预处理条件下纤维素植物的可溶木质素含量提高,溶出的木质素含量越高,说明天然植物纤维中木质素减少越多,木质素分布在植物细胞壁的胞间层,由于木质素的破坏、溶出,便会破坏天然植物纤维的结构,有利于纤维素酶的水解作用。
预处理后其结晶度下降、可溶木质索含量较高,纤维形态变化较大,因而推测植物纤维的结晶度、木质素含量及纤维结构形态均一定程度上影响着纤维素酶对纤维素的作用。
2.2 纤维素结构对酶解影响纤维素是由许多D-葡萄糖残基以β-1,4糖苷键联结而成的多糖。
它的聚合度范围非常宽。
纤维素链之间存在着氢键,通过氢键的缔合作用,形成纤维束,分子密度大的区域,成平行排列,形成结晶区;分子密度小的区域,分子间隙大,定向差,形成无定形区;同时又被木质素和半纤维素包围着,形成一种很牢固的结构,所以完整的纤维素高度不溶于水,难于被降解。
而且,不同原料纤维结构的复杂程度也不一样。
据文献报道,纤维素底物对酶解的敏感度受其结构的影响很大,包括纤维中木质素的含量、比表面积、结晶度及聚合度。
因此要提高酶解效率,必须破坏木质素和半纤维素的结合层,改变纤维素的晶体结构。
2.3 酶和酶用量对酶解的影响纤维素酶是一种复合酶,不同微生物合成的纤维素酶在组成上有显著的差异,对纤维素的酶解能力也不大相同。
关于纤维素酶生产菌主要有细菌,放线菌和丝状真菌等,但对纤维素作用较强的菌株多是木霉属(Trichoder ma)、曲霉属(A s pergillus)、青霉属(Penicilliu m)、Pellienlalia属和枝顶孢霉属(Acre moniu m)的菌株,特别是绿色木霉(Trichoder mauirde)及其近缘菌株。
由里氏木霉(Trichoder mareesei)产生的纤维素霉目前应用最广,该酶系中通常含有高活力的内切型及外切型β-葡聚糖酶,但纤维二糖酶活力很低,而许多曲霉属菌种如黑曲霉(A s pergillusniger)等能产生高活力的纤维二糖酶,酶解时常将里氏木霉与黑曲霉产生的酶制剂按一定比例配合使用,能起到更好效果。
纤维素酶用量对酶解也有影响,在一定酶浓度范围内,随着酶量的增加,纤维素酶解率增大。
文献报道,用纤维素酶对麦草进行酶解,在5g底物中,酶用量100mg 之前,酶解速率增加较快,100mg之后,增加缓慢,说明一定量的纤维素在一定条件下,纤维素分子能和酶分子结合的结合点数有限,当这些结合点全部被纤维素酶分子占据后,再增加纤维素酶用量,起不到酶解作用;另一方面从经济角度考虑,酶用量也要尽可能的少。