人周血淋巴细胞分离液技术要求
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离和提取人体外周血中的淋巴细胞。
下面是使用该试剂的详细说明：
1. 实验准备：
- 准备干净的工作台和操作工具。
- 检查分离液是否过期，确保其保存条件良好。
- 为实验准备足够数量的外周血样本。
2. 样本处理：
- 从被试者的外周血中采集适量的血液。
- 使用无菌技术将血液转移至无菌离心管中。
3. 样本离心：
- 将含有外周血的离心管放入离心机中。
- 以2000-2500转速离心10分钟，使细胞沉淀到离心管底部。
4. 废液处理：
- 弃去上层的血浆和血小板，只留下上清或底部的细胞悬浮液。
5. 细胞分离：
- 将分离液缓慢倒入含有细胞沉淀的离心管中，通常使用10 mL分离液对应1 mL的细胞悬浮液。
- 轻轻摇晃离心管，使分离液均匀混合。
- 静置15-20分钟，使淋巴细胞在分离液中上浮。
6. 细胞收集：
- 将含有上浮淋巴细胞的上清缓慢转移到新的离心管中。
- 用相同的方法重复上述步骤，以提高细胞收集率。
- 将收集到的细胞悬浮于适当的培养基中，进行后续实验。
请注意，这只是一个基本的使用说明，具体的实验步骤和分离效果可能会因实验目的和细胞样本的来源而有所不同。
在进行实验前，建议查阅供应商提供的用户手册，以获得更加详细的使用说明和操作技巧。
同时，使用过程中严格遵守实验室安全操作规范，确保个人和实验室的安全。
希望以上使用说明能够对您的实验工作有所帮助。
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
提取淋巴细胞流程
一、采集血样，室温保存。
使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。
一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为2-5ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。
在无菌的塑料离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在装有2ml血样的真空管中加入2mlPBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀。
然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。
（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。
1500rpm,15min,20摄氏度。
说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。
实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。
（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。
适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。
最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。
3、PBS溶液是一种平衡盐溶液，还可以用Hank’s液或生理盐水代替PBS溶液，但最常用的还是PBS溶液。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液使用说明使用人外周血淋巴细胞分离液的步骤如下：1.样本准备：准备外周血样本，并将其采集到一个干净的试管中。
确保样本是新鲜的，并在使用前充分混合。
2.离心：将样本离心，以去除血浆或血浆和血小板，通常以低速（300×g）离心5-10分钟。
将离心管中的血浆小心吸除。
3.阻止红细胞溶解：加入足够的红细胞阻断缓冲盐溶液到血细胞沉淀中，使其与样本体积相等。
这将阻止红细胞的溶解和污染淋巴细胞。
4.包裹淋巴细胞：将滤质或管中的混合物转移到一个滤筒或离心管中，并加入合适的分离液。
分离液的添加量通常是样本体积的2-3倍。
5.混合和离心：彻底混合分离细胞和分离液，然后以适当的速度和时间进行高速离心（500×g，5-10分钟）。
此步骤将导致淋巴细胞在分离液的底部形成一个沉淀。
6.转移沉淀：使用无菌吸管或移液器小心地将沉淀转移到干净的离心管中，以避免污染。
7.洗涤：向沉淀中加入足够的平衡缓冲盐溶液，如磷酸缓冲盐溶液，轻轻混合后进行低速离心。
再吸去上清液，保留沉淀。
8.储存：沉淀可在冷藏条件下暂时储存，或冷冻保存以备将来使用。
需要注意的是，在使用人外周血淋巴细胞分离液时，一些步骤可能因其具体的类型和制造商而有所不同。
因此，建议在使用前仔细查阅并遵守产品说明书和使用手册。
此外，使用前要确保实验室操作是在严格的无菌条件下进行的，以避免污染和细胞的损伤。
总而言之，人外周血淋巴细胞分离液是一种用于从人类外周血样本中分离和富集淋巴细胞的试剂。
准确遵循产品说明和使用手册中的步骤和建议，能够帮助实验者在研究和临床应用中有效地使用该分离液。
淋巴细胞分层液有两种
淋巴细胞分层液有两种（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。
应用时，用蒸馏水配制9％溶液。
泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。
含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。
应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml，即为33.9％泛影葡胺。
1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：9％聚蔗糖液24份33.9％泛影葡胺液10份混合即可。
必要时，可测比重。
需要备用，可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，4℃保存。
一般可保存3个月。
（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液34％泛影葡胺液10份60％右旋糖酐液12.5份混合，即为比重1.07～1.09的分层液。
分装于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。
一、淋巴细胞分离人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，根据不同试验有相对纯度，尽最大可能保持细胞应有活性。
分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。
本文介绍常用的密度梯度离心法的原理及方法。
人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001。
密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。
常用的分层液有Ficoll，Ficoll是一种合成性蔗糖聚合物的商品名，无毒，但高浓度溶液往往不等渗，且粘性高，易使细胞聚集，常使用60g/L低浓度溶液（密度1.020）加入泛影葡胺（Hypague），应用浓度为340g/L（密度1.200），以泛影葡胺适当比例与Ficoll混合，可配制成比重合适的细胞分层液（密度1.077±0.001）。
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。
参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。
有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。
分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。
现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。
一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。
本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。
肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。
操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。
（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。
本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。
淋巴细胞分离液
二、巨噬细胞吞噬功能测定
实验目的
熟悉小鼠腹腔巨噬细胞的制备方法。 了解巨噬细胞吞噬作用的原理和检测方法。
试剂:
1．淋巴细胞分离液（比重1.0770.001）。 2．肝素溶液 用生理盐水配制成500U/ml。 3．Hanks液。 4．2g/L台盼蓝染液。 5．标本 肝素抗凝的人外周静脉血。 6. 白细胞稀释液。
实验方法
1．室温下，将2ml抗凝血与2ml Hanks液混合
抗凝全血 缓冲液
实验方法
2．取分离液2ml置入灭菌离心管内，用毛细 吸管将稀释血液4ml沿管壁加入离心管，使 稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分离液 与稀释血液体积比例为1：2）。
定时间内来不及测定，可将未加盐酸异丙醇的培 养板置4C保存。测定前取出，室温静置10min 后再加盐酸异丙醇。
实验讨论
1. 试讨论MTT比色法检测淋巴细胞转化的优缺点？ 2. MTT比色法容易因细菌污染导致实验失败，应采取
哪些措施可减少实验误差，使结果可信？
福建医科大学 陈敏
实验三 细胞吞噬率与 吞噬指数测定
实验原理
T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细 胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应， 如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和 核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液。 小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素
100ug/m1，用无菌3% NaHCO3调pH至7.2～7.4。 2. 植物血凝素（PHA）。
吸取白细胞层涂片 染色镜检观察细胞形态
操作步骤
1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入PHA(500g/ml ) 0.1 ml，对照瓶内不加PHA。混匀后置37C、 5%CO2培养箱内孵育72h，期间每天旋转摇匀一 次。
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人外周血淋巴细胞分离液产品技术要求
3.1 产品规格及其划分说明
250ml/瓶、500ml/瓶、
3.2 性能指标
3.2.1 外观
乳光或微乳光液体。
3.2.2 澄清度
比重1.077 –1.080 g/mL
3.2.3 pH值（每升标示量/L）
pH要求为7.1～7.3，允许偏差范围为±0.30。
3.2.4 渗透压/（m0sm/kgH2O）
渗透压为280～340 m0sm/kgH2O
3.2.5 细菌内毒素/（EU/ml）
﹤0.5
3.2.6 无菌检查
3.2.6.1 细菌数
不得检出
3.2.6.2霉菌数
不得检出
3.2.7 细胞分离实验
3.2.7.1 细胞形态
正常。
3.2.7.2细胞分离数量及存活率
数量：90%-95%；存活率：95%-98%
3.2.8 安全性检验项目
抗生素：不得检出。
3.3 检验方法
3.3.1外观检测方法
肉眼观察为乳光或微乳光液体
3.3.2 澄清度的测定
按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨB进行。
3.3.3 pH值的测定
按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅥH进行。
3.3.4 渗透压的测定
按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨG进行。
取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5℅。
3.3.5 细菌内毒素的测定
按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。
3.3.6 无菌检查
按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅪH无菌检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。
检测法采用平皿法。
3.3.7 人周边血淋巴细胞分离计数及存活率检测实验
3.3.7.1 人周边血细胞分离实验
3.3.7.1.1方法提要
1）本实验所用容器具及溶液均为无菌，实验操作过程均为无菌操作。
2）分离外周血，并计数分离所得细胞及细胞存活率
3.3.7.1.2 实验试剂和材料
1）人外周血：新鲜血5ml(加肝素抗凝20u/ml)
2）分离液：本产品样品
3）1640无血清培养液
4）10%NCS
5）3%冰醋酸
6）台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒
3.3.7.1.3 仪器
1）医用超级洁净工作台：洁净级别为百级。
2）二氧化碳恒温培养箱：能通二氧化碳气体并且保持二氧化碳体积分数为（5±0.1）℅，能在（37±1）℃恒温。
3）细胞培养瓶：T25型、无菌。
4）玻璃试管
5）血球计数板
6）盖玻片：无水乙醇浸泡并擦干。
7）水平离心机
3.3.7.1.4 实验步骤
1）分离人周血淋巴细胞
A 新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释
B 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些）
C 小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。
D 离心：
转速：1500/分
温度：20℃－28℃
时间：20分钟
（注意：不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)
E取出试管，看看是不是分为好几层,顺次为血浆---单个核细胞淋巴细胞层－－分离液－－红细胞
F用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，备用
G用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）H离心。
转速：2000－2300r/min （转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开)
时间：10分钟
温度：4℃
I震荡后，用培养液重悬至1ml
J 取100ul重悬液放于96孔板中留着计数用，然后将剩余细胞悬液在离心机上离心
2）计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16
个小正方形.
a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）
b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞
c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。
总共数4大正方形
d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度
e 细胞总数是：细胞浓度x1ml
3）培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。
加入rIL-2（重组人白介素-2）
25－50u/孔后，放入培养箱，在（37±1）℃温度条件及（5±0.1）％二氧化碳体积分数条件下进行培养。
3）细胞存活率
用台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒检测分离的淋巴细胞存活率
A台盼蓝染色：吸取100μl重悬的细胞到常规1.5ml或0.5ml离心管内，加入100μl Trypan Blue stain轻轻混匀，染色3min（染色时间可适当延长，但不宜超过10min)。
B 计数：吸取少量经过染色后的细胞，用血细胞计数板计数。
通常如果要比较精确地进行定量,每个细胞样品至少数500个细胞，数出蓝色细胞和细胞总数。
细胞存活率计算公式如下：细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数×100%
注意事项：
1、试剂(A)、试剂(B)都是无菌的，使用时最好在超净台内进行无菌操作，避免细菌污染。
2、台盼蓝对人体有害，请注意小心操作。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
3.3.7.2 分析结果的表述
分离后的淋巴细胞纯度在90%-95%之间，存活率在95%-98%之间
3.3.8 安全性检验
抗生素残留量：
依据中华人民共和国药典2010年三部附录ⅨA抗生素残留量测定法进行，不得含有青霉素、链霉素以及庆大霉素。
3.4 术语
无。