重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定
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重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定
电泳后的图谱
挑三个菌落 鉴定，图显 示的是三个 菌落中的质 粒双酶切的 结果
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR方法筛选鉴定重组子
• 基本原理： • 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为 已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单 克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。
常用的抗药性选择标记
抗药性 氨苄青霉素 （Amp） 溶解剂 虑过 除菌 是 贮存温度 贮存浓度 终浓度
水
-20℃
50mg/ml
50~100µ g/ml
氯霉素（Cm） 卡那霉素 （Ka或Kan）
四环素（Tet 或Tc） 链霉素（Sm 或Str）
乙醇
否
-20℃
34mg/ml
20~17交液中，在60℃下放置6h；把同 位素标记的DNA探针于100℃变性后加入杂交溶液中，然 后放入滤膜，60℃杂交16－24h。探针的用量一般为105 －106cpm/ml。用2×SSC洗脱3次，每次30min。 • 7 放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保 鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上 作好标记，置于－70℃冰箱暴光48－72h。 • 8 洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂 交结果。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
重组子筛选与鉴定
即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成 菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两 种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重 组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操 作中形成的喷雾、 试剂及任何与扩增产物接触的东 西。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
基因工程简答题总结
基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。
分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。
）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。
7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。
（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。
这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
3、足够多的载体和插入片段是最重要的。
4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
1、抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性 质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
二抗上连着一种酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸 酶、过氧化物酶、脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应 转变成有色物质（或发光）。
（5）比色
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结 果。
3、ELISA的局限性 有效，但敏感性、特异性稍差（主要取决于 一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
将外源DNA片段插在EcoRI
位点，则： 非重组子呈Ampr、Tetr 重组子呈Ampr、Tetr
Apr
将外源DNA片段插在BamHI 位点，则：
非重组子呈Ampr、Tetr 重组子呈Ampr、Tets
（二）、显色筛选法
1、基本原理
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也 可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子 上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产 生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌 质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉 菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。
离质粒DNA并对其进行电泳，带有外源基因的重 组DNA分子的迁移率要低于无外源基因的质粒分 子。 2、操作：
将含有质粒的单重菌落细胞破碎，提取其质粒 D断N含A有，插用入分琼序子脂列量糖的凝重胶组组克电质泳粒，空。观载察体其电泳图谱，判
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
二抗上连着一种酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸 酶、过氧化物酶、脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应 转变成有色物质（或发光）。
（5）比色
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结 果。
3、ELISA的局限性 有效，但敏感性、特异性稍差（主要取决于 一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
将外源DNA片段插在EcoRI
位点，则： 非重组子呈Ampr、Tetr 重组子呈Ampr、Tetr
Apr
将外源DNA片段插在BamHI 位点，则：
非重组子呈Ampr、Tetr 重组子呈Ampr、Tets
（二）、显色筛选法
1、基本原理
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也 可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子 上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产 生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌 质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉 菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。
离质粒DNA并对其进行电泳，带有外源基因的重 组DNA分子的迁移率要低于无外源基因的质粒分 子。 2、操作：
将含有质粒的单重菌落细胞破碎，提取其质粒 D断N含A有，插用入分琼序子脂列量糖的凝重胶组组克电质泳粒，空。观载察体其电泳图谱，判
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重
酶切片段分析法
组
子
筛
RNA水平
选
检测特定外源基因是否转录及转录的强度 （Northern杂交印迹法)
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法）
Westhern印迹杂交法
重点介绍的筛选方法
抗药性筛选 a互补
遗传表型直接选择法
快速裂解菌落鉴定分子大小
限制性内切酶酶切法 PCR方法筛选鉴定重组子 菌落杂交筛选
b：如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中 间，导致抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失活 效应 。
a类筛选
• 基本原理
• 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为重组质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，转 化受体菌后能使后者在含有相应选择药物的选择培养基上 生长，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活。
直接筛选法
• 直接筛选法是借助遗传学表型来进行筛选的方法。
• 重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因表 达，会导致宿主的某些表型的改变，通过琼脂平板中添加 相应筛选物质，可以直接筛选含重组子的菌落。如果质粒 上有两种抗性，因为外源基因的插入，导致其中一个不 能 表达，那么也可以通过抗药性将重组子筛选出来。
间接选择法
遗传学表型筛选的方法之一——抗药性筛选
• 基本原理
• 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，与目的 基因重组后，转入受体菌，能使受体菌带有相应抗药性， 另一种情况是虽然质粒中原来有相应抗性，但插入外源片 段后重组质粒失去抗药性，据此我们也可以进行抗药性筛 选。
重组体分子的选择与鉴定方法及原理
重组体分子的选择与鉴定方法
我们把外源基因导入受体细胞的目的是获得带有目的基因 阳性重组体，因而重组体的筛选是体外重组技术的一个 重 要环节。
涂布菌液，观察平板是无法判断重组子是否是我们所需的。 因此，我们需要进一步进行筛选。
常用的筛选方法概括起来有两大类：①直接筛选法；②间 接筛选法。
常用的抗药性选择标记
抗药性
氨苄青霉素 （Amp）
溶解剂 虑过 贮存温度 除菌
水
是
-20℃
贮存浓度
终浓度
50mg/ml 50~100µg/ml
氯霉素（Cm） 乙醇
否
-20℃ 34mg/ml 20~170µg/ml
卡那霉素 （Ka或Kan） 水
是
-20℃ 10mg/ml
50µg/ml
四环素（Tet
10µg/ml（液）
（筛选）的主要方法。
• 例如：
• 非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性 基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌 可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但 是, 如果在该质粒的氨苄青霉素抗性基因内插入外源片段, 就会造成氨苄青霉素抗性基因失活, 变成ApsTcr, 携带这 种 质粒的宿主菌可以在四环素的平板上生长, 而不能在氨苄 青霉素抗性平板上生长。
B类插入失活筛选步骤
• 注意事项：
• （1）以Amp、Tc等抗生素作为选择药物，37℃培养时间 约12~16h，超过时间视为杂菌（假转化子菌落）。
• （2）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验验证。挑的 菌落在LB培养基中震荡培养。
遗传学表型筛选的方法二—a互补
• 基本原理：
• 这种筛选方法适用于含b-半乳糖苷酶基因的载体。载体在 b-半乳糖苷酶的a-肽编码区具有多克隆区域。重组质粒中 的插入片段使a-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴 别。不带有插入片段的载体表达有活力的b-半乳糖苷酶， 所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉LacZM15基因， 导致内源a-肽失活。载体或其他含LacZ基因的a-肽互补 细菌，具有b-半乳糖苷酶的w片段。
所得到的活力b-半乳糖苷酶（ a-肽加w片段）将底物XGal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体多克隆 区域，克隆上插入片段导致a-肽编码区的破坏，使b-半 乳 糖苷酶失活，得到白色菌落。 a-肽编码区读码框内小的 插入片段产生浅蓝色菌落，因b-半乳糖苷酶只是部分失活。
• 通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的 。这样 一次筛选 可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空 载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组 质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。
或Tc）
乙醇
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
否
-20℃ 12.5mg/ml 12.5µg/ml
（固）
链霉素（Sm
或Str）
水
是
-20℃ 20mg/ml
25µg/ml
A 如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基之外， 不导致抗药性基因的失活，仍能编码抗药性基因产物。 含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼 脂平板上生长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不能 生长而被排除。
a类筛选的实验方法
• LB固体培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板； • 将转化后的菌液均匀涂布在平板上； • 放在37℃培养箱培养12~16小时； • 观察菌落生长情况。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子
间接筛选法
• 间接筛选法是检测重组体克隆中是否含有目的基因的核苷 酸序列或是否产生目的基因所编码的产物。
• 一般来说，先用直接筛选法进行初步筛选后，再用间接检 测法进行鉴定，直至获得我们所需要的阳性重组体。
重组子筛选的方法
遗传表型直接筛选法
核酸分子杂交法
DNA水平
PCR法 DNA序列分析法 直接凝胶电泳法
蓝白斑筛选
X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，IPTG (异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) X-gal被没分解后的产物为5-溴-4-氯-靛蓝
无质粒的 受体菌
b-半乳糖苷酶 部分缺失，不 能分解Xgal； 无抗菌素抗性
不能 正常 生长
无菌斑 生长
质粒转化 的受体菌
b-半乳糖苷酶 的缺失被载体 产物a互补，能 分解Xgal。且 有抗菌素抗性