牛HSL基因的克隆和生物信息学分析
生物技术中的基因克隆和转录组分析
生物技术中的基因克隆和转录组分析随着科技的不断发展，人们对于基因组学的认识不断加深。
生物技术中的基因克隆和转录组分析也成为了当今研究生命科学的核心方法之一。
一、基因克隆基因克隆指的是在体外通过重组DNA技术将一个基因从一种生物体内分离出来，然后将其插入到另一种生物体内，使得该基因在新宿主中继续表达。
基因克隆在生命科学的研究中起到了非常重要的作用。
通过基因克隆技术，科学家可以研究特定基因对生命的影响，进而了解它们在生命过程中的功能。
同时，还可以利用基因克隆技术构建表达载体，将需要表达的基因插入到载体中，并通过转染等手段将其输送到细胞中，以便于分析基因的表达及其功能。
这在药物开发、生物工程、农业等领域中得到了广泛应用。
二、转录组分析转录组是指某个生物体在某个特定时刻内所有的基因在转录水平上的表达总和。
转录组分析可以帮助我们了解细胞在不同条件下的基因表达水平及其差异。
传统的转录组分析方法是PCR、Northern blotting等，这些方法不仅耗时费力，而且可靠性不高。
近年来，随着RNA测序技术的发展，高通量测序技术已成为转录组分析的首选方法。
高通量测序技术包括Illumina/Solexa、Roche 454、Ion Torrent 等。
这些技术的核心在于建库和测序两个环节中的高度自动化，同时运用了并行处理和多道数据分析等技术，因此可用于高通量、高精度的RNA测序，为转录组分析提供了优秀的技术手段。
通过转录组分析，科学家可以清晰地了解基因在不同条件下的表达情况，进而研究基因和生物体间的相互作用，这对于生物的发育、变异、适应性进化等方面都有所帮助。
三、克隆与转录组分析的结合将基因克隆和转录组分析两种技术结合起来，不仅可以构建转录载体，通过转染等手段在某一细胞内表达该基因，也可以对表达的RNA进行高通量测序，以观测细胞在不同条件下的基因表达水平及其差异。
基于克隆和转录组分析的结合技术，可以大大地加快生命科学研究的速度与深度，同时有望为人们带来更多的科技创新和医疗进步。
西藏牦牛NGB基因克隆及生物信息学分析
西藏牦牛NGB基因克隆及生物信息学分析摘要：为探讨脑红蛋白（NGB）在西藏牦牛高原低氧适应机制中的作用，利用分子克隆技术获得了西藏牦牛NGB 基因序列，并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白质的理化性质、疏水性、二级结构等进行了预测分析。
结果发现，NGB基因全长为2 993 bp，编码125个氨基酸；其编码蛋白属于亲水性蛋白，二级结构主要以α螺旋为主。
系统进化树分析表明，西藏牦牛NGB与野牦牛、牛、绵羊等物种的遗传距离较近，具有高度同源性。
关键词：西藏牦牛；NGB基因；克隆；生物信息学分析中图分类号：S823.8+52文献标志码：A文章编号：1002-1302（2015）11-0026-04收稿日期：2015-04-27基金项目：西南民族大学研究生创新型科研项目（编号：CX2015SZ106）；西南民族大学研究生学位点建设项目（编号：2014XWD-S071007）。
作者简介：郭琳（1990―），女，山东菏泽人，硕士研究生，主要从事分子生态学研究。
E-mail：guolin20151@。
通信作者：陈智华，博士，教授，主要从事生物多样性研究。
E-mail：Chenzhihua_czh@。
牦牛（Bos grunniens）属哺乳纲偶蹄目反刍亚目牛科长毛的牛属动物。
主要生活在高寒生态条件下海拔3 000m以上的地区，是青藏高原特有的牛种，被认为是研究高原低氧适应的代表性动物之一[1]。
该物种主要分布于喜马拉雅山、阿尔金山、昆仑山以及祁连山，这些地区海拔高、地势复杂、空气稀薄、气候寒冷，年平均气温在0 ℃以下，最低温度可达-50 ℃，环境极端恶劣复杂。
西藏自治区是我国牦牛的主产区之一，由于各地区自然生态环境条件的差异，形成了桑桑牦牛、丁青牦牛、桑日牦牛、类乌齐牦牛、工布江达牦牛、申扎牦牛、巴青牦牛等不同的地方品种和类群，其中类乌齐牦牛[2]主要分布于西藏自治区昌都市类乌齐县，对于高海拔、含氧量低的高寒地区有着良好的适应性。
牦牛Fas和FasL基因克隆,生物信息学分析及其在主要组织器官中的表达
牦牛Fas和FasL基因克隆，生物信息学分析及其在主要组织器官中的表达牦牛Fas和FasL基因克隆，生物信息学分析及其在主要组织器官中的表达摘要：Fas和FasL是细胞凋亡信号通道中的重要分子，涉及到多种生物学过程的调控。
本研究旨在从牦牛组织中克隆Fas和FasL基因，并利用生物信息学方法对其进行分析，同时探究Fas和FasL在主要组织器官中的表达情况。
通过该研究，我们可以更好地了解牦牛Fas和FasL基因的结构与功能，并为进一步研究其在疾病发生和发展中的作用提供基础。
引言：细胞凋亡是一种高度有序的程序性细胞死亡过程，与组织发育、免疫应答、抗肿瘤等生物学过程密切相关。
Fas和FasL分子作为细胞凋亡通道中的关键调控因子，广泛存在于哺乳动物中。
然而，关于牦牛Fas和FasL基因的研究尚未见报道，因此本研究的重点是从牦牛组织中克隆这两个基因，并对其进行生物信息学分析。
方法与材料:1. 牦牛组织样本获取：选择健康的成年雄性牦牛，从心脏、肝脏、肺、肾脏和脾脏等主要组织中获取组织样本。
2. 提取总RNA：使用RNA提取试剂盒从组织样本中提取总RNA，经测量纯度和浓度后存储于-80°C。
3. cDNA合成：使用逆转录酶将总RNA逆转录为cDNA，制备反应体系并进行反应。
4. PCR扩增和基因克隆：设计Fas和FasL基因的特异引物，进行PCR扩增，将扩增产物连接到适当的载体上，进行转化和筛选，最后得到目标基因的克隆。
5. 生物信息学分析：对Fas和FasL基因进行序列比对、理化性质分析、保守结构域预测、亚细胞定位预测和系统进化分析。
结果：1. 成功从牦牛心脏、肝脏、肺、肾脏和脾脏等主要组织中克隆出Fas和FasL基因。
2. Fas基因全长为XXX bp，包含XXX个氨基酸；FasL基因全长为XXX bp，包含XXX个氨基酸。
3. Fas基因被确定为位于牦牛X染色体上，FasL基因位于牦牛Y染色体上。
美仁牦牛MYL9基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究
中国畜牧兽医 2024,51(4):1410-1419C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 美仁牦牛M Y L 9基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达研究马 荣1,2,喇永福2,包鹏甲2,郭 宪2,路建卫3,扎 老3,赵 雪4,梁春年1,2,成述儒1(1.甘肃农业大学,兰州730070;2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省牦牛繁育工程重点实验室,农业农村部青藏高原畜禽遗传资源育种重点实验室,兰州730050;3.合作市佐盖多玛乡畜牧站,合作747000;4.合作市农畜产品质量安全检测检验中心,合作747000)摘 要:ʌ目的ɔ克隆美仁牦牛肌球蛋白轻链9(m y o s i n l i g h t c h a i n 9,MY L 9)基因C D S 区并对其进行生物信息学分析,检测M Y L 9基因的组织表达特征,为探究该基因功能提供一定理论依据㊂ʌ方法ɔ以美仁牦牛肌肉组织c D N A为模板,利用P C R 扩增并克隆美仁牦牛C D S 区序列,与其他物种进行相似性比对及系统进化树构建;通过在线软件对MY L 9蛋白进行生物信息学分析,利用实时荧光定量P C R 检测M Y L 9基因在美仁牦牛心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁肌肉㊁脂肪和睾丸组织中表达情况㊂ʌ结果ɔ美仁牦牛M Y L 9基因C D S 区长516b p ,共编码171个氨基酸㊂系统进化树结果显示,美仁牦牛与野牦牛㊁普通牛亲缘关系最近,与高山倭蛙亲缘关系最远㊂MY L 9蛋白分子式为C 858H 1324N 234O 274S 12,原子数为2702,理论等电点为4.85,不稳定系数和总平均亲水性分别为37.22和―0.772,属于稳定亲水性蛋白㊂MY L 9蛋白无信号肽和跨膜螺旋结构,属于非分泌性蛋白;主要定位于线粒体㊁细胞核㊁细胞质中,具有17个特异性磷酸化位点㊂MY L 9蛋白二级结构主要由α-螺旋㊁无规则卷曲㊁β-折叠和延伸链构成,三级结构预测结果与二级结构一致㊂实时荧光定量P C R 结果显示,M Y L 9基因在美仁牦牛心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁肌肉㊁脂肪和睾丸组织中均表达,且肝脏和肌肉组织中表达量显著高于其他组织(P <0.05)㊂ʌ结论ɔ本研究成功克隆美仁牦牛M Y L9基因C D S 区,探究了M Y L 9基因的生物学功能及组织表达特征,研究结果为进一步探究牦牛M Y L 9基因功能特征提供了参考㊂关键词:美仁牦牛;M Y L 9基因;克隆;生物信息学;组织表达中图分类号:S 823.8+5文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.04.009 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-10-07基金项目:合作市牦牛种质提升与提质增效项目;现代肉牛牦牛产业技术体系(C A R S -37);甘肃省基础研究创新群体项目(20J R 5R A 580);甘肃省科技重大专项(21Z D 10N A 001,G Z G G -2021-1);中国农业科学院创新工程(25-L I H P S -01)联系方式:马荣,E -m a i l :m a r o n g 202017@q q .c o m ㊂通信作者梁春年,E -m a i l :c h u n n i a n 2006@163.c o m ;成述儒,E -m a i l :c h e n gs r @g s a u .e d u .c n C l o n i n g ,B i o i n f o r m a t i c sA n a l y s i s a n dT i s s u eE x pr e s s i o no f M Y L 9G e n e i n M e i r e nY a k MA R o n g 1,2,L A Y o n g f u 2,B A OP e n g ji a 2,G U O X i a n 2,L UJ i a n w e i 3,Z H A L a o 3,Z H A O X u e 4,L I A N GC h u n n i a n 1,2,C H E N GS h u r u1(1.G a n s uA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730070,C h i n a ;2.K e y L a b o r a t o r y o f An i m a l G e n e t i c s a n dB r e e d i n g o nT i b e t a nP l a t e a u ,M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n dR u r a lA f fa i r s ,K e y L ab o r a t o r y o f Y a kB r e e d i n g E n g i n e e r i n g o f G a n s uP r o v i nc e ,L a n z h o u I n s t i t u t e o f H u s b a nd r y a n dP h a r m a ce u t i c a lS c i e n c e s of C h i n e s eA c a d e m y o f Ag r i c u l t u r a lS c i e n c e s ,L a n zh o u 730050,C hi n a ;3.A n i m a lH u s b a n d r y S t a t i o no f Z o g a i d o m aT o w n s h i p ,H e z u o 747000,C h i n a ;4.Q u a l i t y a n dS a f e t y I n s p e c t i o nC e n t e r o f A gr i c u l t u r a l a n d L i v e s t o c kP r o d u c t s i n H e z u o ,H e z u o 747000,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h eo b j e c t i v eo f t h i se x p e r i m e n tw a s t oc l o n et h eC D Sr e g i o no fm yo s i n4期马荣等:美仁牦牛M Y L9基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达研究l i g h t c h a i n9(MY L9)g e n e i n M e i r e n y a ka n d p e r f o r m b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s,a n dd e t e c t t h e t i s s u e e x p r e s s i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f M Y L9g e n e,s oa s t o p r o v i d ea t h e o r e t i c a l b a s i s f o r e x p l o r i n g t h e f u n c t i o no f t h i s g e n e.ʌM e t h o dɔU s i n g t h ec D N A o fM e i r e n y a k m u s c l e t i s s u ea s t e m p l a t e, P C R w a s u s e d t o a m p l i f y a n d c l o n e t h eC D S r e g i o n s e q u e n c e o fM e i r e n y a k,s i m i l a r i t y c o m p a r i s o n w i t ho t h e r s p e c i e sa n d p h y l o g e n e t i c t r e ec o n s t r u c t i o nw e r ec a r r i e do u t.B i o i n f o r m a t i ca n a l y s i so f MY L9p r o t e i nw a s p e r f o r m e db y o n l i n es o f t w a r e.T h ee x p r e s s i o no f M Y L9g e n e i nh e a r t,l i v e r, s p l e e n,l u n g,k i d n e y,m u s c l e,f a t a n dt e s t i so fM e i l e n y a k w a sd e t e c t e db y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R.ʌR e s u l tɔT h eC D Sr e g i o no f M Y L9g e n e i n M e i r e n y a k w a s516b p,e n c o d i n g171a m i n o a c i d s.P h y l o g e n e t i c t r e e r e s u l t s s h o w e d t h a tM e i r e n y a kh a d t h e c l o s e s t g e n e t i c r e l a t i o n s h i p w i t h B o sm u t u s a n d B o s t a u r u s,a n dt h ef a r t h e s t g e n e t i cr e l a t i o n s h i p w i t h N a n o r a n a p a r k e r i.T h e m o l e c u l a r f o r m u l ao f t h e p r o t e i ne n c o d e db y t h e g e n ew a sC858H1324N234O274S12,t h en u m b e ro f a t o m sw a s2702,t h e t h e o r e t i c a l i s o e l e c t r i c p o i n tw a s4.85,a n d t h e i n s t a b i l i t y c o e f f i c i e n t a n d t h e t o t a l a v e r a g eh y d r o p h i l i c i t y w e r e37.22a n d―0.772,r e s p e c t i v e l y,w h i c h b e l o n g e dt os t a b l e h y d r o p h i l i c p r o t e i n.MY L9p r o t e i n w a s a n o n-s e c r e t e d p r o t e i n w i t h o u t s i g n a l p e p t i d e a n d t r a n s m e m b r a n eh e l i xs t r u c t u r e.I tw a sm a i n l y l o c a l i z e d i n m i t o c h o n d r i a,n u c l e u sa n dc y t o p l a s m, a n dh a d17s p e c i f i c p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s.T h e s e c o n d a r y s t r u c t u r eo fMY L9p r o t e i nw a sm a i n l y c o m p o s e do fa l p h ah e l i x,r a n d o m c o i l,b e t at u r na n de x t e n d e dc h a i n,a n dt h e p r e d i c t e dt e r t i a r y s t r u c t u r ew a s c o n s i s t e n tw i t h t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e.R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C Rr e s u l t s s h o w e d t h a t M Y L9g e n ew a s e x p r e s s e d i nh e a r t,l i v e r,s p l e e n,l u n g,k i d n e y,m u s c l e,f a t a n d t e s t i s,a n d t h e e x p r e s s i o n l e v e l i n l i v e r a n dm u s c l ew a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n o t h e r t i s s u e s(P<0.05).ʌC o n c l u s i o nɔT h eC D Sr e g i o no f M Y L9g e n ei n M e i r e n y a k w a ss u c c e s s f u l l y c l o n e d,a n dt h e b i o l o g i c a l f u n c t i o na n d t i s s u e e x p r e s s i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f M Y L9g e n ew e r e e x p l o r e d.T h e r e s u l t s p r o v i d e d a r e f e r e n c e f o r f u r t h e r r e s e a r c ho n t h e f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s o f M Y L9g e n e i n y a k. K e y w o r d s:M e i r e n y a k;M Y L9g e n e;c l o n i n g;b i o i n f o r m a t i c s;t i s s u e e x p r e s s i o n牦牛是一种主要分布在高山高原地区特有的优质畜种,具有耐粗和耐劳㊁抗逆性㊁抗病性和适应力强等特点[1]㊂它是高原地区人民主要的生产资料,牦牛肉具有低脂肪㊁低热量㊁氨基酸种类丰富且蛋白含量高的特点[2];牦牛乳中的蛋白质㊁脂肪酸㊁糖类㊁矿物质㊁干物质等营养成分含量普遍较高,被称为 天然浓缩乳 [3];其毛皮㊁粪便也在当地得到了充分的利用㊂美仁牦牛是生活在甘南地区的一种优良地方遗传资源[4],其肉质鲜美且产肉性能优于其他普通牦牛品种,故而在整个甘南以及周边地区享誉盛名[5]㊂肌球蛋白复合物在肌肉细胞中主要负责肌肉收缩,而且参与其他细胞的结构㊁运动㊁黏附以及细胞分裂等生理过程[6]㊂肌球蛋白重链主要参与其结构的核心,而肌球蛋白轻链则必须缠绕在重链上从而调节其稳定性和功能性的完善[7]㊂肌球蛋白轻链9 (m y o s i n l i g h t c h a i n9,MY L9)是肌球蛋白结构中调节其活性的轻链,作为一种肌动蛋白的分子马达,可催化A T P水解以促进肌动蛋白定向运动[8-9]㊂研究证明,MY L9蛋白受到轻链激酶和轻链磷酸酶双重调控从而发挥功能,通过局部磷酸化激活肌球蛋白的活性,完成肌丝运动组装,且此过程还伴随着细胞迁移的尾部收缩[10]㊂在有关人M Y L9基因的研究中发现,该基因第4外显子缺失导致胃肠道平滑肌收缩力不足,同时阻碍肌动蛋白和肌球蛋白的结合,表现出胃肠道和泌尿道平滑肌运动障碍等临床症状[11]㊂M Y L9基因还参与细胞增殖反应,MY L9蛋白是心肌素的相关转录因子(M R T F-A)的靶标位点,通过相关信号通路参与调节平滑肌细胞的增殖和形态变化[12]㊂MY L9蛋白与肌球蛋白重链9 (MY H9)等相关蛋白结合,加快形成放线菌素环,从而调控细胞分裂[13]㊂此外,在骨骼肌的生长发育过程中,M Y L9基因发挥的作用也是不可缺失的[14]㊂研究发现,小鼠胚胎M Y L9基因缺失,胚胎中的钙黏素随之减少导致胚胎死亡,说明该基因在正常小鼠胚胎细胞形成是必需的[15];M Y L9基因表达量变化会导致小鼠血管收缩性㊁血压稳定性及血管通透性发生改变[16-17]㊂目前有关M Y L9基因在牦牛上1141中国畜牧兽医51卷的研究报道较少㊂因此,本研究拟克隆美仁牦牛M Y L9基因C D S区,利用生物信息学在线软件分析预测其结构特征,并检测M Y L9基因在美仁牦牛不同组织中的表达差异,以期为今后深入研究M Y L9基因的功能提供一定的理论依据㊂1材料与方法1.1样品采集试验随机选取3头30月龄体格健壮的美仁牦牛(由甘肃省甘南藏族自治州合作市佐盖多玛乡提供),屠宰后迅速采集心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁肌肉㊁脂肪和睾丸组织,于―80ħ保存备用㊂1.2主要试剂及仪器T r i z o l试剂㊁反转录试剂盒㊁实时荧光定量试剂盒㊁p M D19-T载体和大肠杆菌D H5α感受态细胞均购自宝生物工程(大连)有限公司;2ˑT a q P C R M i x (+D y e)㊁2ˑS Y B R G r e e nP r o T a q H sP r e m i x均购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司;D N A凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司㊂电泳仪D Y Y-6C购自北京六一生物科技有限公司;超微量分光光度计N a n o D r o p2000㊁P C R仪(P r oF l e x T M P C R)均购自西安基因有限公司;凝胶成像系统(T a n o n2500)购自上海天能科技有限公司㊂1.3引物设计与合成根据N C B I数据库中野牦牛M Y L9基因m R N A序列(G e n B a n k登录号:X M_005896018.2),确定其C D S区序列,利用P r i m e rP r e m i e r6.0软件和N C B I在线工具分别设计P C R扩增引物和实时荧光定量P C R引物,引物信息见表1㊂引物均由西安擎科生物技术有限公司合成㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')片段大小F r a g m e n t s i z e/b p退火温度A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e/ħ用途A p p l i c a t i o n M Y L9F:C A G C C A A G A T G T C C A G T A52052C D S区扩增R:C C T A G T C A T C C T T G T C C T TM Y L9F:G G C C T C A A T G G G T T T C A T C C15753实时荧光定量P C R R:T T T G A G G A T G C G G G T G A A C TG A P DH F:A A T G A A A G G G C C A T C A C C A T C20453实时荧光定量P C RR:G T G G T T C A C G C C C A T C A C A1.4总R N A提取及c D N A合成取出适量―80ħ冻存的各组织样品,放入盛有液氮的研钵中进行研磨,在研磨过程中,少量多次添加液氮,确保研钵中有液氮存在,将研磨完成的样品装入1.5m L离心管中㊂使用T r i z o l法[9]提取总R N A,利用紫外光分光光度计检测样品浓度和纯度,计算D260n m/D280n m值(1.8~2.0),检验提取的R N A质量㊂以2μg R N A为模板,按照反转录试剂盒说明书将其反转录合成c D N A,―20ħ保存备用㊂1.5美仁牦牛M Y L9基因C D S区克隆以美仁牦牛肌肉组织c D N A为模板,利用P C R 扩增M Y L9基因C D S区㊂P C R反应体系25μL: c D N A2μL,2ˑT a q P C R M i x(+D y e)12.5μL,上㊁下游引物(10μm o L/L)各1μL,d d H2O8.5μL㊂P C R反应条件:94ħ预变性30s;98ħ变性10s, 52ħ退火30s,72ħ延伸1m i n,共35个循环; 72ħ延伸2m i n㊂P C R扩增产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定㊂利用D N A回收试剂盒将目的片段纯化回收,并连接p M D19-T载体,连接产物转化大肠杆菌D H5α感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素的L B固体培养基上,置于37ħ恒温培养箱12h㊂挑选阳性菌液提取质粒,并将其送西安擎科生物技术有限公司进行测序㊂1.6相似性比对及系统进化树构建使用D N A S t a r软件将美仁牦牛M Y L9基因序列推导成氨基酸序列,并从G e n B a n k中下载野牦牛(登录号:M X Q86771.1)㊁普通牛(登录号:N P_ 001068702.1)㊁马来穿山甲(登录号: K A I5940518.1)㊁非洲象(登录号:X P_003411740.1)㊁红冠鸨(登录号:N X E15072.1)㊁白尾海雕(登录号: K F P99200.1)㊁食蟹猴(登录号:X P_045250396.1)㊁小鼠(登录号:B A E35452.1)㊁恒河鳄(登录号:X P_ 019368611.1)及高山倭蛙(登录号:X P_018413187.1)的M Y L9基因氨基酸序列㊂利用M e g A l i g n和M e g a 11.0软件进行相似性对比和系统进化树构建㊂21414期马荣等:美仁牦牛M Y L9基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达研究1.7生物信息学分析利用O R FF i n d e r在线工具对美仁牦牛M Y L9基因序列进行开放阅读框分析,通过N C B IB L A S T 在线软件对美仁牦牛与野牦牛㊁普通牛的M Y L9基因C D S序列进行对比㊂利用P r o t P a r a m㊁P r o t S c a l e㊁S i g n a l P4.1在线软件对美仁牦牛MY L9蛋白分别进行理化性质㊁亲/疏水性㊁信号肽分析;通过N e t P h o s3.1㊁T MHMM㊁P S O R TⅡ㊁S O P MA㊁S W I S S-MO D E L㊁S T R I N G10.5在线软件进行磷酸化位点㊁跨膜结构㊁亚细胞定位㊁二级结构㊁三级结构㊁蛋白互作网络预测㊂具体生物信息学分析在线工具见表2㊂表2生物信息学在线工具T a b l e2O n l i n e t o o l s f o r b i o i n f o r m a t i c s软件名称S o f t w a r en a m e网址W e b s i t e 功能预测F u n c t i o n p r e d i c t i o nO R FF i n d e r h t t p s:ʊw w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/g o r f/g o r f.h t m l开放阅读框B L A S T h t t p s:ʊb l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/碱基序列对比P r o t P a r a m h t t p s:ʊw e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m理化性质P r o t S c a l e h t t p s:ʊw e b.e x p a s y.o r g/p r o t s c a l e亲/疏水性S i g n a l P4.1h t t p:ʊw w w.d e t a i b i o.c o m/t o o l s/s i g n a l-p e p t i d e.h t m l信号肽N e t P h o s3.1h t t p:ʊw w w.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/N e t P h o s/磷酸化位点TMHMM h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/TMHMM-2.0/跨膜结构P S O R TⅡh t t p s:ʊw w w.g e n s c r i p t.c o m/p s o r t.h t m l亚细胞定位S O P MA h t t p s:ʊn p s a-p r a b i.i b c p.f r/c g i-b i n/n p s a_a u t o m a t.p l?p a g e=n p s a%20_s o p m a.h t m l二级结构S W I S S-MO D E L h t t p s:ʊs w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g三级结构S T R I N G10.5h t t p s:ʊw w w.s t r i n g-d b.o r g/蛋白互作网络1.8实时荧光定量P C R检测美仁牦牛M Y L9基因组织表达特征使用实时荧光定量P C R方法检测M Y L9基因在牦牛各组织(心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁肌肉㊁脂肪和睾丸组织)中的表达情况㊂P C R反应体系20μL:c D N A1μL,2ˑS Y B R G r e e nP r o T a q H s P r e m i x10μL,上㊁下游引物(10μm o L/L)各0.4μL,d d H2O8.2μL㊂P C R反应条件:95ħ预变性30s;95ħ变性5s,53ħ退火30s,65ħ延伸5s,共45个循环;95ħ延伸5s㊂试验设置3个重复,以G A P DH为内参基因,运用2―ΔΔC t法[10]计算目的基因的相对表达量㊂1.9数据统计分析试验数据使用G r a p h P a dP r i m9.5软件作图,并进行单因素方差分析和T u r k e y法多重比较,结果以平均值ʃ标准误表示,P<0.05表示差异显著㊂2结果2.1美仁牦牛M Y L9基因C D S区克隆P C R扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,扩增条带单一,大小为520b p(图1),与预期片段一致㊂测序结果表明,克隆获得的美仁牦牛M Y L9基因C D S区序列为516b p,其中A T和C G 含量分别为42.69%和57.31%,可用于后续分析㊂图1美仁牦牛M Y L9基因P C R扩增电泳图F i g.1P C Ra m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h e r o g r a mo f M Y L9g e n e i n M e i r e n y a k2.2相似性比对及系统进化树构建相似性比对结果显示,美仁牦牛M Y L9基因氨基酸序列与野牦牛㊁普通牛㊁马来穿山甲㊁非洲象㊁红冠鸨㊁白尾海雕㊁食蟹猴㊁小鼠㊁恒河鳄㊁高山倭蛙相似性分别为98.8%㊁98.8%㊁98.2%㊁98.2%㊁97.7%㊁97.7%㊁97.1%㊁97.1%㊁96.5%㊁95.9%(图2)㊂系统进化树结果显示,美仁牦牛与野牦牛㊁普通牛亲缘关系最近,与高山倭蛙亲缘关系最远(图3)㊂3141中 国 畜 牧 兽 医51卷图2 不同物种M Y L 9基因氨基酸序列相似性比对F i g .2 S i m i l a r i t y a l i g n m e n t o f a m i n o a c i d s e q u e n c e o f M Y L 9g e n e a m o n g d i f f e r e n t s pe c i es 图3 不同物种间M Y L 9基因系统进化树F i g .3 P h y l o g e n e t i ct r e e o f M Y L 9g e n e a m o n g d i f f e r e n t s pe c i e s 2.3 生物信息学分析2.3.1 C D S 区序列分析 利用N C B I 在线软件O R FF i n d e r 进行开放阅读框分析,结果显示,美仁牦牛M Y L 9基因具有4个完整开放阅读框,其中C D S 区长516b p ,编码171个氨基酸(图4),与P C R 扩增结果相符㊂图4 美仁牦牛M Y L 9基因开放阅读框分析F i g .4 O p e n r e a d i n g f r a m e a n a l ys i s o f M Y L 9g e n e i nM e i r e n y a k 通过N C B I B L A S T 在线软件对美仁牦牛M Y L 9基因C D S 区与G e n B a n k 中野牦牛M Y L 9基因(登录号:X M _005896018.2)进行比对,结果显示野牦牛196~355b p 之间无碱基(图5A );与普通牛M Y L 9基因C D S 区序列(登录号:N M _001075234.1)进行对比分析,结果显示两者相似性达99.04%,其中部分碱基存在差异,分别为14G d e l ㊁224C>T ㊁239A>G ㊁287G>A ㊁296C >T (图5B )㊂图5 美仁牦牛与野牦牛(A )和普通牛(B )M Y L 9基因碱基序列比对分析F i g .5 C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f M Y L 9g e n e b a s e s e qu e n c e b e t w e e n M e i r e n y a k a n d B o s m u t u s (A )a n d B o s t a u r u s (B)41414期马 荣等:美仁牦牛M Y L 9基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达研究2.3.2 理化性质和亲/疏水性分析 利用P r o t P a r a m 在线软件对美仁牦牛MY L 9蛋白进行理化性质分析,结果显示,MY L 9蛋白分子式为C 858H 1324N 234O 274S 12,分子质量为19.68608k u ㊂MY L 9蛋白由19种基本氨基酸组成(表3),其中谷氨酸(10.50%)㊁天冬氨酸(8.80%)比例较高,半胱氨酸(0.60%)比例最低㊂包含22个带正电荷的氨基酸残基(精氨酸+赖氨酸),33个带负电荷的氨基酸残基(天冬氨酸+谷氨酸)㊂蛋白理论等电点为4.85,不稳定指数为37.22,属稳定蛋白㊂利用P r o t S c a l e 在线软件预测美仁牦牛M Y L 9蛋白亲/疏水性,结果显示,该蛋白总平均亲水性为―0.772,属亲水性蛋白(图6)㊂表3 美仁牦牛M Y L 9蛋白氨基酸组成T a b l e 3 A m i n o a c i d c o m p o s i t i o no fM Y L 9p r o t e i n i n M e i r e n y a k 氨基酸A m i m o a c i d s 数量N u m b e r/个占比P r o po r t i o n /%氨基酸A m i m o a c i d s数量N u m b e r/个占比P r o po r t i o n /%丙氨酸A 1a (A )127.00亮氨酸L e u (L )95.30精氨酸A r g(R )95.30赖氨酸L y s (K )137.60天冬酰胺A s n (N )95.30甲硫氨酸M e t (M )116.40天冬氨酸A s p (D )158.80苯丙氨酸P h e (F )148.20谷氨酰胺G l n (Q )63.50脯氨酸P r o (P )63.50谷氨酸G 1u (E )1810.50丝氨酸S e r (S)74.10甘氨酸G 1y (G )116.40苏氨酸T h r (T )116.40组氨酸H i s (H )42.30酪氨酸T y r (Y )31.80异亮氨酸I 1e (I)84.70缬氨酸V a l (V )42.30半胱氨酸C ys (C )10.60图6 美仁牦牛M Y L 9蛋白亲/疏水性分析F i g .6 H y d r o p h i l i c i t y a n dh y d r o p h o b i c i t y a n a l y s i so f M Y L 9pr o t e i n i n M e i r e n y a k 2.3.3 信号肽㊁跨膜结构域及亚细胞定位预测 利用在线软件S i gn a l P4.1分析MY L 9蛋白信号肽,结果显示无信号肽(图7);利用T MHMM 在线工具预测蛋白跨膜结构发现,MY L 9蛋白无明显跨膜螺旋结构,跨膜螺旋氨基酸残基数量的期望值为0.01489,膜细胞质侧存在氨基酸总概率为0.56441(图8);利用P S O R TⅡ在线软件预测美仁牦牛MY L 9蛋白亚细胞定位,结果显示,该蛋白43.50%定位于线粒体,34.80%定位于细胞核,21.70%定位于细胞质㊂图7 美仁牦牛M Y L 9蛋白信号肽预测F i g .7 S i g n a l p e pt i d e p r e d i c t i o n o fM Y L 9p r o t e i n i nM e i r e n y a k 2.3.4 磷酸化位点预测 利用在线软件N e t P h o s 3.1预测蛋白磷酸化位点,结果显示,美仁牦牛MY L 9蛋白存在25个磷酸化位点,其中17个磷酸化位点具有特异性(7个丝氨酸(S )磷酸化位点,7个苏氨酸(T )磷酸化位点,3个酪氨酸(Y )磷酸化位点),8个磷酸化位点不具有特异性(图9)㊂2.3.5 二级结构和三级结构预测 利用在线软件S O P MA 对美仁牦牛MY L 9蛋白的二级结构进行预测,结果显示,该蛋白α-螺旋㊁无规则卷曲㊁β-折叠和延伸链的氨基酸数量分别为95㊁56㊁14和6个,占比分别为55.56%㊁32.75%㊁8.19%和3.51%(图10)㊂5141中 国 畜 牧 兽 医51卷利用S W I S S -M O D E L 在线软件预测蛋白三级结构,结果显示,全球模型质量估计(G M Q E )值为0.84,与模板的相似性为98.82%,三级结构预测结果与二级结构相符,均以α-螺旋和无规则卷曲为主(图11)㊂图8 美仁牦牛M Y L 9蛋白跨膜结构域预测F i g.8 T r a n s m e m b r a n ed o m a i n p r e d i c t i o no f M Y L 9p r o t e i n i n M e i r e n y ak图9 美仁牦牛M Y L 9蛋白磷酸化位点预测F i g .9 P h o s p h o r y l a t i o ns i t e p r e d i c t i o no f M Y L 9p r o t e i ni n M e i r e n y akh ,α-螺旋;t ,β-折叠;c ,无规则卷曲;e ,延伸链h ,A l p h ah e l i x ;t ,B e t a t u r n ;c ,R a n d o mc o i l ;e ,E x t e n d e d c h a i n 图10 美仁牦牛M Y L 9蛋白二级结构预测F i g .10 S e c o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o no f M Y L 9p r o t e i ni n M e i r e n y ak图11 美仁牦牛M Y L 9蛋白三级结构预测F i g .11 T e r t i a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o no f M Y L 9p r o t e i ni n M e i r e n y a k2.3.6 蛋白互作网络分析 利用在线软件S T R I N G10.5预测蛋白互作网络,结果显示MY L 9蛋白与肌球蛋白轻链激酶(MY L K )㊁肌球蛋白轻链激酶3(MY L K 3)㊁MY L K 4㊁MY L 6㊁MY L 6B ㊁MY H 9㊁MY H 10㊁MY H 11㊁平滑肌α-肌动蛋白(A C T A 2)㊁蛋白磷酸酶P P 1(P P P 1C B )蛋白存在互作关系㊂互作网络共有11个节点和41条边,每个节点的平均度数为7.45,局部平均聚类系数为0.882(图12)㊂图12 美仁牦牛M Y L 9蛋白互作分析F i g .12 P r o t e i n i n t e r a c t i o nn e t w o r k a n a l y s i s o fM Y L 9p r o t e i n i n M e i r e n y a k2.4 美仁牦牛M Y L 9基因的组织表达特征分析实时荧光定量P C R 结果显示,M Y L 9基因在美仁牦牛心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁肌肉㊁脂肪和睾丸组织中均有表达,其中肝脏和肌肉组织中表达量显著高于其他组织(P <0.05,图13)㊂61414期马 荣等:美仁牦牛M Y L 9基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达研究肩标不同字母标注表示差异显著(P <0.05);肩标相同字母标注表示差异不显著(P >0.05)V a l u e s w i t h d i f f e r e n tl e t t e rs u p e r s c r i p t s m e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05);W h i l e w i t h t h e s a m e l e t t e rs u p e r s c r i p t sm e a nn o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05)图13 美仁牦牛M Y L 9基因组织表达分析F i g .13 T i s s u e e x pr e s s i o no f M Y L 9g e n e i n M e i r e n y a k 3 讨 论MY L 9蛋白属于E F h -P E F 超家族一员,是一种具有保守结构域F R Q 1的免疫球蛋白[18]㊂本研究成功克隆美仁牦牛M Y L 9基因C D S 区序列,全长516b p ,编码171个氨基酸㊂相似性比对发现,美仁牦牛与野牦牛㊁普通牛㊁马来穿山甲等氨基酸序列相似性较高㊂系统进化树结果显示,美仁牦牛与野牦牛㊁普通牛亲缘关系最近,与高山倭蛙亲缘关系最远,表明美仁牦牛M Y L 9基因在进化过程中保守性强㊂MY L 9蛋白分子式为C 858H 1324N 234O 274S 12,编码的171个氨基酸中,谷氨酸含量最多,其中带正㊁负电荷的氨基酸残基数分别为22和33个,推测该蛋白可能带负电荷㊂通过在线软件分析发现,美仁牦牛MY L 9蛋白不存在信号肽和跨膜螺旋结构,为非分泌蛋白㊂与焦迪等[18]在陆川猪MY L 9蛋白上的研究结果一致㊂蛋白质修饰不仅影响蛋白活性及稳定性,且会对蛋白互作存在一定调节作用[19]㊂一般蛋白质修饰有磷酸化㊁甲基化㊁乙酰化等㊂本研究结果表明,美仁牦牛MY L 9蛋白存在特异性磷酸化位点共17个,其中有7个丝氨酸磷酸化位点㊁7个苏氨酸磷酸化位点㊁3个酪氨酸磷酸化位点㊂有研究证实MY L 9蛋白能在机体内发生α-氨甲基化(N α-m e t h y l )和α-氨乙酰化(N α-a c e t yl )修饰状态[20]㊂蛋白质三级结构模型符合二级结构预测,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,间接证明该蛋白具有较强稳定性[21]㊂蛋白互作分析结果显示,牦牛MY L 9蛋白与MY L K ㊁MY L K 3㊁MY L K 4㊁MY L 6等蛋白可能存在互作关系㊂研究报道,在轻链激酶和轻链磷酸酶双重调控下MY L 9蛋白发挥一定功能[10],与预测互作蛋白结果相符合㊂研究证明,MY L 9蛋白通过MA L /S R F 复合物调节从而参与血小板生成和巨核细胞迁移的生理过程[22];在巨核细胞和血小板细胞中,MY L 9蛋白受R U N X 1转录因子的调控,而转录因子因突变产生的肌球蛋白磷酸化,会导致M Y L 9基因转录减少,血小板也随之减少,间接说明M Y L 9基因与先天性血小板减少症存在关系[23]㊂C D 69是一种白细胞活化标志物,细胞中血小板和MY L 9蛋白形成一个网状结构,在小鼠的发炎肺血管组织中大量检测到这种网状结构,表达C D 69的T 细胞连接到该网状结构,经过这个结构从而进入发炎组织进行免疫工作[24]㊂M Y L 9基因的表达与不同肿瘤中相关成纤维细胞㊁B 细胞㊁C D 8+T 细胞㊁C D 4+T 细胞㊁巨噬细胞㊁嗜中性粒细胞㊁树突状细胞的浸润及免疫标志物的表达显著相关,这间接证明MY L 9蛋白的功能机制涉及到免疫系统[25]㊂肝脏作为动物机体的主要器官,也具备淋巴组织的一些功能,同时也参与机体各类免疫应答[26]㊂有研究报道,肝脏组织中具有C D 8+T 细胞增殖的茧样 结构[27],这种 茧样 可以使T 细胞扩增50~100倍,从而放大其免疫功能[28]㊂本研究结果显示,M Y L 9基因在美仁牦牛各组织中均有表达,其中肝脏和肌肉组织中表达量显著高于其他各组织㊂推测M Y L 9基因在肝脏组织高表达可能也与此有关㊂MY L 9蛋白作为肌球蛋白复合物的轻链异构体,在牦牛肌肉组织中高表达也符合实际情况㊂研究发现,M Y L 9基因在肌肉组织中表达情况严重影响着机体细胞以及血管收缩性[16]㊂焦迪等[18]研究表明,猪背最长肌中的M Y L 9基因表达量与猪生长速度㊁肌肉生成速度成正比,推测牦牛M Y L 9基因在肌肉组织中的表达差异同样也可能会影响其生长速度㊂本研究初步探究了美仁牦牛M Y L 9基因序列结构和组织表达特征,为进一步研究牦牛M Y L 9基因相关工作提供一定理论依据和科学基础㊂4 结 论本研究成功克隆美仁牦牛M Y L 9基因C D S区,长度为516b p ,编码171个氨基酸,与野牦牛㊁普通牛亲缘关系最近,与高山倭蛙亲缘关系最远㊂美7141中国畜牧兽医51卷仁牦牛MY L9蛋白属于非分泌㊁稳定性亲水蛋白,主要定位于线粒体中㊂二级结构主要由α-螺旋㊁无规则卷曲㊁β-折叠和延伸链组成㊂M Y L9基因在肝脏和肌肉组织中表达水平显著高于其他组织㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]朱国兴,张云玲.浅谈我国牦牛业生产现状及发展思路[J].中国畜牧杂志,2005,1:63-65.Z HU G X,Z HA N G Y L.P r o d u c t i o n s t a t u s a n dd e v e l o p m e n ti d e a s o f y a k i n d u s t r y i n C h i n a[J].C h i n e s e J o u r n a lo f A n i m a lS c i e n c e,2005,1:63-65.(i nC h i n e s e)[2]杨斌,陈峰,魏彦杰,等.牦牛肉加工与发展现状[J].肉类研究,2010,6:3-5.Y A N G B,C H E N F,W E I Y J,e t a l.T h e p r e s e n td e v e l o p m e n t a n d p r o c e s s i n g s i t u a t i o no f y a k[J].M e a tR e s e a r c h,2010,6:3-5.(i nC h i n e s e)[3]张蓝月,孙万成.牦牛乳制品研究进展[J].乳业科学与技术,2022,45(2):60-64.Z HA N GLY,S U N W C.P r o g r e s s i n t h e d e v e l o p m e n to f y a kd a i r yp r o d u c t s[J].J o u r n a l o f D a i r y S c i e n c ea n dT e c h n o l o g 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转基因克隆牛技术解析
转基因克隆牛可能遇到的问题
2
移植、胚胎培养和移植等步骤，通过这些技术手
转基因克隆牛在研究过程中可能面临伦理道德问
段实现对牛的遗传改良。
题、基因表达不稳定以及克隆效率低等问题，这
些问题需要进一步研究和解决。 3 转基因克隆牛的研究进展
目前，转基因克隆牛的研究取得了一定的进展，
成功克隆出具有特定遗传特征的牛，为畜牧业的
转基因克隆牛的经济 影响
转基因克隆牛可提高奶牛产 奶量和肉质，降低生产成本 ，对农业经济产生积极影响 ，但也可能引发市场垄断等 问题。
转基因克隆牛的社会 伦理争议
转基因克隆牛涉及到生命伦 理、生态环境等多方面问题 ，引发了广泛的社会关注和 讨论，如何平衡科技进步与 伦理道德成为亟待解决的问 题。
谢谢大家
02 转基因克隆牛的技术 路线
转基因克隆牛的技术路线
克隆技术原理
转基因技术应用
克隆牛研究进展
克隆技术是利用生物技术， 通过体细胞核移植方法，使 一个生物的细胞核植入到另 一个已经去除细胞核的卵细 胞中，从而创造出与原个体 基因完全相同的新个体。
转基因技术是将外源基因导 入到受体生物的基因组中， 使其表达出具有特定功能的 蛋白质或多肽，用于改良生 物性状、提高产量和抗病能 力等目的。
发展提供了新的思路和方法。
05 转基因克隆牛的未来 展望
转基因克隆牛的未来展望
转基因克隆牛的商业 化前景
随着技术的进步，转基因克 隆牛有望在未来实现大规模 商业化生产，为人类提供更 优质的肉类产品。
转基因克隆牛在医学 研究中的应用
转基因克隆牛的生物特性可 为人类医学研究提供新的研 究对象，例如研究基因与疾 病的关系，开发新的治疗方 法等。
牛干扰素-γ基因克隆、序列分析及其表达产物的生物学活性研究（六）
⽜⼲扰素-γ基因克隆、序列分析及其表达产物的⽣物学活性研究（六）第五章结论1 根据GenBank上发表的⽜⼲扰素－γ基因序列设计引物。
从⽤PHA诱导的⽜外周⾎淋巴细胞中提取基因组RNA，采⽤RT-PCR技术，扩增出⼲扰素－γ基因并进⾏了序列分析，结果表明，⽜⼲扰素－γ基因序列全长517bp，开放阅读框架内包含501个核苷酸，共编码166个氨基酸，分⼦量19.4kd，与参考序列完全⼀致。
2 ⾸次采⽤温度诱导的原核pBV220⾼效表达质粒载体并成功构建了pBV220-BoIFN-γ重组表达体系，温度诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析在19.4kd左右出现了1条特异性蛋⽩带，与预测分⼦量⼤⼩⼀致，蛋⽩产量约占菌体总蛋⽩的15%，经蛋⽩可溶性分析，所表达蛋⽩以包涵体形式存在。
3 成功的对包涵体进⾏了变性、复性。
采⽤免疫荧光实验⽅法证明了pBV220-BoIFN-γ重组表达载体已构建并表达成功。
4 通过超声波破碎提取的重组BoIFN-γ包涵体可以使鸡体产⽣特异性抗BoIFN-γ的抗体，再次表明pBV220-BoIFN-γ重组质粒在⼤肠杆菌中通过温度诱导已成功表达。
5 重组⽜γ—⼲扰素具有⼀定的⽣物学活性，对⽜外周⾎淋巴细胞具有抑制其分裂及抗其凋亡的作⽤。
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牛亲子鉴定技术研究进展
牛亲子鉴定技术研究进展牛亲子鉴定技术是现代畜牧业的一项重要技术，可用于确定牛群的亲权关系、遗传倾向性、种类纯度等。
随着分子生物学技术、生物信息学技术的发展，牛亲子鉴定技术也得到了快速发展。
本文将对牛亲子鉴定技术的研究进展进行简要介绍。
一、PCR-RFLP技术PCR-RFLP技术是通过PCR扩增特定基因区域后，使用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到DNA片段长度不同的多个特异性条带，从而实现对基因型的鉴定和亲权关系的确认。
该技术特点是简单易行、成本低廉，但比较耗时，需要对特定的基因位点进行PCR扩增和酶切操作。
二、DNA指纹图谱技术DNA指纹图谱技术是通过对牛基因组DNA进行多态性分析，得到每个个体独特的DNA指纹图谱，再通过比较不同个体之间DNA指纹图谱的相似性程度，确定它们之间的亲权关系。
该技术特点是高分辨率，可同时分析多个基因座，但需要较高的仪器设备和技术条件，并且比较难以应用到大规模鉴定中。
三、基因芯片技术基因芯片技术是通过将数千个核酸探针固定在芯片上，对基因组DNA进行高通量检测，可实现对数百个基因座进行检测和鉴定。
该技术特点是高效、高通量，能够快速鉴定大规模牛群，但是设备成本较高。
四、基于PCR和DNA测序技术的SNP分型单核苷酸多态性（SNP）是生物体中最为广泛的遗传多态性，与牛的生物学特性和育种有密切关系。
基于PCR和DNA测序技术的SNP分型技术利用高通量测序技术得到基因SNP信息，再通过PCR扩增和测序分析，可对SNP进行检测和鉴定，从而实现对牛的基因型鉴定和亲权关系的确认。
该技术特点是快速、准确、高效，能够同时分析数千个基因座，适用于大规模鉴定和育种。
总之，牛亲子鉴定技术得到了长足的发展，其中PCR-RFLP技术已经相对成熟，DNA指纹图谱技术、基因芯片技术以及基于PCR和DNA测序技术的SNP分型等新技术也正在不断完善和应用中。
随着技术的不断进步和完善，牛亲子鉴定技术将在畜牧业和生物学研究领域发挥越来越重要的作用。
水牛TLR2cDNA的克隆与生物信息学分析
Ｐｒ ｒ ｓ ｎ Ｖ ｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｅ ｃｎｅ ｏｇ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎ ｒ ｄｉｉ
水 牛 ＴＬ ＤＮＡ 的 克 隆 与 生 物 信 息 学分 析 Ｒ２ｃ
张 晓 茹 扒 ， 匡文 华ｈ ， 成 鹰 杜 丽’ 张冬 琳 ， ， ， 郝 永 昌 雷 明 刘 涛 焦寒伟 ， ， ， ， 王凤 阳ｈ ， 超 祁
（． １海南大学农学 院， 海南省热带 动物 繁育与疫病研究重点实验室（ ） 海 １市动物基因工程重点实验室 ， 筹 ， ２ １
海 南 海 口 ５ ０ ２ ；． 中 师 范 大 学生 命 科 学 学 院 ， ７２８２华 湖北 武汉 ４ ０ ７ ） ３ ０ ９
摘 要 ： Leabharlann 研 究通 过 ＲＴ Ｐ Ｒ分 段 扩增得 到 水牛 Ｔ ｌ样 受体 ２ ＴＬ ）ｃ ＮＡ 序 列 ， —Ｃ ｏｌ （ Ｒ２ Ｄ 并利 用亚 克隆 重叠 区进 行全 长序 列拼 接 。将拼接 产 物 与 ｐ ２ － 载 体连 接 ， ＭＤ ０Ｔ 重组 质 粒 经 Ｐ Ｒ酶 切 鉴 定后 测序 ， Ｃ 并进 行 生 物
ＴＬ ｓ的 发 现 源 于 对 果 蝇 Ｔ ｌ 蛋 白 的 研 究 ， ９ ７ Ｒ ｏｌ １ ９
亡 与抗凋 亡作 用 ； ④促 进 免 疫细 胞 Ｄ Ｃ成 熟 ； ⑤参 与 Ｔ 细胞记 忆 形 成 ； 参 与 吞 噬作 用 ； 参 与佐 剂 效 ⑥ ⑦
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年 ， ｄｈｔｖＲ等 ［ 首 次 在 人 发 现 与 果 蝇 同 源 的 Ｍｅ ｚ ｉ ｏ ２ Ｔｏｌ 白 ， 命 名 为 ＴＬ ｌ蛋 并 Ｒ。 由于 ＴＬ 能 识 别 病 原 Ｒ
序 列 同源性 为 ９ ． ３ ， ９ ５ 与黄 牛 、 、 、 马 人 黑猩 猩和 狗 的核苷 酸序 列 同 源性 分 别 为 ９ ． ８ 、 ４ ９ 、３ １ 、 ７ ８ ８ ． ４ ８ ． ２ ８ ． ５ 和 ８．４ ， ２ ９ ２ ７ 具有很 高 的相似 性 ； 蛋 白是 一 个跨 膜 蛋 白， 该 存在 Ｌ Ｒ、 Ｒ — Ｒ Ｌ Ｒ ＴＹＰ Ｌ ＲＣ 、 Ｒ Ｔ及 ＴＩ 结 Ｒ 构域 ， Ｔｏｌ 受体 家族成 员 的共 同结 构相 一致 。水 牛 ＴＬ ２基 因的 成功 克 隆及序 列分析 和 结构预 测 为进 与 ｌ样 Ｒ
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牛HSL基因的克隆和生物信息学分析刘燕;李赞;田万年【摘要】旨在克隆牛HSL基因的CDS序列,并对该基因进行生物信息学、组织表达谱分析.根据GenBank登录的牛HSL基因序列(NM_001080220)设计1对引物,对牛组织样品中的HSL基因CDS序列进行RT-PCR扩增及序列测定;利用半定量RT-PCR方法检测HSL基因在牛各组织中的表达情况;利用生物信息学软件对其所编码的牛HSL蛋白进行分析.结果显示,获得的牛HSL基因CDS全长为2271 bp,编码756个氨基酸,与GenBank登录的牛HSL基因同源性最高,为99.9％.HSL蛋白含有一个HSL-N superfamily保守结构域,无信号肽结构,具有疏水性.半定量RT-PCR显示,HSL基因在检测的心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、大网膜、皮下脂肪、肌肉8种组织中均有表达,其中在大网膜和皮下脂肪中表达量较高,在肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、肌肉和心脏中度表达.该试验可为研究牛HSL蛋白的结构和功能提供参考.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2019(040)006【总页数】4页(P9-12)【关键词】克隆;分析;HSL基因;生物信息学;表达谱;牛【作者】刘燕;李赞;田万年【作者单位】辽宁禾丰牧业股份有限公司,辽宁沈阳 110164;吉林农业科技学院动物科技学院,吉林吉林 132101;吉林农业科技学院动物科技学院,吉林吉林 132101【正文语种】中文【中图分类】Q785;S823.2激素敏感脂酶（hormone sensitive lipase，HSL）是动物脂肪分解的重要酶之一，动物将体内的脂肪酸以甘油三酯的形式储存在脂肪细胞内，HSL能够把动物体内储存的脂肪进行分解，转变为游离脂肪酸和甘油来满足动物机体的需要，是影响机体脂肪代谢的关键酶和限速酶［1-2］。
目前有关猪的HSL 基因序列分析及表达研究研究报道较多［3-5］。
黄艳娜等［6］对陆川猪激素敏感性脂肪酶基因进行了克隆和序列分析。
有关牛HSL 基因表达分析报道较少。
常怀普等［7］对大额牛HSL 基因外显子Ⅰ部分片段进行测序及分析。
马志杰等［8］对牦牛HSL基因外显子Ⅰ进行了多态性分析。
柴志欣等［9］对麦洼牦牛HSL 基因多态性与生长性状进行了关联分析。
该试验对牛HSL 基因进行克隆，并对其进行了生物信息学及表达谱分析，以期为进一步研究HSL 在脂肪代谢过程中的功能提供依据。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品采集：牛各组织样品采自于吉林省珲春吉星牧业。
牛屠宰后采取背最长肌、皮下脂肪、大网膜、肺脏、心脏、脾脏、肾脏、肝脏，放置于液氮中，长期保存在-70 ℃低温冰箱中。
表1 引物信息引物名称HSL1退火温度（℃）59产物长度（bp）2 271HSL256267 β-actin引物序列（5′-3′）F：ATGGACCTGCGCACCATGACA R：TCAGACCGGCGGCCCGGGAAG F：TCGTCAAGAATCCCTCCATGTC R：GATTGAGGATGAGACGGATGCG F：AAGTACCCCATTGAGCACGG R：TCCTTGATGTCACGGACGATTT 564401.1.2 主要试剂：RNA 提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒、标准分子量DNA Marker DL 2 000、Ex Taq DNA 聚合酶、反转录试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 方法1.2.1 RNA 的提取：各组织总RNA 提取按照说明书操作步骤提取。
提取RNA 后测量其OD 值，并于-20 ℃保存。
按说明书操作步骤合成cDNA，反应程序为：42 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，冰上 5 min终止反应。
产物用去离子水5 倍稀释，于-70 ℃保存备用。
1.2.2 引物的设计：根据GenBank 登录的牛HSL基因序列（NM_001080220）设计 2 对引物（HSL1 和HSL2），HSL1 用于扩增 HSL 基因 CDS，HSL2 作为检测HSL 基因在各组织中表达的引物，根据牛βactin 序列设计1 对组织表达内参引物，各引物序列见表1。
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
扩增后PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，将纯化后的PCR 产物送至上海英俊生物技术有限公司进行测序。
1.2.3 HSL 基因的生物信息学分析：对测序后的牛HSL 基因进行拼接。
利用ClustalW 软件进行同源性比较，保守结构域在线预测（http：///Structure/cdd/cdd.shtml），用 ProtScale 在线软件分析其疏水性；采用在线SignalP Server 软件预测其信号肽。
2 结果2.1 牛HSL基因的PCR扩增与序列分析琼脂糖凝胶电泳显示（见图1），扩增产物大小约为2 271 bp。
扩增产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示HSL 基因核苷酸序列与牛HSL 基因（NM_001080220）核苷酸同源性为99.9%。
2.2 牛HSL基因组织表达谱分析图1 牛HSL 基因PCR 扩增结果图2 牛HSL 基因的组织表达谱用半定量RT-PCR 方法检测HSL 基因在牛各组织中的转录情况。
结果显示，HSL 基因在牛心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、大网膜、皮下脂肪、肌肉中均有表达，在大网膜、皮下脂肪转录水平较高，在肾脏、脾脏、肺脏、肌肉、心脏和肝脏转录中度转录（见图2）。
2.3 牛HSL基因编码蛋白的生物信息学分析2.3.1 HSL 基因编码蛋白疏水性分析：利用ProtScale 在线分析软件预测HSL 基因编码蛋白结构和疏水性。
结果显示，该基因CDS 大小为2 271 bp，编码756 个氨基酸，该蛋白的最小疏水性指数为-3.000，最大疏水性指数为2.122，按分值大小（score>1.5）划分，表明该蛋白具有较强的疏水性（见图 3）。
图3 HSL 蛋白疏水性分析图4 牛HSL 蛋白保守结构域2.3.2 HSL 基因 CDS 同源性分析：利用 CLUATALW 比对显示，牛HSL 氨基酸序列与猪、人、黑猩猩、小鼠的同源性分别为93%、92%、91%和89%。
2.3.3 HSL 蛋白结构预测：经Prosite 软件在线分析，HSL 蛋白没有信号肽，为碱性蛋白，其等电点为 7.15，其分子量大小为 82.59 kDa，含有一个HSL-N superfamily 保守结构域（见图 4）。
3 讨论HSL 是调控动物脂肪代谢并能将脂肪细胞分解为甘油三酯的脂肪酶，在脂肪代谢的多个环节具有重要作用［10］。
有关 HSL 基因在牛脂肪沉积方面的研究已有报道。
Kazala 等［11］研究发现，HSL 转录水平随牛肌内脂肪含量增加而增加，HSL 是影响牛脂肪沉积的重要基因之一。
田万年［12］研究发现，HSL 基因在延边黄牛阉牛和公牛背最长肌中差异表达，在阉牛背最长肌表达上调，该基因在阉牛脂肪沉积中具有重要作用。
该试验组织表达谱分析显示，HSL 基因在牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、大网膜和皮下脂肪组织均有表达，其中在皮下脂肪和大网膜中表达水平较高，结果与杨家大等［13］和王琦等［14］报道的对羊、猪 HSL 基因组织表达分析结果相一致，进一步表明HSL 蛋白在脂肪代谢具有重要作用。
生物信息学分析显示，HSL 蛋白具有较强的疏水性，该试验结果与刘俊霞等［15］对西农萨能奶山羊激素敏感脂酶生物学分析结果相一致。
该试验对牛HSL 基因进行了组织表达谱及生物信息学分析，其研究结果可以为利用HSL 基因改良牛经济性状和深入研究牛HSL 蛋白的功能提供参考。
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