微生物工程工艺原理_发酵产物的提取与精制方法(精选)
发酵产物的提取与精制
发酵工业下游技术的一般工艺过程
❖ 下游加工过程由各种化工单元操作组成。 由于生物产品品种多，性质各异，故用到 的单元操作很多，其中如蒸馏、萃取、结 晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单元操 作，理论比较成熟，而另一些则为新近发 展起来的单元操作，如细胞破碎、膜过程 和色层分离等，缺乏完整的理论，介于两 者之间的有离子交换过程等。
二、发酵液的固液分离
❖ 微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞 碎片以及残余的固体培养基成分。
❖ 固液分离是指将发酵液（或培养液）中的悬 浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白 质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去
（一）影响过滤速度的因素
❖ 1、发酵液中粒子的直径 ❖ 2、发酵液黏度
培养基的组成 未用完培养基的数量 消沫油 发酵周期
❖ 2、絮凝作用 ❖ 絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子
量聚电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使 胶粒形成粗大的絮凝团的过程。
❖ 常用的絮凝剂 ❖ 聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、
磷酸氢二钠
❖ 絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤 速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质 和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等， 提高了滤液质量
目的
❖ （1）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分 离固形物的速度，提高固液分离器的效率
❖ （2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中 （多数是液体）
❖ （3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步 操作。
一、 发酵液的预处理
❖ 采用理化方法设法增大虚浮液中固体粒子 的大小、或降低粘度，以利于过滤。
❖ 去除会影响后续提取的高价无机离子。
❖ 发酵醪预处理的要求:
❖ （1）菌体的分离 ❖ （2）固体悬浮物的去除 ❖ （3）蛋白质的去除 ❖ （4）重金属离子的去除 ❖ （5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除 ❖ （6）改变发酵醪的性质 ❖ （7）调节适宜pH值和温度
发酵产物的提取和精制工作
• ③其他真菌细胞壁主要由多糖组成，如几 丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。
（2）常用的细胞破碎方法
• 细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的 方式可分为机械法和非机械法两大类。
• 前者有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、 X-press法；
• 后者有酶解法、化学法、物理法、干燥法 等。
• 滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过 滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤 饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。
（1）影响发酵液过滤的因素
• 发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速 度慢。
• 过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未 利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期 等有关。
（2）改善发酵液过滤性能的方法
• ④助滤剂法：助滤剂如硅藻土吸附细菌细胞 改变滤饼结构，降低过滤阻力，加快过滤速 度。
• ⑤反应剂法：
3．细胞破碎与分离
• 微生物的代谢产物如果是胞内物质（如有 些酶制剂、干扰素、胰岛素等），那么首 先要收集菌体，进行细胞破碎。
• （1）微生物细胞壁的组成与结构： • ①细菌细胞壁： • ②酵母菌细胞壁比G+菌稍厚，主要成分是
• （3）含有色素、热源物质、毒性物质等有 机杂质。
• （4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、 有机溶剂、酶、机械力等敏感，不适宜条件 下易失活或分解。
2．提取和精制
• 提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度 的、符合质量标淮要求的发酵成品。
• 发酵产物存在形式不同，用途各异，产品 质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。
• ②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶 剂变性等。
• ③吸附法：吸附剂和沉淀剂的吸附作用。
• （3）色素及其他物质的去除
微生物工程工艺原理_发酵产物的提取与精制方法
率高于60 %。
提取抗生素和分离生物粒子
采用PEG/ Na2HPO4 体系提取丙酰螺旋霉素，最佳 萃取条件是pH= 8. 0～8. 5 ， PEG2000 (14 %) / Na2HPO4 (18 %) ,小试收率达69. 2 % ,对照的乙酸丁 酯萃取工艺的收率为53. 4 %
双水相和其他方法的集成
(4) 目标产物的分配系数一般大于3 ,大多数情况下,目标产
物有较高的收率。
(5) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固 液分离方法相比,双水相分配技术可省去1～2 个分离步骤, 使整个分离过程更经济。
(6) 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。
6、双水相萃取的工艺流程
双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产 物的萃取; PEG的循环; 无机盐的循环。
7、双水相的应用举例
分离和提纯各种蛋白质(酶） 用PEG/ -(NH4) 2SO4 双水相体系,经一次萃取从α- 淀粉 酶发酵液中分离提取α - 淀粉酶和蛋白酶, 萃取最适宜条件 为PEG1000 ( 15 %) -(NH4) 2SO4 (20 %) ,pH = 8 ,α- 淀粉 酶收率为90 % ,分配系数为19. 6 ,蛋白酶的分离系数高达 15. 1。比活率为原发酵液的1. 5 倍,蛋白酶在水相中的收
(2-7) ×10-4
由以上特性可以看出，超临界流体兼有液体和气体的双 重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相 比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程 的实现。
2、超临界流体萃取原理
超临界萃取是利用SCF作为萃取剂，从液体和固体中萃取出
发酵产物提取与精制工作
发酵产物的提取和精制工作
（2）杂蛋白的去除：
• ①沉淀法：利用蛋白质等电点进行沉淀， 或在酸碱性条件下加入阴离子阳离子进行 沉淀，或加入中性盐破坏蛋白质水化层进 行沉淀。
• ②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶 剂变性等。
丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。
发酵产物的提取和精制工作
（2）常用的细胞破碎方法
• 细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的 方式可分为机械法和非机械法两大类。
• 前者有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、 X-press法；
• 后者有酶解法、化学法、物理法、干燥法 等。
发酵产物的提取和精制工作
• ①机械法：
• （3）含有色素、热源物质、毒性物质等有 机杂质。
• （4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、 有机溶剂、酶、机械力等敏感，不适宜条件 下易失活或分解。
发酵产物的提取和精制工作
2．提取和精制
• 提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度 的、符合质量标淮要求的发酵成品。
• 发酵产物存在形式不同，用途各异，产品 质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。
• 发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速 度慢。
• 过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未 利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期 等有关。
发酵产物的提取和精制工作
（2）改善发酵液过滤性能的方法
• 发酵液难过滤时，需改善过滤性能，降低 滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。
• 改善发酵液性能的方法有调酸、热处理、 添加凝聚剂、反应剂、助滤剂等。
活性炭、烧结陶瓷、烧结金属等，它们填充 在过滤器内构成过滤层，悬浮液通过滤层时， 固体颗粒被滤层颗粒阻拦或吸附，滤液得以 澄清。 • 滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过 滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤 饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。
ch6发酵产物的提取与精制
第六章发酵产物的提取与精制一、概述二、发酵液的预处理及菌体分离三、发酵产物的提取和精制四、发酵产品的成品加工微生物经过适当条件培养后，菌体大量繁殖，合成并积累了相当浓度的代谢产物，这时便可以进入下游工程。
发酵液的下游加工是指从发酵产物中分离、纯化产品的过程。
它是利用产物和杂质的物理化学性质不同，提取产物或者从系统中去除杂质的操作。
第一节概述一、发酵液的一般特性微生物发酵生产各种发酵产品时，由于多用原料、菌种、工艺过程等的不同，所以预处理、提取、精制方法也有差异。
发酵产物大多存在于发酵液中，少数存在于菌体内。
要分离提纯发酵产物，首先要针对发酵液的特性进行预处理。
发酵液一般具有以下特性：1、发酵液中发酵产物浓度较低，属于稀水溶液系统。
2、发酵液中成分复杂，除发酵产物外，还含有微生物细胞碎片、代谢产物、残留的培养基、无机盐等。
特别是少量的代谢产物，结构特性与发酵产物相近，给分离提纯带来困难。
3、发酵液中还含有色素、热源物质、毒性物质等有机杂质，影响发酵产品的质量。
4、发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、有机溶剂、酶、机械力等敏感，在不适宜的条件下容易失活或分解。
二、提取和精制过程提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度的、符合质量标准要求的发酵产品。
由于发酵产物存在形式不同，用途各异，而且对产品的质量有不同的要求，所以分离纯化步骤可以有不同的组合，但大多数产品的下游工程过程，常常按照生产过程的顺序分为四个步骤，（如P76图6-1）即发酵液的预处理和菌体分离、提取、精制、成品加工。
发酵液的预处理和菌体分离是采用凝聚和絮凝等技术，加速固-液两相分离，提高过滤速度。
发酵产品如果是胞内产物，首先要进行细胞破碎，再分离细胞。
初步纯化即提取，主要是除去与目标产物性质有很大差异的物质，使产物浓缩以及产品质量提高。
常采用方法有沉淀、吸附、萃取等。
高度纯化即精制，采用对产品有高度选择性的分离技术，除去与产物理化性质相近的杂质。
项目7发酵产物的提取与精制工艺
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⑶ 超声波破碎法 超声波破碎也是应用较多的一种破碎方法。通常采用的 超声波破碎机在15-25千赫（kHz）的频率下操作。 原理：在超声波作用下液体发生空化作用，空化泡的急
剧膨胀压缩和内向爆破产生冲击弹性波，将声能转化为
机械能，形成粘性消散涡流，如果液体旋涡小于细胞尺 寸，产生不同密度移动，当细胞的动能超过细胞壁强度 时，至使细胞破碎。
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d.吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生 成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；
在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生
成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附 并包裹在其中除去。
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(3)有色物质的去除 培养基本身可能带有色素，如糖蜜、玉米浸出液等都带 有颜色 ；微生物在代谢过程中，本身也可能产生有色物质。 常用的脱色方法为吸附法，如活性炭吸附，树脂吸附等 a.大网格树脂 -----食品工业上的糖浆脱色 b.利用某些离子交换树脂 ----胶酶溶液脱色
液，生成不溶性颗粒而沉降析出的过程。
优点： 沉淀法具有设备简单、成本低、原料易得、收率
高、浓缩倍数高和操作简单等优点。
缺点：于过滤困难、产品质量较低、需要重新精制。 作用： 浓缩作用大于纯化作用，是初步分离的一种手段 。
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（一）等电点沉淀
原理：利用两性电解质在在低离子强度下，调节至等电点， 可使各种两性电解质所带净电荷为零，能大大降低其溶解 度，形成沉淀。 不同的两性电解质具有不同的等电点，从而将其分离开。 优点：操作简单，试剂消耗少，引入杂质少。 缺点: 不能完全沉淀析出，常与盐析法、有机溶剂沉淀法或 其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。
第十一章 发酵产物的提取与精制方法1
第一节萃取第二节吸附第三节离子交换法第四节膜分离法第五节层析法第六节浓缩第七节沉淀法第八节结晶第九节干燥第十节蒸馏第十章发酵产物的提取与精制方法1 萃取一、原理•以分配定律为基础。
即，物质因溶解度不同，从一种溶剂转入另一溶剂而被分离。
•分配定律：在恒温、恒压下，一种物质在两种溶剂中的分配浓度比是常数。
常数中溶质的浓度下层溶剂中溶质的浓度上层溶剂===BA C CB A K )()(•为了提出经过多次操作后,能较完全地提取物质的结论，我们不妨假设：•原溶液体积为：V(ml)•被提取物质的总重量：W0(g)•每一次提取所用的提取液的体积：S(ml)(萃取液的体积)。
•提取一次后，被提取物质在原溶液中剩余量：W1(g)•由此有：•在提取过程中，经一次提取后分配系数K的表达式为：SKV KVW W SW W V W K +⋅=⇒-=01101)()(经过第二次提取后，分配系数的表达式为：20212212)()()(SKV KV W W S KV KVW W SW W V W K +⋅=⇒+⋅=⇒-=•依次类推：可得经几次提取后，原溶液中残留物质量W n 。
nn SKV KV W W )(0+⋅=•如果知道某物质的分配系数和给定的提取率，则可计算出能达到此条件的最适萃取次数。
二、常用溶媒萃取工艺（1）单级提炼法（2）多次提炼法（3）多极对流萃取•萃余相顺序通过各级，并与新鲜溶剂接触进行萃取，传质推动力大，萃取效果好；•各级所得萃取相分别排出，然后汇集在一起脱除溶剂得萃取液，溶剂回收循环使用，溶剂回收设备简单；•因每级均加入新鲜溶剂，故溶剂耗用量大，回收费用高，而且萃余液组分浓度低。
一、下游加工技术的重要性➢1.产品分离纯化是最终获得商业产品的环节。
➢2.投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬酸占60%）。
➢3.分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展。
（4）分馏萃取右边重相富集溶质左边萃取相从重相中萃取溶质（5）微分萃取（塔式萃取）溶媒逆流萃取，溶质随流动相连续变化可用较少的萃取剂达到较高的萃取率，应用较广①喷淋塔优点：•结构简单，塔体内除各流股物料进出的连接管和分散装置外，别无其它内部构件。
第十二章发酵产物的提取与精制概论(6)
物 些目标产物存在于细胞内部。目前重组
的 提
DNA技术表达的产品（如肤岛素、干扰素、
取 白细胞介素等），都是胞内产物。首先必
与 精 制
须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进 一步提取。
概
论
第四篇 发酵产物的提取与精制
第
十
二 章
（一）细胞壁的组成与结构
发 酵
细胞破碎 用物理、化学、酶或机械的方
产 法来破坏细胞壁或细胞膜。细胞壁的破碎
制 温度；细胞的变化(因处理时间的不同面引起
概 论
的)也同样影响着对破碎的敏感度。
第四篇 发酵产物的提取与精制
第
十
二 章
破碎方法
发 酵 产
细胞的破碎按照是否外加作用力可分为机 械法与非机械法两大类；机械法中高压匀
物 浆器和珠磨机在工业上得到应用，超声波
的 提
法和非机械法大多处在实验室应用阶段。
取
与
发 酵
（1）特点
产
物 ①自动化程度高、操作连续、处理量大；
的 提 取
②适合于固体含量较大（＞10%）的悬浮液 的分离；
与 ③一般不适合于菌体较小和粘度较大的细菌
精 制 概
发酵液的过滤。（可以离心） ④所得固相的干度较差。
论
第四篇 发酵产物的提取与精制
第 十 （2）工作过程 二 章
发 酵 产 物 的 提 取 与 精 制 概 论
第
十 三、菌体分离方法
二
章 （一）菌体和发酵醪的分离方法
发 酵
离心 过滤
产 物
（二）离心分离
的 提
离心分离可分为以下三种形式：
取 ①离心沉降
与 精 制
②离心过滤 ③离心分离和超离心