CTAB法提取基因组DNA
ctab法提取dna的原理
ctab法提取dna的原理
CTAB法（Cetyltrimethylammonium Bromide）是一种常用于
提取DNA的方法，原理是利用CTAB结合DNA形成稳定的DNA-CTAB复合物。
与DNA相结合的CTAB可以将其他细
胞组分如蛋白质和RNA等溶解。
下面将介绍CTAB法的操作
步骤：
1. 准备样品：将待提取DNA的生物材料如植物叶片或动物组
织切碎，并放入离心管中。
2. 加入CTAB溶液：向离心管中加入含有CTAB的提取缓冲液，CTAB会结合DNA并分离细胞组分。
3. 细胞破碎：将离心管置于60-65°C的水浴中，短暂加热使细
胞完全破碎。
4. 酚/氯仿提取：加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇匀并离心。
这一步可以将DNA从细胞残渣和其他溶解物中提取出来。
5. DNA沉淀：将上清液转移到新的离心管中，加入等体积的
异丙醇，再次轻轻摇匀。
在冰上静置几分钟后离心，可使
DNA沉淀到离心管底部。
6. 溶解DNA：倒掉上清液，加入70%乙醇洗涤DNA沉淀，
离心去除乙醇。
再次离心后，将残留的乙醇洗涤液倒掉，将离心管倒置在纸巾上，将DNA自然风干。
通过以上步骤，利用CTAB法可以提取到高质量的DNA样品。
此方法的优势在于CTAB的高度阳离子性可以有效溶解其他
细胞组分，而不影响DNA的稳定性。
同时，CTAB法适用于
不同种类的生物材料，如植物，微生物和动物组织等。
CTAB法提取草珊瑚基因组DNA
CTAB法提取草珊瑚基因组DNA一、实验原理：CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。
①在低浓度盐溶液中（0.3mol/L氯化钠），CTAB核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白质、多糖类物质分开，再经过有机溶剂抽提，去除蛋白质、多糖、酚类等杂质。
最后通过预冷的无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去；②在高浓度盐溶液中（>0.7mol/L氯化钠），CTAB与蛋白质、多糖形成复合物，不能沉淀核酸；③CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心温度不得低于15℃；此外，其还可保护DNA不受内源核酸酶的降解。
二、实验步骤：一⑪取15g新鲜草珊瑚叶片剪碎，置于研钵中，加入液氮迅速研磨，将粉末收集于袋子中，置于-20℃保存，【PVP作用：去除酚类，也可去除糖类】⑫取10mlCTAB溶液于65℃水中预热，再加0.2ml巯基乙醇于预热的CTAB 中；【巯基乙醇作用：防止酚氧化成醌使酚易除去,需在通风橱操作】⑬取1g草珊瑚粉末于2mlEP管（离心管），加入1ml含有巯基乙醇的CTAB 溶液（样品低温时加入），振荡2分钟左右将其放入65℃水浴锅，水浴约1小时；【CTAB作用：使细胞裂解并结合核酸，使核酸易于分离】⑭往管中加入600ul氯仿：异戊醇=24:1，摇匀5分钟左右，再将其置于15-20℃以12000rpm离心10分钟；【氯仿作用：去除酚类，异戊醇作用：助于液体分层并维持下层有机溶剂的稳定】⑮取600ul上清液，再加入1.2ml（2倍）预冷的无水乙醇或360ul（0.6倍）异丙醇，置于-20℃沉淀约1小时或过夜；【无水乙醇、异丙醇作用：沉淀DNA】⑯取出EP管于4℃条件下以12000rmp离心10分钟，去掉上清液，⑰再加入700ul70％乙醇，上下颠倒数次，洗涤沉淀，后于4℃条件下以12000rmp离心10分钟，去掉上清液，再重复一遍，最后吹干；⑱在EP管中加入30-50ul去离子水（ddH2O）或1×TE溶液，于4℃放置3小时或过夜，使其充分溶解⑲可用琼脂糖凝胶检测其是否含基因组DNA，后进行纯化。
霉菌提取基因组DNA方法
CTAB法提取真菌基因组DNA1. 取100mg菌体至预先装有300mg石英沙的1.5ml离心管中；2.在离心管中加入500ul 2X CTAB裂解液（2% CTAB W/V，100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl）；3.用专用塑料槌充分研磨得到均一的浆状物；4. 60℃水浴1 小时（10分钟翻转离心管一次）；5. 加入2/3体积的苯酚/氯仿/异戊醇溶液（25：24：1）, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
6. 室温下13000rpm离心30分钟；7. 仔细移取上清液至另一1.5ml离心管,重复5-7步骤3-5次，直到两个界面没有沉淀；8.小心加入2倍体积的100%的冷乙醇（-20℃预冷过夜）；9.-20℃放置3个小时或者过夜；10.4度，13000rpm离心30分钟；11.小心倾去上清，将离心管压在干净吸水纸上吸干；12.沿离心管内壁缓慢加入200ul 70%的冷乙醇（4度）,尽量把壁上的沉淀洗入管底；13.11000rpm，4℃离心20min；倾去上清，晾干；14. 加入50-100ul TE（10mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 1mmol/L EDTA,300µg Rnase）到离心管中；15. 37℃水浴30min, 除去RNA；16. 重复5-13步骤，加入100ul TE溶解, -20℃贮存。
17. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。
同时取10μl 稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
植物DNA的提取(CTAB法)
实验一、植物DNA的提取（CTAB法）实验内容采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析和琼脂糖凝胶电泳。
目的要求掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
实验原理CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
DNA的浓度测定和纯度分析紫外光吸收法：纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的A260/A280在2.0左右。
试剂和器材：(1) CTAB分离缓冲液2% CTAB，2% PVP，0.15M EDTA，2.1M NaCl, 0.1M Tris-Base(pH8.0), 1%巯基乙醇，pH 8.0。
(2) 洗涤缓冲液75%乙醇，75mL无水乙醇，加水到100mL。
(3) TE缓冲液 10mmol/L Tris-HCL （pH7.4），1mmol/L EDTA(4) 氯仿-异戊醇（24：1）。
(5) 液氮。
(6) 研钵，恒温水浴（37-100℃），离心机，离心管。
操作方法：(1) 将CTAB分离缓冲液，置于65摄氏度水浴中预热。
(2) 称取约10g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。
(3) 取粉末于10ml离心管，加预热的CTAB分离缓冲液4ml，轻轻转动混匀。
65℃保温30分钟。
(4) 加等体积（4mL）的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀，4度下12000rpm离心10分钟。
(5) 取上清液转移至新管，重复（5）(6) 取上清液转移至新管,加入2倍体积预冷的无水乙醇，常温静置5min，用无菌牙签挑出DNA，转至新管，用70%乙醇洗涤3次，(7) 去净所有液体，风干，用适量的无菌水溶解DNA。
(8) 取2uL稀释500-1000倍，测定A260，A280，A230吸光度，判断DNA纯度。
CTAB法提取植物基因组DNA
CTAB法抽提植物组织DNA
1、准备工作：
（1）将玻璃瓶，药匙，镊子，研钵，滤纸，枪头，水浴锅准备好；
（2）准备CTAB溶液：
2×CTAB buffer（50mL）
CTAB Powder（2%） 1.0g
1M Tris-HCl（pH8.0，100mM） 5.0mL
0.5M EDTA（20mM） 2.0mL
5M NaCl（1.4M）14.0mL
（3）将水浴锅调到65℃；
（4）事先准备好要用的氯仿，Tris饱和酚（1:1），异丙醇。
无水乙醇放在-20℃冰箱。
2、提取方法
（1）称取0.5 g 新鲜植物叶片，置于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，用小药匙迅速转移至1.5 mL Eppendorf 管中；
（2）加入700 μL 2×CTAB/巯基乙醇缓冲液，颠倒混匀；
（3）将离心管置于65℃水浴中保温1h，中间不时颠倒混匀；
（4）加入700 μL氯仿：Tris饱和酚（1:1），温和颠倒5min；
（5）室温，12000×g，离心10min；
（6）取上清（约700μL）于一新的Eppendorf管中（切勿扰动界面），加入氯仿：异戊醇（24:1）700μL，轻轻颠倒混匀；
（7）室温，12000×g，离心10min；
（8）取上清500 μL，加入500 μL-20℃预冷的无水乙醇，混匀。
-20℃放置30min；
（9）室温，12000×g，离心10min；
（10）弃上清，用70%乙醇将沉淀小心清洗两遍；
（11）铺一块吸水纸于超净台中，将离心管开口向下置于滤纸上，室温下吹干10min左右；
（12）溶于适量水或TE溶液中（约50 μL）。
拟南芥基因组DNA的提取
拟南芥基因组DNA的提取
以生长良好的野生型拟南芥幼叶为材料，采用CTAB法提取基因组总DNA。
操作步骤：
（1）将CTAB提取液先在65℃水浴锅中预热；
（2）在液氮中研磨拟南芥幼嫩叶，在离心管中加入800μL粉末，然后加入800μL CTAB提取液，65℃保温30min以上；
（3）加入酚：氯仿：异戊醇=400:384:16，混匀，室温静置1分钟；
（4）4℃，12000rpm离心机中离心2min，取上清，加入氯仿：异戊醇=768:32，混匀，室温静置1min；
（5）4℃，12000rpm离心机中离心2min，取上清，加入氯仿800μL异丙醇，混匀，室温静置10min；
（6）4℃，12000rpm离心机中离心15min，取上清；
（7）在上清液中加入800μL的70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心机中离心2min，弃上清；
（8）加入30μLddH2O，放入-20℃的冰箱中备用。
SDS-CTAB改进方法提取细菌基因组DNA
改进SDS-CTAB方法提取细菌基因组具体步骤1.将待检测菌株接种于3 mL LB或BHI培养基中37℃培养过夜2.取1.5 mL上述菌液于2 mL离心管10,000~15,000 rpm，离心10~15 min，去上清，若所得菌体过少可重复此步骤一次3.加入564 μL TE缓冲液pH 8.0重悬菌体，此时不得涡旋，上下颠倒离心管几次使其混合均匀，然后37℃放置10~60 min。
4.加入30 μL 10%~20% SDS混合均匀、不得涡旋，置于37℃条件反应1~2h，使悬液相对清澈有粘性为止。
5.加入100μL 5M NaCl混合均匀、不得涡旋，65℃反应2 min。
然后加入80μL CTAB/NaCl，混合均匀、不得涡旋，65℃反应10 min。
（注：在加入CTAB/NaCl之前,必须用5M NaCl充分混匀裂解产物且CTAB/NaCl溶液加之前得先预热至65℃，并且吸取时移液器枪头应去除尖端）6.加入等体积约800 μL氯仿/异戊醇24:1充分混匀，10,000 rpm离心5 min。
离心后，转移含有核酸的上清液水相即上清液A，至新的2 mL 离心管中。
7.加入等体积约800 μL酚/氯仿/异戊醇25:24:于上清液A中充分混匀，15,000 rpm离心5 min。
离心后，转移含有核酸的上清液水相即上清液B，至新的2 mL离心管中。
8.加入等体积约800 μL氯仿/异戊醇24:1于上清液B中，充分混匀10,000 rpm离心5 min。
离心后，转移含有核酸的上清液水相即上清液C，至新的2 mL离心管中。
9.加入0.7倍体积约560 μL异丙醇至上清液C以沉淀DNA，上下轻柔颠倒离心管几次，可见白色、黏样沉淀即为DNA。
常温静置5~60 min后，12,000~15,000 rpm常温离心15~30 min。
可见DNA团集于离心管壁边上。
然后小心去除异丙醇，避免碰到DNA团。
10.加入500μL70%乙醇后上下颠倒离心管几次以洗涤DNA团，再常温12,000~15,000 rpm离心15~30 min。
ctab法提取dna的原理
ctab法提取dna的原理CTAB法提取DNA的原理。
CTAB法是一种常用的DNA提取方法，它可以有效地从植物组织中提取高质量的DNA。
CTAB法的原理主要是利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）与DNA结合形成复合物，然后通过洗涤和沉淀的方式将DNA从其他杂质中分离出来。
下面将详细介绍CTAB法提取DNA的原理。
首先，将植物组织样品加入到含有CTAB的提取缓冲液中，CTAB可以破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物释放出来。
此时，CTAB会与DNA结合形成CTAB-DNA复合物，同时也会结合蛋白质、RNA和其他杂质。
接着，加入蛋白酶K和RNase等酶类，通过消化蛋白质和RNA，将它们降解掉。
然后加入氯仿提取混合液，通过离心将混合液分成两层，DNA会在上层的水相中，而蛋白质和RNA等杂质则会在下层的有机相中。
随后，将上层的水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻地混匀后离心，DNA会沉淀到离心管的底部。
此时，可以通过倒置离心管将上清液倒掉，然后用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，最后用无菌纯水溶解DNA，即可得到高质量的DNA。
CTAB法提取DNA的原理其实就是利用CTAB与DNA结合形成复合物，然后通过洗涤和沉淀的方式将DNA从其他杂质中分离出来。
这种方法不仅可以提取高质量的DNA，而且操作简单、成本低廉，因此在植物基因组学研究中得到了广泛的应用。
总之，CTAB法提取DNA的原理是一个基于CTAB与DNA结合的化学方法，通过洗涤和沉淀将DNA从其他杂质中分离出来。
这种方法简单易行，提取的DNA质量高，适用于植物组织的DNA提取，对于植物遗传学和分子生物学研究具有重要意义。
霉菌提取DNA方法
CTAB法提取真菌基因组DNA1. 取100mg菌体至预先装有300mg石英沙的1.5ml离心管中；2.在离心管中加入500ul 2X的CTAB裂解液（2% CTAB W/V，100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl）；3.用专用塑料槌充分研磨得到均一的浆状物；4. 60℃水浴 1 小时（10分钟翻转离心管一次）；5. 加入2/3体积的苯酚/氯仿/异戊醇溶液（25：24：1）, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
6. 室温下13000rpm离心30分钟；7. 仔细移取上清液至另一1.5ml离心管,重复5-7步骤3-5次，直到两个界面没有沉淀；8.小心加入2倍体积的100%的冷乙醇（-20度）；9.-20度放置3个小时或者过夜；10.4度，13000rpm离心30分钟；11.小心倾去上清，将离心管压在干净吸水纸上吸干；12.沿离心管内壁缓慢加入200ul 70%的冷乙醇（4度）,尽量把壁上的沉淀洗入管底；13.11000rpm，4度离心20分钟；14.倾去上清，晾干；15.加入50-100ul TE（10mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 1mmol/L EDTA,300ug Rnase）到离心管中；16.37℃水浴30分钟, 除去RNA；17.重复5-13步骤，加入100ulTE溶解, -20贮存。
18. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。
同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
7植物基因组DNA提取-CTAB法
1. 2% CTAB抽提缓冲液
CTAB 2g， NaCl 8.18g ， EDTA-Na2-2H2O 0.74g， 10ml 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)， 先用 70ml ddH2O溶解, 再定容至100ml，灭菌, 冷却后 加入0.2% β-巯基乙醇0.2ml。
终浓度： CTAB 2%, NaCl 1.4mol/L（生理平衡 作用）, EDTA20mmol/L(螯合离子作用)，β-巯基 乙醇 100 mmol/L或PVP（聚乙烯吡咯烷酮 ）（降 低氧化酶类的活性，防止酚氧化成醌，有效去除 多酚。）
复习题（判断）
将DNA提取液65度温育20分钟，可以灭活DNase。 （）
在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚， 说明其中蛋白质含量较高，可增加氯仿/异戊醇 抽提的次数或适当延长离心的时间。（ ）
（二）获取程序及原理
1. 破壁破膜，释放染色体
利用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞；然后 加入CTAB缓冲液。
有效制备DNA时要考虑两个原则： 防止和抑制内源 DNase 对 DNA的降解； 尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
在液氮冷冻条件下研磨破碎，保证材料在此过程 中DNase无法活动。
高等植物总DNA提取
—— CTAB法AB法
实验类型：验证型
一、实验目的与要求
掌握CTAB法抽提植物DNA的基本原理。 学习并掌握CTAB法抽提植物DNA的技术和方法。
二、实验原理
（一）植物细胞中DNA在哪里？怎样获得？
➢ 植物细胞中的DNA主要存在于细胞核内，称为 核DNA、染色体DNA、核基因组DNA，细胞质中 也有少量DNA，主要分布在线粒体、叶绿体内，称 为核外DNA。 ➢ 细胞内的各种DNA称为总DNA。 ➢ 程序：破壁破膜→去蛋白质→沉淀DNA
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CTAB法[30]提取玉米（或其它植物）基因组DNA
1)取0.5~1 g玉米叶片，加入液氮粉碎，加入2mL 2% 65℃保温的2×CTAB抽提
液，混匀，65℃保温30～60min。
2)加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，10000r/min，离心5min。
3)取上清，加入1/10体积（约0.2mL）的65℃的10×CTAB/NaCl溶液，颠倒
混匀。
4)用等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，10000r/min，离心5min。
5)取上清，加入（正好）等体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀，如沉淀可见，继
续做下步，否则，65℃保温30min。
6)4℃，2700 r/min，离心5min。
7)去上清，用高盐的TE buffer重悬（0.25～0.5mL）。
（可65℃保温30min，至
大部分溶解）。
8)加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，4℃，10000 r/min，离心15min。
9)去上清，80%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TE buffer重悬。
高盐的TE buffer
终浓度配制50ml
10mM Tris.Cl, pH8.0 0.5ml(1M 母液)
0.1mM EDTA, pH8.0 0.01ml(0.5M 母液)
1M NaCl 1.8g
室温可保存几年
CTAB提取液
终浓度配制200ml
2%(W/V) CTAB 4g
100mM Tris.Cl, pH8.0 20ml(1M 母液)
20mM EDTA, pH8.0 8ml(0.5M 母液)
1.4M NaCl 10.22g
室温可保存几年
10×CTAB/NaCl溶液(10%CTAB/0.7M NaCl)
在80ml H2O中溶解4.1g NaCl，缓慢加入10g CTAB，同时加热并搅拌。
如果需要，可加热至65℃溶解。
定容至100ml。
CTAB沉淀液
终浓度配制100ml
1%(W/V) CTAB 1g
50mM Tris.Cl, pH8.0 5ml(1M 母液)
10mM EDTA, pH8.0 2ml(0.5M 母液)
室温可保存几年
CTAB法提取植物干品（或真菌）基因组DNA（自己改进版）
10)取0.2g叶片，加入液氮粉碎，加入800μL 2% 65℃保温的2×CTAB抽提液，
混匀，65℃保温30～60min。
11)加入600μL的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，10000r/min，离心5min。
12)取上清(约600μL)，加入1/10体积（约60μL）的65℃的CTAB/NaCl溶液，
颠倒混匀。
13)用等体积(约600μL)的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，10000r/min，离心5min。
14)取上清(约450μL)，加入0.8体积的异丙醇沉淀核酸，颠倒混匀，（如沉淀可
见，继续做下步，否则，-20℃保温10~20min）。
15)4℃，12000 r/min，离心10min。
16)去上清，用高盐的TE buffer重悬（约100μL），（可65℃保温30min，至大部
分溶解, 加(1 μL) Rnase A(10 mg/mL) 37℃30-60min。
17)加入0.8体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀（如没有沉淀，-20℃保温
10~20min），4℃，12000 r/min，离心15min。
18)去上清，70%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TE buffer重悬（30~60μL）。
以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分光光度计法检测DNA纯度（将DNA稀释50倍后分别测OD260和OD280，并计算OD260/OD280的比值）。
CTAB法提取植物基因组DNA（改进版）
19)取0.2g叶片，加入液氮粉碎，加到2ml离心管，加入1000μL 2% 65℃保温的
2×CTAB抽提液，混匀，65℃保温30～60min。
20)加入900μL的氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀，12000r/min，离心15min。
21)取上清(约850μL)，加入1/10体积（约85μL）的65℃的CTAB/NaCl溶液，
颠倒混匀。
22)用等体积(约850μL)的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，12000r/min，离心15min。
23)取上清(约700μL)，加入等体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，（-20℃过夜）。
24)4℃，12000 r/min，离心20min。
25)去上清，用高盐的TE buffer重悬（约400μL），（可65℃保温30min，至大部
分溶解, 加(4-6 μL) Rnase A(10 mg/mL) 37℃30-60min。
26)加入等体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀（-20℃ 1-2h），4℃，12000 r/min，
离心20min。
27)去上清，75%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的ddH2O重悬（30~60μL）。
以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分光光度计法检测DNA纯度（将DNA稀释50倍后分别测OD260和OD280，并计算OD260/OD280的比值）。