第二章蛋白质分子设计

蛋白质应用受限的原因
蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因:
(1)蛋白质分子量非常大(10 000-1 000 000)， 不能通过化学方法生产;
(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它 条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的;
(3)专一性致使其应用范围受到影响。
蛋白质设计目前存在的问题
1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明 显的功能优越性
• 替换表面荷电基团，His、Cys 以及Tyr的置换
• 专一性的改变，增加逆转数， 改变酸碱度
（二）定位突变的种类
要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序 列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因 直接修饰法、盒式突变技术等。
根据基因突变的方式，分为以下三类： 插入一个或多个氨基酸残基； 删除一个或多个氨基酸残基； 替换或取代一个或多个氨基酸残基。 要达到基因定位突变的目的，多采用体外 重组DNA技术或PCR方法。
5．突变体蛋白质的检验
• 测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定 性、催化活性等，
• 并与对应的天然蛋白质进行比较，检验 突变设计的效果，
• 同时进一步修正设计方案。
（四）蛋白质中功能残基的鉴定
根据结构信息 确定残基的突变
蛋白质中功能 残基的鉴定
突变方法鉴定突变 功能残基
利用蛋白质同源性 鉴定功能残基
2、三级结构的确定性较差
第一节 蛋白质分子设计原理
计算机模拟
基因构建
功能分析
突变蛋白质产品
Pr 设计循环
蛋白质分子设计的流程
蛋白质结构预测
天然蛋白质
蛋白质晶体学
数据 的输 入
蛋白质三维结构 结构与功能的关系
蛋白质突变体设计及结构预测 几何优化及蛋白质动力学研究
结果分析与原先的结构比较
蛋白质合成定位突变
蛋白质分子设计原理
▪金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要 求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂 分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。
▪对于金属Pr，围绕金属中心的第二壳层中的相互作 用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主 链的相互作用。
▪最优的aa侧链几何排列。Pr侧链构象由空间两个 立体因素所决定(一是立体势垒，二是aa的位置)
OPH是目前在各方面研究最为透彻的有机磷农 药降解酶，同时也是应用最为广泛的农药降解酶， 为此对甲基对硫磷水解酶的深入研究将有利于甲 基对硫磷水解酶的广泛应用。
载体污染序列的分析
在进行序列分析时，首先需确定序列是否含有载体序列的污染，如 果含有载体序列，需截去后再进行其他分析。 http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ VecScreen/VecScreen.html在线分析。
Match to Vector: Strong
Moderate
Segment of suspect origin:
Weak
Segments matching vectorStrong match: 1-113, 3838-4071 bp。 真正的目标序列：114~3,837 bp。
同源序列搜索（Blastn :114-3837 bp ）
两个基因的CDS不一致，分别匹配于MPH的398，368-1393bp
甲基对硫磷水解酶基因的分析
以1393位的TGA结束的可能的ORF有八个,MW:34.4kD –ATG:368，398 bp 典型的启动子序列结构:TTGCAA-17个氨基酸-TATACT (320-365bp) 典型的核糖体结合位点:AGGA (381 bp)
• 二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中 改”。
一、定位突变
基于天然蛋白质结构的蛋白质分子 “小改”是指对已知结构的蛋白质进行 少数几个残基的修饰、替换或删除等， 这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方 法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位 突变两类。
（一）定位突变的设计目标及解决方法
定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的 热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专 一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关 系的研究等。
1. 突变引入二 硫键
2. 去除Gly或引 入Pro
3. Ser38→Asp和 Asn144→Asp
图2-3 T4溶菌酶的三维结构（Gassner, et al. 1996）
T4溶菌酶的三维结构 红色强调的为α螺旋结构域核心中被蛋氨酸置换的10个残基 红色强调的为α螺旋中被置换的残基
例：甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase, MPH ）结构和功能的研究
（五）定位突变的应用
• RNase T1的结构改造是分于设计中的一 个成功实例
• T1核糖核酸酶含有104个aa残基，天然酶 有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人 在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键， 热稳定性增加。
T4噬菌体溶菌酶
结论：MPH基因的CDS: 398—1393（331aa)
MPH与OPH的序列比对
二者同源性仅为13.6%，确定MPH是一个有别于OPH的蛋白质。 二者在功能上的相似性不能用蛋白的一级序列的相似性加以解 释，推测二者功能上的相似性与其一级序列构成的高级结构中 活性中心结构的相似性有关。
C值表示切割点的可能性， S值表示具有信号肽的可能性
第二章 蛋白质分子设计
Chapter two Protein Design
引言
在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体 外的许多重要任务：
酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子； 抗体起到防护的作用; ……
从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质: 生物合成不需要消耗很多能量 专一性很强 不产生副作用并且能很快降解
（三）定位突变的程序
1．建立所研究蛋白质的结构模型
可以通过X射线晶体学、二维核磁共 振等测定结构，也可以根据类似物的结 构或其他结构预测方法建立起结构模型。
2．找出对所要求的性质有重要影响 的位置
• 在改造中如何恰当地选择突变残基 是一个关键问题，这不仅需要分析 残基的性质，同时还需要借助于已 有的三维结构或分子模型。
1．根据结构信息确定残基的突变
• 最有效最直接的方法
• Alan Fersht和GregWinter等测定了酪氨酰tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该 酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结 构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中 的3’羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性， 证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。
▪结构及功能的专一性。这是Pr设计最困难的问题
序列设计
• 设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易 于形成α螺旋的残基；
• 设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于 形成β折叠片的残基；
• 而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。
溶菌酶结构
• 例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性 分子的设计
• Cutte成功设计了一个具有明显 的核酸酶活性的34肽，该肽可水 解下列底物，但活性依次降低： polyC、polyA、polyU、polyG。
2．突变方法鉴定突变功能残基
• 通过引进另外一种突变来检测 • 随机突变技术 • 删除分析及连接片段扫描突变
3．利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基
• 高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维 持结构有关 。
• 非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一 性研究。
• 探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变 残基。
其主要活性源于二聚体；而 天然核酸酶仅消化polyC、polyU、 polyA。
• 设计步骤
设计目标
蛋白质数据库
修正设计
检测
建立结构模型
获得目标蛋白质
结构信息分析
序列合成
蛋白质分子设计步骤图
第二节 基于天然蛋白质结构的分子设计
基于天然蛋白质结构的分子设计有两类 ：
• 一是进行蛋白质修饰或基因定位突变， 即“小改”；
❖Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验 的紧密相结合
❖在上述的设计工作完成后，要进行合成或 突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要 求的新Pr；
❖Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验 的紧密相结合
一、蛋白质分子设计的分类
• 设计的目的主要有两个：
• 一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和 指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性， 增加活性，降低副作用，提高专一性等；
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1 The nucleotide sequence including mpd from Pseudomonas sp. WBC-3 2 Plesiomonas sp. M6的甲基对硫磷水解酶基因
匹配区为134~1866，Identities=1720 bp／1733 bp(99％) CDS: 331aa (398-1393bp) 3 Pseudomonas putida的甲基对硫磷降解蛋白基因 匹配区为168~1393，Identities=1025／1026(99％) CDS: 341aa (368-1393bp)
3．预测突变体的结构
根据所选定的氨基酸残基位点及突 变后的氨基酸种类，利用相关软件进行 突变体的结构预测，将预测的结构与原 始的蛋白质结构比较
4．构建突变体，获得突变体蛋白
依据所设计好的突变，利用化学合 成或PCR等方法构建突变体。进行基因 测序验证突变体后，将突变体进行表达， 纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。
MPH信号肽的分析预测：神经网算法 结论：信号肽（1-35氨基酸）。
信号肽的一般结构为： 正电荷的n-region； 疏水的h-region； 中性极性的c-region。
MPH信号肽的分析预测：马尔可夫算法 MPH具有典型的信号肽的三部分结构 结论：可能的信号肽为1-35氨基酸。