5、微生物的培养工程

温度控制
• 如青霉素生产菌的最适生长温度为30 ℃，而青霉素 合成的最适温度为25 ℃。Glu生产菌的最适生长温 度为30~32 ℃，而产生Glu的最适温度为34~37 ℃。
• 所以，要针对不同的发酵类型在生产过程中适时调 整发酵温度。在大多数情况下，接种后适当提高培 养温度有利于孢子萌发或加快菌体生长、繁殖。
葡萄糖
NAD+ NADH
ADP ATP
NAD+ NADH
丙酮酸
NAD+
呼 吸 链
ADP ATP O2 S H2O H2S
TCA
CO2
乳酸/乙醇 无氧发酵
专性好氧菌
有氧呼吸 无氧呼吸
兼性好氧菌 专性厌氧菌
氧气与菌体生长
• 兼性好氧微生物：生长不一定需要O2，但如果供给 氧则生长更好，如酵母菌、E. coli。 • 酵母菌的乙醇发酵：氧气控制分两阶段，初始阶段 提供高O2浓度使菌体增殖，后期则严格控制O2进行 厌氧发酵。
• 如果将微生物反应看成是生成多种产物的复合反应， 那么从概念上可以将发酵过程写成如下形式：
aCHiOj（碳源）+bO2+cCHlOmNp（氮源）→ CHxOyNz（菌体）+dH2O+eCO2+fCHuOvNw（代谢产物）
• 粗略地看，细胞将碳源、氮源和氧气摄入，结果是 细胞的生长、代谢产物的生成，以及CO2和H2O的 排出。
代谢产物
• 微生物生长过程中产生的有些代谢副产物对细胞的 生长有害，如醇类和某些有机酸。 • 如在耐高渗酵母S. cerevisiae发酵生产甘油的过程中 产生的乙醇，对细胞存活和甘油生产能力都有显著 抑制作用，通过气提除去乙醇能显著提高甘油发酵 水平。 • 乙酸是E. coli发酵过程中的代谢副产物，浓度大于 10g/L时细胞会停止生长。可以通过控制葡萄糖浓 度、降低温度、控制补料等方法降低比生长速率， 实现对乙酸浓度的控制。
新鲜培养基 控制阀 空气 过滤器 发酵罐
连续培养
• 在连续培养中，实现恒定状态的方法有两种：
– 恒化器法chemostat：以一定的速度供应预先确定浓度 的基质溶液，以适当的稀释率连续操作，使细胞增殖 量和流出的培养液中的细胞量相平衡，实现稳定状态。
– 恒浊器法turbidostat：使用激光浊度计连续测定细胞浓 度，通过反馈控制的方式控制培养基流速，使细胞浓 度恒定。
碳源和氮源
• 氮源种类：
– 速效氮源：如氨基酸、硫酸铵、玉米浆，容易被摄取， 利于菌体生长，但对某些代谢产物的合成尤其是抗生素 产生负调节作用而影响产量。如竹桃霉素、螺旋霉素的 发酵。
– 迟效氮源：如黄豆饼粉、花生饼分，有利于延长次级代 谢产物的分泌期，提高产量。
• 氮源浓度：浓度过低菌体营养不足，浓度过高则会 使细胞脱水死亡。 • 生产中一般选用速效氮源和迟效氮源的混合物，并 通过补加氮源的方式控制其浓度。
• 专性好氧微生物：如除酵母外的大部分真菌，必需 氧气才能进行细胞的生长和代谢。
• 专性厌氧微生物：如双歧杆菌、产甲烷杆菌，氧的 存在可对其产生毒性，能否将O2限制在较低水平是 发酵成败的关键。
氧气与产物合成
• 对于好氧发酵来说，溶氧水平能直接影响与产物合 成相关的途径。 • 以氨基酸发酵为例，需氧量与氨基酸的合成途径密 切相关：
培养过程的质量衡算
• 作为生产工艺的效率的几个参数：
– 生长收率：培养基中投入的基质（营养）转变为菌体的 比例的参数。好氧培养的收率比厌氧培养大得多。 ΔX Yx/s= ΔS
（ΔX为产生的菌体的干重， ΔS为消耗的基质的质量）
– 产物收率：投入的基质转变为代谢产物的比例。 ΔP Yp/s= ΔS （ΔP为代谢产物的干重， ΔS为消耗的基质的质量） RQ=
• 连续培养的缺点是，培养持续时间长，杂菌污染的 几率增大。菌株容易退化变异，影响目标产物的生 产。因此适用于不易染菌的产品：酒精发酵、啤酒 发酵、丙酮-丁醇发酵等。
影响发酵过程的主要因素
培养基中的碳源和氮源
发酵温度 pH值
氧气供应
代谢产物
碳源和氮源
• 碳源种类：选择合适的碳源对提高代谢产物的产量 非常重要。
供氧与高密度培养
• 菌体在快速生长的过程中，需要消耗氧气进行分解 代谢，氧气的及时供给非常重要。 • 随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧浓 度下降，细胞生长速度减缓。 • 在高密度发酵后期，菌体密度急剧增大，耗氧量极 大，氧气的供给成为一个重要的限制性因素，影响 产物的合成。 • 目前已经开发出多种改善溶氧供应的方法：
碳源和氮源
• 基于这个原理，工业生产中为了调节控制菌体的生 长和产物的合成，通常采用一定比例的快速利用碳 源和缓慢利用碳源的混合物。
• 碳源浓度：细菌的培养基中碳源含量超过5%时， 生长速率会因细胞脱水而下降。霉菌、酵母可耐受 高达20%的葡萄糖浓度。
• 酵母的Crabtree效应：在高葡萄糖浓度下生长时， 即使氧气供应充足，细胞仍然会进行厌氧发酵产生 大量乙醇。生产中对碳源浓度采用中间补料的方式 进行控制。
pH值
• 微生物在发酵过程中不断吸收营养并排出代谢– 产物的形成：有机酸，CO2 – 营养物质的吸收：NH4+ – 缓冲物质的消耗：如磷酸盐
• 在发酵过程中要跟踪pH值的变化，随时进行调节。 主要调节方法有：
– 添加碳酸钙 – 氨水流加 – 尿素流加
– 快速利用的碳源：如葡萄糖，能较快地参与微生物的 代谢与菌体合成，有利于微生物生长，但部分分解产 物往往对目的产物的合成起阻遏作用。 – 缓慢利用的碳源：如淀粉，要先被菌体分泌到胞外的 酶降解后才能利用。但往往有利于延长代谢产物的合 成，特别是抗生素的分泌。
• 如青霉素合成中，糖的缓慢利用很关键。在葡萄糖 培养基中，菌体生长良好但青霉素合成较少；在乳 糖培养基中，菌体生长缓慢，但青霉素产量明显增 加。
– Glu系氨基酸的发酵：Glu、Gln、Arg和Pro，其合成途 径中产生大量的NADH，供氧充足时产量最大； – Asp系氨基酸的发酵：Asp、Ile、Lys和Thr，供氧充分 时可达到最高产量，但供氧受限时对产量的影响不大；
– Leu、Val和Phe的发酵：NADH产量很少，仅在供氧受 限时才能获得最大产量，供氧充足时反而抑制产物合 成。
ΔCO2 ΔO2
– 呼吸商RQ：生成的CO2与消耗的氧气之比。是评价好 氧发酵中菌体代谢机能的重要指标之一。
培养过程的能量收支
• 微生物生长所需要的能量是由基质氧化而获得的。 储存于碳源中的能量，在需氧反应中有40~50%转 化为ATP，其余的能量则以热量的形式释放。
构成材料： 氨基酸等
合成代谢
细胞组分
• 随后，发酵液的温度应控制在菌体生长的最适温度。 到主发酵旺盛阶段，温度应该控制在代谢产物合成 的最适温度。
温度控制
• 发酵热：发酵过程中释放出来的净热量，包括生物 热、搅拌热、蒸发热和辐射热等。 • 生物热：生产菌在生长过程中产生的热能，主要是 营养物质被分解成CO2和水时释放出来的。 • 当菌体处于对数生长期时，呼吸作用强烈，且菌体 数量也较多，产生的热量大，温度上升快。生产时 必须控制好此时的温度。 • 在相同条件下，培养基成分越丰富，营养物质被利 用的速度越快，产生的生物热就越大。
发酵培养方式
• 分批培养方式的缺点是营养的耗竭、有害代谢产物 的积累导致菌体的终密度低，产物的产率低。但是 因为生产工艺简单，在工业生产中较多使用。
• 补料分批培养fed-batch culture：在分批发酵过程中 补入新鲜的培养基，以克服由于养分不足导致的发 酵的过早结束。
• 这种方法还能避免高浓度碳源引起增殖抑制的情况， 能长期维持对数增长期，获得产率的高效化。 • 在改善高密度培养的生产效率和控制细胞的代谢方 面很有效。普遍用于抗生素、酶制剂等的工业生产。
– 类型I：最简单，生长联动型， 产物生成与菌体的生长成比例, 产物的生成是微生物主要能量代 谢的结果。如乙醇发酵。 – 类型III：非生长联动型，微生物 生长与产物的生成彼此独立。如 青霉素的发酵。
I型
浓 度
菌体数X
产物浓度P
培养时间 III型 浓 度
菌体数X
产物 浓度 P 培养时间
– 类型II：介于I和III型之间，非典 型联动。
氧气供应
• 在好氧发酵过程中，必须不断搅拌 并供给适量的无菌空气。氧气难溶 于水，这给维持需氧环境带来很大 麻烦。 • 发酵液中的溶氧浓度是通风发酵的 关键控制参数，提高溶氧能力的基 本原则是加大通气量、强烈搅拌。 • 溶氧对发酵的影响有两个方面：
① 影响与呼吸链有关的能量代谢，从 而影响菌体生长； ② 直接参与并影响产物合成。
ADP
碳源： 葡萄糖等
ATP
中间产物 丙酮酸等 代谢产物 乙醇等
ADP
ATP
CO2 H2O
厌氧分解
有氧分解
热量
发酵培养方式
• 微生物的发酵培养方式可分为分批培养、补料分批 培养、连续发酵等方式。 • 分批培养batch culture：接种后随着微生物的生长繁 殖只完成一个生长周期，在整个过程中除了供给氧 气、添加酸碱调节pH值等操作外，不进行培养基 成分的添加和产物的回收。 • 随着生长的进行，培养基中的营养物质不断减少， 代谢产物不断积累，微生物的生长条件不断变化。 一旦培养基成分枯竭，细胞的增殖就停止。
分批培养流程概略
保存之 菌种
在小烧瓶中 活化菌株
种子培养： 通常以10倍的 比例扩大培养
发酵液进入分离纯化流 程，提取目标产物 发酵罐经过清洗、蒸汽 灭菌后用于下次的培养
发酵：达到所设 定的培养时间或 目的产物浓度时， 结束培养
分批发酵中产物的合成速率
• 分批培养中产物P随着细胞的 增殖而增加，分为3类：
pH值