组织线粒体提取

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线粒体的提取与纯化

mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。

按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。

1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。

1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。

15000g•min-1离心20min。

沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。

1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。

1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。

取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。

1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。

1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。

线粒体DNA提取SOP

线粒体DNA提取SOP
一、蛋白酶K法
1、使用液氮将50mg新鲜组织样本研磨至粉末状；
2、转入1.5mL离心管中加入溶液A（4℃）1mL，冰浴中吹打分散后沉降大块沉淀；
3、4℃，1000r/min离心1min，分离颗粒细胞核和细胞碎片；
4、回收上清至新的1.5mL离心管，12000r/min离心10min；
5、弃上清，尽量去除干净；
6、加50uL蛋白酶K，55℃水浴2.5h，期间每隔15min轻轻混匀；
7、加水至500uL；
8、加入等体积的酚、氯仿、异丙醇抽提，轻柔上下翻转离心管15min；
9、1000r/min离心10min；
10、水相转移至新管并加入各500uL的氯仿和异丙醇，轻柔上下翻转离心管15min；
11、1000r/min离心10min；
12、水相转移至新管，加入2倍体积的冰乙醇沉淀，静置10min；
13、12000r/min离心2min，沉淀即为mtDNA；
14、70%乙醇清洗线粒体DNA，置于空气中自然干燥后加入适量TE液溶解，于4℃保存。

实验五线粒体的分离与观察

（二）密度梯度离心
（density gradient centrifugation）
A等速度沉降，B等密度沉降
用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
密度梯度离心法是用密度具有梯度的介质来替换离心管中的密度均一的介质，使介质分为不同的层次，浓度的低的在上层，浓度高的在底层。将细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大小、形态、密度的颗粒就会以不同的速度向下移动，集中到不同的区域，可以分别收集。
差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低速中沉淀，再用较高的转速将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离。
但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心十是均匀分布于整个离心介质中的，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，需经反复悬浮和离心加以纯化。
F 105000g x 20min

内容物完整细胞细胞核，细胞碎片叶绿体线粒体、溶酶体、微体微粒体 0.26%脱氧胆酸纳核糖体
三、实验材料、用品 1.器材：剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微
镜，冷冻高速离心机等。 2. 材料：玉米黄化苗
四、玉米线粒体及细胞核的分离从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能
细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶的活性，避免细胞器的聚集。
沉淀
转速x时间
A 150g x 20min
B 1000g x 20min
C 3000g x 6min

动物线粒体DNA提取的原理和方法

动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲刘彦群鲁成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室重庆 400716)摘要从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。

关键词线粒体线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。

它是细胞进行氧化磷酸化的场所。

线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。

线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。

由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。

动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。

进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。

线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。

线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。

线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。

其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。

线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。

锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。

鱼组织线粒体基因组提取方法的改进

便于取材分析。同时，ｍｔＤＮＡ义具有广泛的种内和种问多态性，在亲缘关系相近的物种间其进化速度比
以新鲜鲤鱼的肝脏、脾脏和肾脏组织为材料，材
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｉｓｈ；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ；ｇｅｎｏｍｅ；ＡｌｋａｌｉｎｅＬｙｓｉｓ
线粒体是真核细胞中普遍存在的一种重要而独
特的细胞器，线粒体ｃｔ：Ｇｅｎｏｍｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｗａｓｔｈｅ￣ｕｎｄａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｏｆｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅｐｕｒｅｄｅｇｒｅｅａｎｄｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
第２５卷第２期
２０１３
４月
黑龙江八一农垦大学学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＢａｙｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｉｎｔｅｇｒｉｔｙｏｆＤＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｗｅｒｅｔｈｅｎｅｃｅｓｓａｒｙｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｔｏｃａｒｙｒｏｎｖａｒｉｏｕｓｓｔｕｄｙｏｆｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｈｉｓｔｈｅｍｅｒｅｐｏｔｅｒｄａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｍｅｔｈｏｄｔｏｉｓｏｌａｔｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｆｒｏｍｉｓｆｈｔｉｓｓｕｅ．Ｔｈｉｓｐｒｏｃｅｓｓｗａｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｗａｓｉｎｔｅｇｒｉｔｙ，ＳＯｉｔｃｏｕｌｄａｖｏｉｄｔｏｂｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｂｙｋａｒｙｏｎＤＮＡ，ｐｒｏｔｅｉｎ，ｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｅｔｃ．ＴｈｅｒａｔｅａｎｄｐｕｒｅｄｅｇｒｅｅｏｆｍｔＤＮＡｃｏｕｌｄｂｅａｐｐｅａｓｅｄｆｎｒｓｔｕｄｙｏｎｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｆｒｏｍｉｓｆｈ．

分离线粒体

从细胞、组织中分离线粒体——差速离心法所需缓冲液：RSB（使细胞膨胀的低渗缓冲液）10mM NaCl（Mr=58.44）2.5mM MgCl2（Mr=203.3）10mM Tris-Cl（PH8.0）调PH值至7.4配法：0.5844g NaCl，0.5083g MgCl2·6H2O，10ml 1M Tris-Cl（PH8.0），调PH值至7.4，加水定容至1000ml。

2.5×MS缓冲液（MS缓冲液是用来保持细胞器张力的等渗缓冲液）525mM甘露醇（Mr=182.17）175mM 蔗糖（Mr=342.3）12.5mM Tris-Cl（PH8.0）2.5mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：19.13g甘露醇，11.98g蔗糖，加150ml水溶解，加2.5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），1ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至200ml。

1×MS缓冲液210mM甘露醇70mM 蔗糖5mM Tris-Cl（PH8.0）1mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：38.26g甘露醇，23.96g蔗糖，加800ml水溶解，加5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），2ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至1000ml。

注意事项：溶液、离心管应在冰上预冷，所有离心步骤都要在40C进行。

从细胞中分离线粒体：1．消化贴壁细胞，加5ml培液，转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清；悬浮细胞直接转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清。

2．用3ml冰上预冷的RSB重悬细胞，让细胞膨胀10min，加3×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆，转速不宜过快。

普利莱基因技术线粒体提取试剂盒说明书

升级版线粒体提取试剂盒C0010描述：线粒体制备试剂盒(Mitochondria Isolation Kit)用于从组织或培养细胞中分离线粒体和细胞胞浆成分。

加入分离溶液，匀浆破碎组织细胞，经过数次800g和12000g离心，在60分钟内即可分离出完整的线粒体和胞浆成分。

制备的线粒体具有很高的生物学活性，可进行各种功能研究如酶学测定，更可用于Western Blot、2D-胶、线粒体蛋白或DNA提取、蛋白质组学等研究。

严格按照说明操作，总是能制备获得高纯度线粒体。

一篇方法学研究论文发现，用普利莱试剂盒制备线粒体的得率、活性、纯度优于蔗糖密度梯度离心法和Invotrogen/Pierce线粒体提取试剂盒方法。

适用：从组织、培养细胞制备高纯度线粒体，同时分离细胞胞浆成分。

组成：Mito Solution100ml for50次制备200ml for100次制备储存：−20ºC12个月有效操作步骤：以下所有操作均在4ºC进行1.组织匀浆：100~200mg新鲜组织如肝、脑、肾、心肌等，剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。

估计组织块总体积。

加入1.5ml冰预冷的Mito Solution。

用间隙严紧的研杵上下研磨组织20次。

培养细胞匀浆：800×g5min离心收集细胞。

单次提取需2-5×107个细胞。

加入1.5ml冰预冷Mito Solution 重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，用间隙严密的研杵研磨细胞30次。

2.将匀浆液转移到离心管中，800×g，4ºC离心5min。

（胞核、膜碎片、未裂解细胞等在管底，弃去）3.收集上清液并转移到新的离心管。

再次800×g离心5min at4ºC，弃沉淀。

4.将上清液转移到新的离心管。

10,000×g离心10min4ºC。

线粒体沉淀在管底。

离心后的上清含胞浆成分，可收集用于对照实验。

蛋白提取方法及注意事项

组织蛋白提取材料准备：组织、冰块、称、超声匀浆器、试剂各种试剂比例：PMSF：Lysis Buffer = 1:1001、将组织称重，减去EP管重量2、每100mg组织加入1mL(1mg ,10ul)试剂，冰上裂解半小时3、匀浆（注意低温操作），开20秒，关2秒，共打20次，每次用水冲洗，擦干，超声完后放冰上4、将匀浆液移至1.5mL预冷离心管5、离心，12000转，4℃，30分钟6、取上清至新的预冷的EP管7、BCA定量8、放入—80℃线粒体蛋白提取材料准备（放冰盒中）：线粒体试剂、EP管、EP管中的组织、枪头、PBS1、用冷PBS清洗细胞2次，洗后吸干上清2、加入A200uL，放冰上10分钟3、匀浆30-40次，每次用清水清洗匀浆器头4、离心500rpm，4℃，5分钟5、将上清移至离心管6、离心1100rpm，4℃，20分钟7、沉淀中加入200uLB，混匀8、离心1100rpm，4℃，20分钟9、弃上清10、加入80-150uL裂解液，放冰上20分钟，每隔5分钟高速震荡15秒，11、得线粒体蛋白12、定量后放-80℃冰箱。

细胞总蛋白提取材料准备：试剂（—20℃）、细胞培养板、EP管（已标记）均放置于冰盒中操作，以防止蛋白降解。

1、吸掉培基2、加入PBS，约1ml/孔左右，用手晃匀3、约5min后倒去PBS，并用枪将PBS尽量吸尽4、加入试剂，摇床振荡10分钟，再置冰上10分钟。

培养器皿面积（cm2）培养液量（ml）细胞量裂解液（ul）96 孔培养板0.32 0.1 10524孔培养板 2 1.0 5×10512孔培养板 4.5 2.0 1066孔培养板9.6 2.5 2.5×106803.5 cm 培养皿8 3.0 2×1066 cm 培养皿21 5.0 5.2×10632010 cm 培养皿55 10.0 13.7×10680025cm2培养瓶25 5.0 5×10675cm2培养瓶75 15～30 2×1075、用黄色枪头将各孔中cell刮下，保证孔底部分都要刮到，根据分组将细胞悬液吸入各个EP管中。

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从动物组织中粗提线粒体
一、实验目的：
从动物组织中分离线粒体，以便线粒体功能分析实验。

二、实验准备
Lysis buffer、匀浆器、离心管、解剖器具
三、实验步骤：
1．实验前一天小鼠禁食过夜。

线粒体提取前所有溶液要冰上预冷。

2．解剖小鼠（~30g），快速取出肝脏，去除胆囊，放入50ml预冷的IBc烧杯中；
3．预冷的IBc洗去多余的血液。

洗4-5次至IBc澄清。

4．冰上将肝脏剪碎
5．倒掉清洗的IBc，加入新的5mlIBc，将上清转移至玻璃匀浆器
6．以1,600 rpm冰上匀浆3-4次，组织与缓冲液比例1：5-1：10间
7．匀浆液转移至50ml离心管，600g，离心10min 4 ℃
8．小心将上清转移至新的离心管600g，离心10min 4 ℃
9．小心将上清转移至新的离心管7000g，离心10min 4 ℃
10．倒掉上清，加入5ml预冷的IBc，洗一次，不要用枪头重悬
11．7000g，离心10min 4 ℃
12．去除上清，重悬底部的含有线粒体的颗粒。

用玻璃棒搅松底部的沉淀，不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬。

用1ml移液管重悬避免出现气泡。

13．转移至14ml离心管，置于冰上。

线粒体在1-3小时内用于实验，得到比较好的活性。

14．Bradford法测定线粒体浓度。

四、试剂配方
Buffer for cell and mouse liver mitochondria isolation (IBc)：100 ml
10 ml 0.1M Tris–MOPS
1 ml 0.1M EGTA/Tris
20 ml 1M sucrose
100 ml ddH2O，pH 7.4
储液：
1 M sucrose：
342.3 g sucrose
1L ddH2O
Mix, 20 ml分装-20 C保存.
0.1MTris/MOPS：
12.1 g Tris；
500ml ddH2O，MOPS 调pH 7.4，ddH2O 体积至1L保存于4 C.
0.1 M EGTA/Tris：
38.1 g EGTA；
500 ml ddH2O，Tris调pH 7.4 总体积至1L ，保存于4 C.
五、注意事项
1. 开始前将离心管预冷5min，所有步骤包括匀浆在4度冰上进行，降低磷脂酶和蛋白酶活性；
2．最后重悬时，用玻璃棒搅松底部的沉淀。

不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬，线
粒体在高浓度减少与氧接触时可长时间保持其功能。