裂解多糖单加氧酶在毕赤酵母中的异源表达
外源基因在酵母体系中表达
C.albicans hyphal n.r cell wall Ag
Spinach
2
phosphoribulokinase
S/Mut+ Halaas, et al (1995)
Shiba, et al (1995)
S/Mut+
S/Mut+, S/MutS( 30,000 copies/c ell) S/MutS
fragment C
Pertusis
3
antigen P69
Mouse EGF 0.45
Aprotinin 0.8
Kunitz
1
protease
inhibitor (A-
beta-PP)
Human
4
serum
albumin(HS
A)
HIV-1
1.25
gp120
and
0.02
I/Mut+ and Muts I/Muts S/Muts S/Mut+/Muts S/Mut+
第一代酵母基因工程表达系统是以酿酒酵 母表达系统为典型代表。
第二代酵母基因工程表达系统的典型代表 就是近年来倍受关注的毕赤酵母表达系统 等为代表的甲醇酵母表达系统：
1987年Cregg等首次报道甲醇营养型毕 赤酵母(Methy1otrophic Pichia pastoris)表达 外源蛋白以来，由于它具有表达效率高， 遗传稳定，产物可分泌表达等优点，己成 为近年来极受青睐的真核基因表达系统。
S:284
ds Fv (di-sulfide-bonded n.r S/n.r Luo, et al (1995), J.
single chain antibodies) n.r
结合利用pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的多拷贝载体并在毕赤酵母中表达
结合利用pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的多拷贝载体并在毕赤酵母中表达冯菲;王雪妍;陈晓飞;宁萌;周伏忠;刁文涛【摘要】Vectors pGAPZαA and pPICZαA were utilized to construct the multi-copies expression plasmid that can be linearized to maintain the transformation rate at a high level and have a higher yield of interesting protein than the single-copy plasmid.The gene of the interesting protein was originally constructed in the constitutiveexpression vectorpGAPZαA,then the expression cassette is digested out with the isocaudamers Bgl Ⅱ and BamH Ⅰ and co nstructed in the methanol inducible expression vector pPICZαA at BamH Ⅰ site.The multi-copies expression plasmid was constructed after several times repeating.The LZ8 which is a fungal immunomodulatory protein from Lingzhi is used as an example.Its multi-c opies expression plasmid pPICZαA-[GAPZαA-LZ8] 4 is constructed after repeating 4 times.Then the plasmid is linearized at the unique Sac Ⅰ site of pPICZαA and transformed in GS115.The yield of LZ8 expressed in the clones is transformed with pPICZαA-[GAPZαA-LZ8]4 reaches 2 or 3 times of that in the clones which is transformed with pGAPZαA-LZ8.We find the linearizable multi-copies expression plasmid bases on combination utilization of pGAPZαA and pPICZαA can express the interesting protein in GS115 at a higher level than the single-copy plasmid.%结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的可线性化多拷贝表达载体,并转化毕赤酵母表达目的蛋白.首先将目的蛋白基因构建到组成型表达载体pGAPZαA中,然后依据载体自身特性,用同尾酶Bgl Ⅱ和BamH Ⅰ切取其表达盒并连接到甲醇诱导型载体pPICZαA中的BamH Ⅰ位点处,经多次重复后获得目的蛋白多拷贝表达载体,线性化后电转化毕赤酵母表达目的蛋白.灵芝免疫调节蛋白LZ8是一个已成功在毕赤酵母中表达的蛋白,作为检验该方法的样本其基因被首先构建到载体pGAPZαA中得到质粒pGAPZαA-LZ8,切取其表达盒构建到载体pPICZαA中,经过4次重复得到了多拷贝表达载体pPICZαA-[GAPZαA-LZ8]4,然后利用pPICZαA特有的限制性内切酶位点SacⅠ进行线性化,最终电转化到毕赤酵母GS115中进行组成型表达蛋白LZ8,其表达量达到pGAPZαA-LZ8转化菌株表达量的2～3倍.经检验,结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA可以构建目的蛋白的多拷贝表达载体,并且可以对载体进行线性化而不影响转化酵母时的转化效率.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2017(035)001【总页数】5页(P83-87)【关键词】pGAPZαA;pPICZαA;多拷贝;毕赤酵母【作者】冯菲;王雪妍;陈晓飞;宁萌;周伏忠;刁文涛【作者单位】河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州450008【正文语种】中文【中图分类】Q785酵母作为单细胞的真核生物，既具有与原核细胞生物相当的生长速度，又具有真核生物对蛋白质翻译后修饰的能力，在表达一些需要翻译后修饰的蛋白时具有常用的大肠杆菌表大系统无可比拟的优势，而相对于昆虫细胞和哺乳动物细胞这些高等真核细胞而言，其操作简单、成本低廉，所以在蛋白质表达方面酵母表达系统得到广泛的应用与发展［1-2］.酿酒酵母作为最早开发的酵母表达宿主，成功表达了包括干扰素、重组疫苗、胰岛素和降钙素在内的多种真核蛋白［3-5］.但是酿酒酵母存在难以高密度发酵、缺乏强有力启动子以及分泌效率低等缺点，所以毕赤酵母表达系统就应运而生［6-7］.毕赤酵母不仅具有醇氧化酶（AOX）和三磷酸甘油醛（GAP）等强启动子［8-10］，而且易于进行高密度发酵而更高效地表达外源蛋白，胞外分泌表达的鼠明胶蛋白产量可达14.8 g/L［11］.在毕赤酵母中，外源基因可以整合重组到其基因组中而不易丢失［12］，此外毕赤酵母还具有自身胞外蛋白少，分泌表达的外源蛋白糖基化程度低等优点［13-14］.因而毕赤酵母表达系统得到了越来越广泛的研究与应用.由于毕赤酵母中没有稳定的天然载体，其表达载体一般是能够在大肠杆菌中复制扩增的穿梭载体，不含有酵母复制起点，只能重组到酵母基因组中进行外源基因表达［10］.由Invitrogen公司开发的诱导型表达载体pPICZ/pPICZα系列与组成型表达载体pGAPZ/pGAPZα系列分别含有甲醇诱导型醇氧化酶（AOX）启动子和组成型表达的三磷酸甘油醛（GAP）启动子，载体中均含有博莱霉素（zeocin）抗性基因，用于细菌及酵母转化筛选，被用于在毕赤酵母中分泌或胞内表达目的蛋白［15-19］，这两个系列的载体均可利用BglⅡ和BamHⅠ这一对同尾酶构建外源基因多拷贝质粒，从而获得外源蛋白表达量更高的多拷贝转化子，但是由于质粒的线性化位点包含在启动子中，在多拷贝质粒构建时也同时引进了多个线性化酶切位点而使得在酵母转化时无法对质粒进行线性化而大大降低转化效率（参见Invitrogen pPICZ/pPICZα系列载体说明书）.本试验利用pPICZ/pPICZα载体与pGAPZ/pGAPZα载体有不同线性化酶切位点这一特点，结合使用实验室已有的载体pGAPZαA和pPICZαA构建灵芝真菌免疫调节蛋白LZ8这一已经成功在毕赤酵母中表达的蛋白的多拷贝质粒［20］，并将其线性化质粒转化到毕赤酵母GS115中进行多拷贝表达.1.1 材料质粒与菌株：pGAPZαA、pPICZαA、大肠杆菌Top10、酵母菌GS115.主要试剂：博莱霉素（zeocin）、Tris、盐酸、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、SDS聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖、冰醋酸、EDTA、酵母基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒等.培养基：低盐LB培养基（5%NaCl，用于质粒构建）、YPD培养基（用于酵母培养）.酶：EcoRⅠ、XbaⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、AvrⅡ和SacⅠ等DNA限制性内切酶，碱性磷酸酶（CIAP）、T4 DNA连接酶等.1.2 实验方法1.2.1 质粒构建首先参考《分子克隆实验指南》一书将目的基因LZ8构建到载体pGAPZαA中，得到质粒pGAPZαA-LZ8.然后根据质粒pGAPZαA和pPICZαA适合构建多拷贝的特点，将质粒pGAPZαA-LZ8中的表达盒用BglⅡ和BamHⅠ这一对同尾酶切出，然后构建到经BamHⅠ酶切并经碱性磷酸酶CIAP脱磷的载体pPICZαA中.在提取质粒后用BglⅡ和BamHⅠ进行双酶切，然后根据酶切结果判断连接方向是否正确，经n次重复后可构建含有n个LZ8表达盒拷贝的质粒pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］n.1.2.2 酵母转化参考Invitrogen公司的质粒pGAPZαA说明书中线性化质粒酵母电转化方法.1.2.3 蛋白表达量计算取待测发酵液上清，加入上样缓冲液，100℃加热5 min，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色后，用BIORAD凝胶成像仪成像，并统计目的蛋白条带灰度值作为计算蛋白表达量的依据.2.1 多拷贝质粒构建首先利用EcoRⅠ和XbaⅠ两个限制性内切酶位点将灵芝免疫调节蛋白LZ8的基因构建到载体pGAPZαA中得到质粒pGAPZαA-LZ8，如图1（a）所示.然后再利用BglⅡ和BamHⅠ两个限制性内切酶位点将质粒pGAPZαA-LZ8中包括启动子GAP、目的基因LZ8和终止子AOX1 TT在内的整个表达盒构建到载体pPICZαA 中，共构建进4个拷贝，得到质粒pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4，如图1（b）所示.2.2 酵母转化与蛋白表达量比较利用电转化法将经限制性内切酶AvrⅡ线性化的质粒pGAPZαA-LZ8和pGAPZαA（阴性对照）以及经限制性内切酶SacⅠ线性化后的质粒pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4分别转化到酵母GS115中.随机挑取5个pGAPZαA-LZ8转化菌株，3个pGAPZαA转化菌株和5个pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4转化菌株，提取酵母基因组后，用PCR的方法检测基因LZ8，结果如图2所示.由图可见，质粒pGAPZαA-LZ8和pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4都成功转化进GS115中.挑取以上转化后的酵母分别接种到YPD中培养过夜，测量OD600值，然后用新鲜的YPD培养基将其均稀释至OD600值为0.1，继续培养过夜，次日将菌液离心收集上清液，取等量上清进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测LZ8的表达，结果如图3所示，可见质粒pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4在GS115中成功重组并分泌表达了目的蛋白LZ8，其表达量达到pGAPZαA-LZ8转化菌株表达量的2～3倍.本文中用到的由Invitrogen公司开发的组成型表达载体pGAPZαA和诱导型表达载体pPICZαA都可以用来构建多拷贝表达载体，而且其进行多拷贝质粒构建的方法相同.由于转化前质粒的线性化要通过存在于启动子上的DNA限制性内切酶的酶切位点来实现，所以，如果应用单一一种载体进行多拷贝质粒构建的话，质粒就无法线性化，多拷贝质粒的转化效率就会降低.利用这两种载体线性化酶切位点不同这一特性，将连有目的基因的载体pGAPZαA中的表达盒多次构建到载体pPICZαA中，最终通过载体pPICZαA的启动子AOX上的限制性内切酶位点SacⅠ进行线性化，转入酵母后，质粒通过启动子AOX与酵母基因组重组，而由载体pGAPZαA上的组成型启动子GAP启动目的基因来表达，这样即实现了目的基因的多拷贝化，又可以对转化前多拷贝质粒进行线性化而保证转化效率.利用灵芝免疫调节蛋白LZ8进行验证，虽然可能由于营养及转录、翻译等原件的限制原因，含有4个表达盒的多拷贝质粒pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4转化的酵母表达的蛋白LZ8的量相对于单拷贝质粒pGAPZαA-LZ8没有达到4倍，但也有了非常明显的提升，说明这种方法确实可行，而且理论上将两个载体对调使用也应该能够获得甲醇诱导表达的多拷贝转化子.结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA可以构建目的蛋白的多拷贝表达载体，得到的多拷贝表达载体可以被线性化而不影响转化酵母时的转化效率，其转化子中目的蛋白的表达量普遍高于单拷贝转化子.【相关文献】［1］ 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毕赤酵母表达实验手册
毕⾚酵母表达实验⼿册毕⾚酵母表达实验⼿册Jnuxz丁⾹园虚拟社区蛋⽩质技术讨论版⼤肠杆菌表达系统最突出的优点是⼯艺简单、产量⾼、周期短、⽣产成本低。
然⽽，许多蛋⽩质在翻译后，需经过翻译后的修饰加⼯，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋⽩酶⽔解等过程才能转化成活性形式。
⼤肠杆菌缺少上述加⼯机制，不适合⽤于表达结构复杂的蛋⽩质。
另外，蛋⽩质的活性还依赖于形成正确的⼆硫键并折叠成⾼级结构，在⼤肠杆菌中表达的蛋⽩质往往不能进⾏正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋⽩，就需要进⾏变性溶解及复性等操作，这⼀过程⽐较繁琐，同时增加了成本。
⼤肠杆菌是⽤得最多、研究最成熟的基因⼯程表达系统，当前已商业化的基因⼯程产品⼤多是通过⼤肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量⾼、易于操作。
但⼤肠杆菌是原核⽣物，不具有真核⽣物的基因表达调控机制和蛋⽩质的加⼯修饰能⼒，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应⽤。
近年来，以酵母作为⼯程菌表达外源蛋⽩⽇益引起重视，原因是与⼤肠杆菌相⽐，酵母是低等真核⽣物，除了具有细胞⽣长快，易于培养，遗传操作简单等原核⽣物的特点外，⼜具有真核⽣物时表达的蛋⽩质进⾏正确加⼯，修饰，合理的空间折叠等功能，⾮常有利于真核基因的表达，能有效克服⼤肠杆菌系统缺乏蛋⽩翻译后加⼯、修饰的不⾜。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利⽤。
［1］。
同时与⼤肠杆菌相⽐，作为单细胞真核⽣物的酵母菌具有⽐较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加⼯修饰能⼒。
酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分⼦遗传学⽅⾯被⼈们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。
1981年酿酒酵母表达了第⼀个外源基因----⼲扰素基因［2］，随后⼜有⼀系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。
⼲扰素和胰岛素虽然已经利⽤酿酒酵母⼤量⽣产并被⼴泛应⽤，当利⽤酿酒酵母制备时，实验室的结果很令⼈⿎舞，但由实验室扩展到⼯业规模时，其产量迅速下降。
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。
+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。
=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。
Kex2蛋白酶在毕赤酵母中的表达、纯化和性质研究
Kex2蛋白酶在毕赤酵母中的表达、纯化和性质研究刘颖颖;王之可;李素霞【摘要】目的研究Kex2 (EC.3.4.21.61)蛋白酶在毕赤酵母中的重组表达、纯化和部分性质.方法 Kex2基因整合进pPIC9K质粒中,通过电转构建重组毕赤酵母GS115-Kex2,G418筛选多拷贝子,甲醇诱导得到目的蛋白.通过强阴离子交换层析Q-FF对重组蛋白进行纯化,对纯化后的蛋白进行酶学性质研究.结果通过毕赤酵母表达可以得到具有活性的重组Kex2蛋白酶,以Boc-Gln-Arg-Arg-pNA(叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-对硝基苯胺,Boc-QRR-pNA)为底物检测酶的活性,发酵外液活性达270U/L,SDS-PAGE检测目的蛋白的分子量为67kDa,经Q-FF纯化后,目的蛋白的活性回收率为84％.重组Kex2蛋白酶在pH5.0～6.0之间稳定,pH9.0时活性最高.在25℃,pH5.0条件下放置12h活力可保持88.2％.以Boc-QRR-pNA 为底物,测得重组Kex2蛋白酶的Km值为0.0167 mmol/L,Vmax值为333.3μmol/min.结论利用毕赤酵母可成功表达分泌Kex2蛋白,经Q-FF纯化后可得到较纯的Kex2蛋白酶.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】4页(P37-39,42)【关键词】Kex2;毕赤酵母;表达;纯化;稳定性【作者】刘颖颖;王之可;李素霞【作者单位】生物反应器工程国家重点实验室,华东理工大学,上海200237;生物反应器工程国家重点实验室,华东理工大学,上海200237;生物反应器工程国家重点实验室,华东理工大学,上海200237【正文语种】中文【中图分类】Q566+.9Kex2蛋白酶是酵母自身编码的一种前体加工酶，是一个钙离子依赖型的丝氨酸蛋白酶，属于枯草杆菌蛋白酶家族,其专一性地切割Lys-Arg, Arg-Arg, Pro-Arg的C末端肽键[1-3]。
毕赤酵母蛋白表达系统研究进展
P． pastoris 是甲醇营养型酵母中的一种，可以在 含有甲醇的培养基上快速生长。与其他蛋白表达系
收稿日期： 2010-11-02 基金项目： 福建省科技厅资助项目（ 2009N0032） ，福建省教育厅资助项目（ JA08041） 作者简介： 杨梅，女，博士，教授，研究方向： 生物化学与分子生物学； E-mail： myang@ fjnu． edu． cn
3 外源蛋白的表达及其影响因素
目前，毕赤酵母蛋白表达系统在国内外应用都 很广泛，已成功表达许多外源蛋白。但由于毕赤酵 母本身仅分泌少量蛋白，因此外源蛋白占培养基中 总蛋白的绝大多数。有些外源蛋白的表达量可达到 g / L 以上水平，如 Hao 等［27］成功表达的重组人复合 α-干扰 素 （ cIFN） 的 表 达 量 达 到 1． 24 g / L； Huang 等［28］表达的截短的 1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶的表达 量为 3 g /L。虽然许多外源蛋白都可以在毕赤酵母 中高效表达，但仍然有些蛋白表达量相对较低或不 表达，在同一表达系统中表达不同的外源蛋白，其表 达量千差 万 别，外 源 蛋 白 的 表 达 受 多 方 面 因 素 的 影响。 3． 1 外源基因自身的内在特性
母属（ Candida） 和汉逊酵母属（ Hansenula） 等。毕赤 酵母（ P． pastoris） 作为甲醇酵母的一种，是单细胞低 等真核生物，已发展成为广泛应用的表达宿主。与 其他表达系统相比，毕赤酵母具有不可比拟的优势， 其既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和试 验过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还 可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备 了典型的真核生物表达体系的特点。毕赤酵母表达 系统已发展成为一个较为理想的蛋白表达系统，被 国内外广泛应用于生产外源蛋白。目前，已有 500 多种外源蛋白在该表达系统中获得表达［4］。
毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表达系统Mut+和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产品，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。
简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。
为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。
注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍缺乏以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必须的。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不管是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。
Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts 在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。
菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。
GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可抵偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。
这些受体菌自发突变成组氨酸野生型的概率一般低于10-8。
GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。
抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究
抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究引言：抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子肽类物质，这些肽在自然界中广泛存在于动植物和一些微生物中。
由于其天然来源、低毒性、高效率等特点，抗菌肽被广泛应用于食品、医药、农业等领域。
然而，抗菌肽的大规模生产受到了许多因素的限制，如成本、稳定性等。
因此，酵母异源表达系统成为抗菌肽及其他功能蛋白高效率制备的理想平台。
本文将介绍抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究现状和挑战。
一、抗菌肽的酵母异源表达1.1 酵母异源表达系统简介酵母是一类简单的真核生物，其异源表达系统具有优异的蛋白质表达性能和机制研究条件。
常用的酵母包括酿酒酵母(酮酸酸酯酵母)，毕赤酵母等。
酿酒酵母是一种广泛应用于工业生产中的真菌，具有优秀的产酒性能和设备基础。
因此，酿酒酵母常被选为抗菌肽异源表达的宿主菌株。
1.2 抗菌肽的酵母异源表达策略抗菌肽异源表达的主要策略分为两类：短肽策略和全长策略。
短肽策略通过合成或克隆抗菌肽编码基因的短序列至酵母基因中，将其表达于酵母细胞。
全长策略则采用克隆含有完整抗菌肽基因的表达载体，将其转化至酵母中。
两种策略各有优缺点，在不同情况下可根据需要选择适宜的表达策略。
1.3 抗菌肽异源表达困难与解决抗菌肽的异源表达常常面临以下困难：剧毒性、导入异源抗菌肽基因时的细胞毒性及失活等。
为解决这些问题，研究者采用了许多策略，如信号肽重组、构建多基因拷贝操控系统、优化培养条件等。
这些改进方案显著提高了抗菌肽异源表达的成功率和产量。
二、酶类酵母异源表达的研究2.1 酶类在工业生产中的重要性酶类是一类在化学反应中起催化作用的生物催化剂，具有高效、特异性、低成本等特点。
在日常生活和工业生产中，酶类广泛应用于食品、制药、能源等领域。
因此，酵母异源表达酶类的研究具有重要的应用价值。
2.2 酵母异源表达酶类的策略酵母是一类优质的酶源，其异源表达系统具有高效稳定的表达性能。
常用的酵母异源表达构建策略包括直接表达、表面展示、分泌表达等。
毕赤酵母表达系统
毕赤酵母表达系统毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。
抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。
毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。
GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。
转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。
培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。
在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。
贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。
注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。
以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。
载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。
如果只想得到Muts 重组子，使用KM71 菌株。
单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts 重组菌（例如：插入AOX1或his4 而不是取代AOX1）。
6毕赤酵母介绍
毕赤酵母及级胰岛素——优思灵巴斯德毕赤酵母(P／ch／a pastor／s)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处。
酵母作为一种最简单的单细胞真核生物, 兼有原核生物和真核生物的某些优点。
毕赤酵母生活史与酿酒酵母十分相似。
这使得毕赤酵母的发酵工程部分可与酿酒酵母相同, 从而节省了重新购臵设备和进行新技术探索的巨额花费, 这是用其他方法进行大规模商品化的外源蛋白生产所不能比拟的优势。
现将毕赤酵母表达系统优点概括如下:①毕赤酵母更接近高等真核细胞, 不含内毒素和其他有害物质, 使用安全;②同酿酒酵母一样, 繁殖速度快, 对培养条件要求低, 培养基价廉, 能进行高密度培养, 且能耐受较高的液体静压, 便于工业化生产;②该系统的载体能与核基因组进行整合, 因此构建的菌株较稳定, 一般不会在传代过程中出现丢失现象;③在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内, 又可在分泌信号作用下将蛋白分泌至胞外;⑤具有强有力的易控制的乙醇氧化酶基因(AOX1)或磷酸甘油酸脱氢酶( GAP) 基因启动子作为外源基因启动子, 可对外源蛋白的表达进行严格调控;⑥作为真核表达系统, 可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰, 即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N糖基化、O糖基化, 从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性;⑦外源蛋白表达量高, 同时自身分泌的背景蛋白少, 表达产物易于纯化;⑧和酿酒酵母相比, 毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基, 比酿酒酵母每条侧链平均50～150个甘露糖残基短得多。
毕赤酵母极少出现过渡糖基化, 可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能, 而且糖链中不含具有致敏作用的α21, 32甘露糖, 使其使用更加安全。
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第４１卷第６期２０１９年１１月湖北大学学报(自然科学版)ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ)Ｖｏｌ.４１㊀Ｎｏ.６㊀Ｎｏｖ.２０１９㊀收稿日期:２０１８１２０３基金项目:湖北省科技支撑计划项目(２０１５ＢＣＡ２７１)资助作者简介:姚昌阳(１９９３)ꎬ男ꎬ硕士生ꎻ康立新ꎬ通信作者ꎬ讲师ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｈｄｌｉｘｉｎ７７＠１６３.ｃｏｍ文章编号:１０００２３７５(２０１９)０６０５６１０６裂解多糖单加氧酶在毕赤酵母中的异源表达姚昌阳ꎬ谢兴欢ꎬ蒋思婧ꎬ马立新ꎬ康立新(湖北大学生命科学学院ꎬ湖北武汉４３００６２)摘要:裂解多糖单加氧酶(ｌｙｓａｔｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅꎬＬＰＭＯ)是一类含铜氧化酶ꎬ在还原型辅因子存在下可氧化裂解纤维素ꎬ对纤维素的降解起重要作用.优化并合成黄孢原毛平革菌(Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ)ｌｐｍｏ基因ꎬ构建ｐＰＩＣＺαＡ￣Ｐｃｌｐｍｏ表达载体ꎬ电转毕赤酵母ＧＳ１１５实现了分泌表达ꎬ重组蛋白表达量为４５０ｍｇ/Ｌ.重组ＰｃＰＬＭＯ对微晶纤维素催化活性为１４Ｕ/ｍＬꎬ对碱预处理的秸秆纤维活性较高ꎬ为２４Ｕ/ｍＬ.ＰｃＰＬＭＯ具有较好的热稳定性ꎬ分别在８０㊁９０㊁１００ħ保温６０ｍｉｎꎬ残留活性为８０％㊁６２％与４８％.经ＥｎｄｏＨ脱糖基化分析ꎬＰｃＬＰＭＯ发生了高度糖基化修饰ꎬ从而促进了酶的高温热稳定.相关结果可为ＬＰＭＯ协同纤维素酶降解纤维素的应用提供参考.关键词:裂解多糖单加氧酶ꎻ异源表达ꎻ热稳定ꎻ糖基化中图分类号:Ｑ８１２㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣２３７５.２０１９.０６.００１ＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＹＡＯＣｈａｎｇｙａｎｇꎬＸＩＥＸｉｎｇｈｕａｎꎬＪＩＡＮＧＳｉｊｉｎｇꎬＭＡＬｉｘｉｎꎬＫＡＮＧＬｉｘｉｎ(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＷｕｈａｎ４３００６２ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｌｙｓａｔｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ(ＬＰＭＯ)ｉｓａｃｌａｓｓｏｆｃｏｐｐｅｒｏｘｉｄａｓｅꎬｗｈｉｃｈｃｌｅａｖｅｇｌｙｃｏｓｉｄｅｂｏｎｄｓｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅｉｎａｎｏｘｉｄａｔｉｖｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｒｅｄｕｃｔｉｖｅｃｏｆａｃｔｏｒｓꎬｐｌａｙｉｎｇａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｌｐｍｏｇｅｎｅｏｆＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｈａｄｂｅｅｎｏｐｔｉｍｉｔｅｄａｎｄｓｙｎｔｈｅｔｉｚｅｄꎬａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＰＩＣＺαＡ￣ＰｃｌｐｍｏｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５ｂｙｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｓｅｃｒｅｔｏｒｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄａｔ４５０ｍｇ/Ｌ.ＴｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄＰｃＬＰＭＯｏｎａｖｉｃｅｌｗａｓ１４Ｕ/ｍＬꎬａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒａｌｋａｌｉｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｓｔｒａｗｆｉｂｅｒｓｕｂｓｔｒａｔｅｗａｓ２４Ｕ/ｍＬ.ＰｃＰＬＭＯｈａｄｂｅｔｔｅｒｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙꎬａｆｔｅｒｋｅｅｐｉｎｇａｔ８０ħꎬ９０ħａｎｄ１００ħｆｏｒ６０ｍｉｎꎬｔｈｅｒｅｓｉｄｕａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｅｒｅ８０％ꎬ６２％ａｎｄ４８％ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＥｎｄｏＨｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＰｃＬＰＭＯｗａｓｈｉｇｈｌｙｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙ.ＴｈｅｒｅｌｅｖａｎｔｒｅｓｕｌｔｓｃａｎｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｆｕｒｔｈｅｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＬＰＭＯｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｃｅｌｌｕｌａｓｅｔｏｄｅｇｒａｄｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｌｙｓａｔｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓꎻｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙꎻｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ０㊀引言纤维素是葡萄糖经β￣１ꎬ４糖苷键聚合而成的多糖ꎬ在自然界资源最丰富ꎬ其降解主要依赖于微生物产生的内切和外切糖苷水解酶及辅助性酶￣裂解多糖单加氧酶(ｌｙｓａｔｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅꎬＬＰＭＯ).糖苷水解酶催化降解结晶态纤维素的效率较低ꎬ使纤维素资源的有效利用受到限制.ＬＰＭＯ是一类含铜氧化酶ꎬ在还原型辅因子存在下可作用于结晶多糖ꎬ通过氧化方式断裂纤维素等５６２㊀湖北大学学报(自然科学版)第４１卷多糖的糖苷键ꎬ产生醛糖酸或酮基醛糖ꎬ同时使底物结晶态结构松散ꎬ糖苷水解酶与底物结合更容易ꎬ辅助提高多糖的降解及生物质转化[１].如天蓝色链霉菌ＬＰＭＯＣｅｌＳ２氧化碳１位裂解纤维素ꎬ产生醛糖酸[２]ꎻ铃兰链霉菌ＳｃＬＰＭＯ１０Ｂ[３]㊁粗糙脉孢霉ＮｃＬＰＭＯ９Ｅ[４]与ＮｃＬＰＭＯ９Ｃ[５]氧化碳１与碳４位裂解纤维素ꎻ太瑞斯梭壳孢霉ＧＨ６１Ｅ[６]与嗜热单孢菌Ｅ８[７]氧化断裂结晶态纤维素ꎬ提高复合纤维素酶对纤维素的降解效果及糖转化率ꎻ朱红密孔菌ＰａＧＨ６１Ｂ[８]与黄色嗜热子囊菌ＴａＧＨ６１Ａ[９]氧化碳６位裂解纤维素ꎬ且ＴａＧＨ６１Ａ对纤维素酶具有强烈协同作用ꎬ使磷酸膨胀纤维素转化效率接近３０％ꎻ嗜热毁丝菌ＭＴＬＰＭＯ９Ａ断裂纤维素糖苷键ꎬ也对内切葡聚糖酶Ⅰ起较强的协同作用ꎬ使寡糖释放率提高１６倍[１０].密黏褶菌ＧＴＧＨ６１单独不能氧化断裂纤维素ꎬ但与纤维素酶ＧＴＣＥＬ５Ｂ协同表现出高效的生物转化ꎬ对预处理的橡树纤维活性为１７４％[１１].柄壳霉ＰａＬＰＭＯ９Ａ与ＰａＬＰＭＯ９Ｈ氧化碳１位与碳４位ꎬＰａＬＰＭＯ９Ｅ只氧化碳１位ꎬ三者都可与纤维二糖脱氢酶协同作用纤维素ꎬ促进更多的寡糖释放[１２]ꎻ巢状曲霉ＡＮ３０４６与内源葡聚糖协同作用高粱秸秆ꎬ可促进还原糖释放提高１.２５倍[１３]ꎻ里氏木霉ＴｒＣｅｌ６１Ａ与土曲霉Ａｓｐｔｅ６可促进β￣葡萄糖苷酶对大豆纤维素提高７５％葡萄糖释放率[１４].ＬＰＭＯ虽可氧化裂解纤维素及辅助增强纤维素酶的催化效率ꎬ但工业化大规模生产应用还存在一定的挑战ꎬ如要求ＬＰＭＯ可高效表达ꎬ后续纯化简便ꎬ成本低廉ꎻ具有较高的比活性ꎬ以较低的用量即可高效协同纤维素酶促进纤维素降解ꎻ具有较好的热稳定性与耐ｐＨ等特性.本研究优化及合成了来源于黄孢原毛平革菌的ｌｐｍｏ基因ꎬ在毕赤酵母中实现异源表达ꎬ分析了重组蛋白的活性ꎬ为后续深入研究催化特性㊁辅助提高结晶纤维素的降解及工业应用提供重要参考.１㊀材料与方法１.１㊀实验材料㊀大肠杆菌(ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＴｏｐ１０)为本实验室保存ꎻ毕赤酵母(Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ)ＧＳ１１５㊁质粒ｐＰＩＣＺαＡ㊁博莱霉素Ｚｅｏｃｉｎ购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ꎻ限制性内切酶㊁连接酶㊁聚合酶㊁ＤＮＡ与蛋白质分子质量标准㊁ＤＮＡ片段纯化与质粒提取试剂盒均购自Ｔａｋａｒａ公司(大连).ＰＣＲ引物㊁基因合成和ＤＮＡ序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.滤纸为Ｗｈａｔｍａｎ１号定性滤纸ꎬ微晶纤维素粉与羧甲基纤维素钠购自国药集团化学试剂有限公司.碱预处理玉米秸秆纤维:２０目玉米秸秆粉ꎬ加入２％氢氧化钠ꎬ固液比１ʒ１０ꎬ常温处理４ｄꎬ酸中和后再水洗ꎬ烘干.其他化学试剂为国产分析纯.１.２㊀方法１.２.１㊀Ｐｃｌｐｍｏ基因密码子优化与合成㊀利用软件ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎｅｒ对黄孢原毛平革菌Ｐｃｌｐｍｏ基因(Ｇｅｎｂａｎｋ:ＡＢ６７０１２５.１)进行优化ꎬ根据毕赤酵母密码子偏好指数进行同义密码子替换ꎬ在Ｃ￣末端融合６ˑＨｉｓ基因ꎬ并在序列两端补加ＥｃｏＲⅠ与ＳａｃⅡ酶切位点.委托公司完成全基因合成.１.２.２㊀重组表达质粒的构建㊀利用ＥｃｏＲＩ和ＳａｃⅡ双酶切回收Ｐｃｌｐｍｏ片段ꎬ与经相同双酶作用的毕赤酵母表达质粒ｐＰＩＣＺαＡ在Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用下１６ħ连接过夜.连接产物转化大肠杆菌Ｔｏｐ１０感受态细胞ꎬＺｅｏｃｉｎ抗性平板３７ħ培养１６ｈ后挑取菌落ꎬ利用ｐＰＩＣＺαＡ通用测序引物(Ｆ￣５ᶄＡＯＸ１:５ᶄ￣ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣ￣３ᶄ与Ｒ￣３ᶄＡＯＸ１:５ᶄ￣ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣ￣３ᶄ)进行ＰＣＲ验证ꎬ随后测序.１.２.３㊀电转化酵母细胞及阳性转化子的筛选㊀提取测序正确的重组质粒ｐＰＩＣＺαＡ￣Ｐｃｌｐｍｏꎬ经限制性内切酶ＰｍｅＩ线性化反应３０ｍｉｎꎬ回收产物经电激转化毕赤酵母ＧＳｌｌ５ꎬ转化物涂布于含３００μｇ/ｍＬＺｅｏｃｉｎ的ＹＰＤ平板ꎬ２８ħ培养４８ｈ.挑取多个单菌落ꎬ经ＹＰＤ培养１２ｈ后破菌ꎬ以上清为模板ꎬ采用引物(Ｆ￣５ᶄＡＯＸ１与Ｒ￣３ᶄＡＯＸ１)进行ＰＣＲ检测ꎬ筛选Ｐｃｌｐｍｏ正确整合到酵母基因组上的阳性转化子.１.２.４㊀重组ＰｃＬＰＭＯ诱导表达㊀阳性酵母转化子接种在１００ｍＬＢＭＧＹ培养基(酵母粉１.０ｇꎬ蛋白胨２.０ｇꎬＹＮＢ１.３４ｇꎬ甘油１.０ｍＬꎬ０.１ｍｏｌ/ＬｐＨ６.０磷酸缓冲液１００ｍＬꎬＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)中２８ħ培养４８ｈꎬ离心收集菌体ꎻ用１００ｍＬＢＭＭＹ培养基(酵母粉１.０ｇꎬ蛋白胨２.０ｇꎬＹＮＢ１.３４ｇꎬ生物素４ˑ１０－５ｇꎬ０.１ｍｏｌ/ＬｐＨ６.０磷酸缓冲液１００ｍＬꎬＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)重悬菌体ꎬ２５ħ下甲醇诱导ꎬ每２４ｈ补加１.０％的甲醇ꎬ定时２４ｈ取样ꎬ上清液进行ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳.１.２.５㊀ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ凝胶电泳㊀参照凝胶电泳方法ꎬ采用１０％或１２％分离胶ꎬ４％浓缩胶ꎬ考马斯亮蓝Ｒ￣第６期姚昌阳ꎬ等:裂解多糖单加氧酶在毕赤酵母中的异源表达５６３㊀２５０对蛋白质染色.１.２.６㊀酶活性检测㊀参考文献[１５]ꎬ在含１ｍｍｏｌ/Ｌ抗坏血酸㊁１０μｍｏｌ/ＬＣｕ２＋㊁２０ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ㊁２５ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌｐＨ６.５缓冲液ꎬ４ｍｇ/ｍＬ微晶纤维素粉底物ꎬ３７ħ㊁２００ｒ/ｍｉｎ条件下反应６０ｍｉｎꎬＤＮＳ法测定生成还原糖的含量.酶活定义为每ｍｉｎ降解底物释放１μｇ还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位Ｕ.１.２.７㊀蛋白纯化与含量测定㊀重组蛋白Ｃ端带有６ˑＨｉｓꎬ采用Ｈｉｓ￣ｔａｇ镍柱进行纯化.先用１０ｍｍｏｌ/Ｌ低浓度咪唑洗脱液除去杂蛋白ꎬ再依次用不同浓度(５０㊁１００㊁１５０㊁２００㊁２５０㊁３００㊁５００ｍｍｏｌ/Ｌ)咪唑洗脱液收集目的蛋白ꎬ作ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析.以牛血清白蛋白为标准ꎬ采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法[１６]考马斯亮蓝染色测定重组ＰｃＬＰＭＯ含量.１.２.８㊀脱Ｎ￣糖基化处理㊀取纯化的重组蛋白ＰｃＬＰＭＯ２ｍｇꎬ在２０ｍｍｏｌ/ＬｐＨ５.５柠檬酸盐缓冲液中ꎬ加入１０ｎｇ脱Ｎ￣糖基化酶ＥｎｄｏＨꎬ３７ħ反应２ｈ.脱Ｎ￣糖基化前后的蛋白经ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测分析.１.２.９㊀热稳定性分析㊀将纯化的重组ＰｃＰＬＭＯ分别于８０㊁９０㊁１００ħ预处理不同时间(０㊁１５㊁３０㊁４５㊁６０ｍｉｎ)ꎬ随后测定残留酶活性ꎬ与以未经热处理的酶活性对比ꎬ分析重组ＰｃＰＬＭＯ的热稳定性.同时在相同条件下ꎬ测定重组ＰｃＰＬＭＯ经ＥｎｄｏＨ脱糖基化后的热稳定性.１.２.１０㊀不同底物催化活性㊀参照酶活测定条件ꎬ分析ＰｃＰＬＭＯ对０.５％滤纸(０.５ｃｍˑ０.５ｃｍ大小)㊁０.５％羧甲基纤维素钠与０.５％碱预处理玉米秸秆纤维等底物的催化活性.２㊀结果与分析图１㊀Ｐｃｌｐｍｏ密码子优化序列与原始序列比对Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ:相同序列ꎻｏｐｔｉｍｉｚｅｄ:优化后Ｐｃｌｐｍｏ序列ꎻｉｎｉｔｉａｌ:初始Ｐｃｌｐｍｏ序列２.１㊀Ｐｃｌｐｍｏ密码子优化前后序列比较㊀Ｐｃｌｐｍｏ基因经毕赤酵母密码子偏爱性优化后的序列与原始序列比对如图１ꎬ有７３％的碱基发生了替换.２.２㊀ＰｃＬＰＭＯ重组表达载体构建㊀合成的ＰｃＬＰＭＯ基因经ＥｃｏＲⅠ和ＳａｃⅡ限制性内切酶酶切回收后ꎬ与经相同内切酶处理的ｐＰＩＣＺαＡ质粒载体连接ꎬ构建ｐＰＩＣＺαＡ￣Ｐｃｌｐｍｏ重组质粒ꎬ随后重组质粒转化大肠杆菌ＴＯＰ１０.ｐＰＩＣＺαＡ￣Ｐｃｌｐｍｏ重组质粒构建过程如图２.２.３㊀重组ＰｃＬＰＭＯ表达与纯化㊀测序正确的酵母阳性转化子在ＢＭＭＹ中甲醇连续诱导８ｄꎬ每２４ｈ补加终浓度１％的甲醇.诱导液上清进行ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳ꎬ检测结果如图３.甲醇诱导第１天开始有少量目的蛋白分泌ꎬ随着诱导时间延长ꎬ分泌的蛋白量逐渐增加ꎬ在第７天达到最大ꎬ第８天不再增加ꎬ因此选择摇瓶发酵第７天为收获蛋白时间.镍柱磁珠纯化后的重组ＰｃＬＰＭＯ检测如图４ꎬ用１５０ｍｍｏｌ/Ｌ咪唑洗脱可得到较多的目的蛋白.考马斯亮蓝法测定纯化ＰｃＬＰＭＯ推算上清中的表达量为４５０ｍｇ/Ｌ.２.４㊀脱糖基化分析㊀ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳检测到重组ＰｃＬＰＭＯ条带大小在４６５０ｋＤ之间ꎬ比预计蛋白分子量要大ꎬ分析可能是翻译后糖基化修饰原因.以ＰｃＬＰＭＯ为底物ꎬ经ＥｎｄｏＨ脱Ｎ￣糖基化处理ꎬ处理前５６４㊀湖北大学学报(自然科学版)第４１卷后的目的物进行ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测ꎬ结果见图５ꎬ脱糖基化后蛋白条带约为３４ｋＤꎬ与理论大小相当ꎬ说明ＰｃＬＰＭＯ是发生了Ｎ糖基化修饰ꎬ糖分子量大小为约１２１６ｋＤ.图２㊀构建ｐＰＩＣＺαＡ￣Ｐｃｌｐｍｏ重组质粒的流程㊀㊀图３㊀甲醇诱导酵母阳性转化子不同时间表达产物的ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测０:阴性空载对照(含ｐＰＩＣＺαＡ)ꎻＭ:蛋白标准ꎻ１８:甲醇诱导后１８ｄ.㊀图４㊀ＰｃＬＰＭＯ镍柱纯化后ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测㊀１:纯化前ＰｃＬＰＭＯꎻ２８:分别用５０㊁１００㊁１５０㊁２００㊁２５０㊁３００㊁５００ｍｍｏｌ/Ｌ咪唑洗脱液㊀图５㊀ＰｃＬＰＭＯ蛋白脱糖基ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳分析Ｍ:蛋白质标准ꎻ１:纯化ＰｃＬＰＭＯꎻ２:ＥｎｄｏＨ对照ꎻ３:ＰｃＬＰＭＯ脱糖基化㊀表１㊀ＰｃＬＰＭＯ对其他底物的催化活性底物滤纸羧甲基纤维素钠碱预处理玉米秸秆纤维酶活性/(Ｕ/ｍＬ)９１５２４２.５㊀酶作用温度与ｐＨ㊀以微晶纤维素为底物ꎬ分析了重组ＰｃＬＰＭＯ的最适作用温度与ｐＨꎬ结果见图６ꎬ最适作用温度为６０ħꎬ最适ｐＨ为６.０.２.６㊀不同底物活性㊀重组ＰｃＬＰＭＯ对０.５％滤纸㊁０.５％羧甲基纤维素钠与０.５％碱预处理玉米秸秆纤维的酶活性如表１ꎬＰｃＬＰＭＯ对经碱预处理的秸秆纤维的酶活性最高ꎬ为２４Ｕ/ｍＬ.２.７㊀热稳定性分析㊀毕赤酵母为真核生物ꎬ对重组ＰｃＬＰＭＯ进行了翻译后糖基化修饰ꎬ而糖基化的形成对蛋白的热稳定性可起到促进作用.经高温预处理后热稳定性见图７ꎬＰｃＬＰＭＯ经８０㊁９０㊁１００ħ分别处理６０ｍｉｎꎬ剩余酶活为８０％㊁６２％㊁４８％(图７ａ)ꎻ而脱糖基ＰｃＬＰＭＯ在８０㊁９０㊁１００ħ分别处理２０ｍｉｎꎬ剩余酶活为５０％㊁３１％㊁１５％(图７ｂ).结果说明Ｎ￣糖基化可明显提高重组ＰｃＬＰＭＯ的耐热性ꎬ对酶的深入研究及应用具有重要意义.３㊀讨论毕赤酵母系统适合于很多种蛋白的异源表达ꎬＡＯＸ１启动子与基因密码子优化ꎬ对目的蛋白的分泌第６期姚昌阳ꎬ等:裂解多糖单加氧酶在毕赤酵母中的异源表达５６５㊀有较好的促进作用.ＬＰＭＯ在毕赤酵母中的异源表达也有报道ꎬ如朱红密孔菌ＰａＧＨ６１Ａ与ＰａＧＨ６１Ｂ在毕赤酵母Ｘ３３中异源表达ꎬ２Ｌ发酵罐条件下蛋白表达量分别为１５０ｍｇ/Ｌ与１ｇ/Ｌꎬ且两个重组蛋白都发生了糖基化修饰[８]ꎻ粗糙链孢菌ＬＰＭＯ￣０３３２８在毕赤酵母中蛋白表达量为４５ｍｇ/Ｌꎬ但产物未有糖基化修饰[１７]ꎻ密黏褶菌ＧＴＧＨ６１在毕赤酵母ＧＳ１１５中异源表达ꎬ但表达量未报道[１１]ꎻ里氏木霉Ｃｅｌ６１Ａ密码子优化后ꎬ在２Ｌ发酵罐中蛋白表达量为４００ｍｇ/Ｌꎬ且发生了糖基化修饰[１８]ꎻ拟盘多毛孢菌ＮＣｉ６的ＰｓＬＰＭＯＡ与ＰｓＬＰＭＯＢ经密码子优化ꎬ２Ｌ发酵罐下毕赤酵母重组表达量分别为８５ｍｇ/Ｌ与２６０ｍｇ/Ｌ[１９].本研究对黄孢原毛平革菌的ＬＰＭＯ进行优化后在毕赤酵母ＧＳ１１５中异源表达ꎬ摇瓶水平表达量为４５０ｍｇ/Ｌꎬ与目前异源表达的ＬＰＭＯｓ比较ꎬ处于比较高的水平.图６㊀重组ＬＰＭＯ的最适温度(ａ)与ｐＨ(ｂ)测试㊀图７㊀ＰｃＬＰＭＯ脱糖基化前后的热稳定性㊀毕赤酵母能够对表达的蛋白质进行翻译后加工ꎬ当蛋白质含有一致性序列Ａｓｎ￣Ｘａａ￣Ｔｈｒ/Ｓｅｒ(Ｘａａ表示任意氨基酸)时ꎬＡｓｎ残基上的酰胺氮可被毕赤酵母糖基化修饰[２０]ꎬ因ＰｃＬＰＭＯ含多处Ａｓｎ￣Ｘａａ￣Ｔｈｒ/Ｓｅｒ序列ꎬ则发生了高度糖基化修饰.重组ＰｃＬＰＭＯ在８０㊁９０㊁１００ħ分别处理６０ｍｉｎꎬ剩余酶活还有８０％㊁６２％㊁４８％ꎻ而去除Ｎ￣糖基化后酶在８０㊁９０㊁１００ħ分别处理２０ｍｉｎꎬ剩余酶活为５０％㊁３１％㊁１５％ꎬ说明Ｎ￣糖基化的形成能显著提高ＰｃＬＰＭＯ的热稳定性.类似报道如嗜热枯草芽孢杆菌β￣甘露聚糖酶在毕赤酵母中重组表达发生Ｎ￣糖基化ꎬ经１００ħ处理１０ｍｉｎꎬ剩余酶活仍达到５８.６％ꎻ脱糖基化后在９３ħ处理１０ｍｉｎ后ꎬ剩余酶活为５８.２％ꎬ１００ħ处理１０ｍｉｎ则完全失活[２１]ꎻ嗜热厌氧细菌Ｆ３２的ＧＨ１１家族木聚糖酶在毕赤酵母中糖基化修饰蛋白在８０ħ与８５ħ下ꎬ半衰期相对于原核表达未糖基化蛋白分别提高了约１.５与２倍[２２]ꎻ烟曲霉的木聚糖酶在毕赤酵母中糖基化修饰蛋白在７０ħ保温１ｈꎬ残留２５％活性ꎬ而去糖基化后残留７％活性[２３].以上结果说明蛋白质翻译后糖基化修饰可增强其在高温条件下的稳定性.４㊀结论本研究通过毕赤酵母密码子偏好性优化并合成了黄孢原毛平革菌ｌｐｍｏ基因ꎬ将基因连接到ｐＰＩＣＺαＡ表达载体上ꎻ构建好的重组质粒通过ＰｍｅＩ单酶切线性化ꎬ电激转化毕赤酵母ＧＳ１１５ꎬ阳性重组子经ＢＭＭＹ甲醇诱导后分泌表达了目的蛋白ＰｃＬＰＭＯꎬ表达量为４５０ｍｇ/Ｌ.ＰｃＰＬＭＯ对微晶纤维素㊁滤纸㊁羧甲基纤维素钠及碱预处理的秸秆纤维都表现出催化活性ꎬ其中对碱预处理的秸秆纤维活性最高ꎬ为２４Ｕ/ｍＬ.经ＥｎｄｏＨ脱糖基化分析ꎬＰｃＬＰＭＯ发生了高度糖基化修饰ꎬ促进了其较好的热稳定性ꎬ分别在８０㊁９０㊁１００ħ保温６０ｍｉｎꎬ剩余活性为８０％㊁６２％与４８％ꎻ而脱糖基ＰｃＬＰＭＯ在相同温度条件下分别处理２０ｍｉｎꎬ剩余酶活为５０％㊁３１％与１５％.５㊀参考文献[１]Ｖａａｊｅ￣ＫｏｌｓｔａｄＧꎬＷｅｓｔｅｒｅｎｇＢꎬＨｏｒｎＳＪꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｂｏｏｓｔｉｎｇｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ５６６㊀湖北大学学报(自然科学版)第４１卷ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１０ꎬ３３０(６００１):２１９￣２２２.[２]ＦｏｒｓｂｅｒｇＺꎬＶａａｊｅ￣ＫｏｌｓｔａｄＧꎬＷｅｓｔｅｒｅｎｇＢꎬｅｔａｌ.ＣｌｅａｖａｇｅｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅｂｙａＣＢＭ３３ｐｒｏｔｅｉｎ[Ｊ].ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１１ꎬ２０(９):１４７９￣１４８３.[３]ＦｏｒｓｂｅｒｇＺꎬＭａｃｋｅｎｚｉｅＡＫꎬＳøｒｌｉｅＭꎬｅｔａｌ.Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｐａｉｒｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ￣ｏｘｉｄｉｚｉｎｇｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ[Ｊ].ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡꎬ２０１４ꎬ１１１(２３):８４４６￣８４５１. [４]ＰｈｉｌｌｉｐｓＣＭꎬＢｅｅｓｏｎＷＴꎬＣａｔｅＪＨꎬｅｔａｌ.Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｎｄａｃｏｐｐｅｒ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｂｙＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ[Ｊ].ＡＣＳＣｈｅｍＢｉｏｌꎬ２０１１ꎬ６(１２):１３９９￣１４０６. [５]ＩｓａｋｓｅｎＴꎬＷｅｓｔｅｒｅｎｇＢꎬＡａｃｈｍａｎｎＦＬꎬｅｔａｌ.ＡＣ４￣ｏｘｉｄｉｚｉｎｇｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｃｌｅａｖｉｎｇｂｏｔｈｃｅｌｌｕｌｏｓｅａｎｄｃｅｌｌｏ￣ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ[Ｊ].ＪＢｉｏｌＣｈｅｍꎬ２０１４ꎬ２８９(５):２６３２￣２６４２.[６]ＨａｒｒｉｓＰＶꎬＷｅｌｎｅｒＤꎬＭｃＦａｒｌａｎｄＫＣꎬｅｔａｌ.Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｎｏｆｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃｂｉｏｍａｓｓｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｂｙｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｇｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｆａｍｉｌｙ６１:ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆａｌａｒｇｅꎬｅｎｉｇｍａｔｉｃｆａｍｉｌｙ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１０ꎬ４９(１５):３３０５￣３３１６. [７]ＦｏｒｓｂｅｒｇＺꎬＲｏｈｒＡＫꎬＭｅｋａｓｈａＳꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｆｔｗｏｃｈｉｔｉｎ￣ａｃｔｉｖｅａｎｄｔｗｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ￣ａｃｔｉｖｅＡＡ１０￣ｔｙｐｅｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１４ꎬ５３(１０):１６４７￣１６５６.[８]ＢｅｙＭꎬＺｈｏｕＳꎬＰｏｉｄｅｖｉｎＬꎬｅｔａｌ.Ｃｅｌｌｏ￣ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｒｅｖｅａｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ(ｆａｍｉｌｙＧＨ６１)ｆｒｏｍＰｏｄｏｓｐｏｒａａｎｓｅｒｉｎａ[Ｊ].ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌꎬ２０１３ꎬ７９(２):４８８￣４９６. [９]ＱｕｉｎｌａｎＲＪꎬＳｗｅｅｎｅｙＭＤꎬＬｏＬｅｇｇｉｏＬꎬｅｔａｌ.Ｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｖｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅｂｙａｃｏｐｐｅｒｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅｔｈａｔｅｘｐｌｏｉｔｓｂｉｏｍａｓｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ[Ｊ].ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡꎬ２０１１ꎬ１０８(３７):１５０７９￣１５０８４. [１０]ＦｒｏｍｍｈａｇｅｎＭꎬＳｆｏｒｚａＳꎬＷｅｓｔｐｈａｌＡＨꎬｅｔａｌ.ＤｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｃｌｅａｖａｇｅｏｆｐｌａｎｔｘｙｌａｎａｎｄｃｅｌｌｕｌｏｓｅｂｙａｎｅｗｆｕｎｇａｌｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＭｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｆｕｅｌｓꎬ２０１５ꎬ８:１０１.[１１]ＪｕｎｇＳꎬＳｏｎｇＹꎬＫｉｍＨＭꎬｅｔａｌ.Ｅｎｈａｎｃｅｄｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃｂｉｏｍａｓｓｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｂｙｏｘｉｄａｔｉｖｅｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ(ＬＰＭＯｓ)ＧＨ６１ｆｒｏｍＧｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍｔｒａｂｅｕｍ[Ｊ].ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂＴｅｃｈꎬ２０１５ꎬ７７:３８￣４５.[１２]Ｂｅｎｎａｔｉ￣ＧｒａｎｉｅｒＣꎬＧａｒａｊｏｖａＳꎬＣｈａｍｐｉｏｎＣꎬｅｔａｌ.ＳｕｂｓｔｒａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｏｆｆｕｎｇａｌＡＡ９ｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙＰｏｄｏｓｐｏｒａａｎｓｅｒｉｎａ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｆｕｅｌｓꎬ２０１５ꎬ８:９０.[１３]ＪａｇａｄｅｅｓｗａｒａｎＧꎬＧａｉｎｅｙＬꎬＰｒａｄｅＲꎬｅｔａｌ.ＡｆａｍｉｌｙｏｆＡＡ９ｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓｉｎＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓｉｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｓａｎｄａｔｌｅａｓｔｏｎｅｉｓａｃｔｉｖｅｏｎｃｅｌｌｕｌｏｓｅａｎｄｘｙｌｏｇｌｕｃａｎ[Ｊ].ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌꎬ２０１６ꎬ１００(１０):４５３５￣４５４７.[１４]ＰｉｅｒｃｅＢＣꎬＡｇｇｅｒＪＷꎬＺｈａｎｇＺꎬｅｔａｌ.Ａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｆｕｎｇａｌｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓｆｏｒｔｈｅｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅｉｎｓｏｙｂｅａｎｓｐｅｎｔflａｋｅｓ[Ｊ].ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１７ꎬ４４９:８５￣９４.[１５]ＷｅｓｔｅｒｅｎｇＢꎬＩｓｈｉｄａＴꎬＶａａｊｅ￣ＫｏｌｓｔａｄＧꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｐｕｔａｔｉｖｅｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅＰｃＧＨ６１ＤｆｒｏｍＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｉｓａｍｅｔａｌ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｔｈａｔｃｌｅａｖｅｓｃｅｌｌｕｌｏｓｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１１ꎬ６(１１):ｅ２７８０７.[１６]ＢｒａｄｆｏｒｄＭＭ.Ａｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｇｒａｍｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎ￣ｄｙｅｂｉｎｄｉｎｇ[Ｊ].ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍꎬ１９７６ꎬ７２:２４８￣２５４.[１７]ＫｉｔｔｌＲꎬＫｒａｃｈｅｒＤꎬＢｕｒｇｓｔａｌｌｅｒＤꎬｅｔａｌ.ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓｍｏｎｉｔｏｒｅｄｂｙａｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｆｕｅｌｓꎬ２０１２ꎬ５:７９.[１８]ＴａｎｇｈｅＭꎬＤａｎｎｅｅｌｓＢꎬＣａｍａｔｔａｒｉＡꎬｅｔａｌ.ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉＣｅｌ６１ＡｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ:ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｙｉｅｌｄａｎｄＮ￣ｔｅｒｍｉｎａｌｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ[Ｊ].ＭｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌꎬ２０１５ꎬ５７(１１￣１２):１０１０￣１０１７.[１９]ＰａｔｅｌＩꎬＫｒａｃｈｅｒＤꎬＭａＳꎬｅｔａｌ.Ｓａｌｔ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓｆｒｏｍｔｈｅｍａｎｇｒｏｖｅｆｕｎｇｕｓＰｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓｓｐ.ＮＣｉ６[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｆｕｅｌｓꎬ２０１６ꎬ９:１０８.[２０]ＮøｈｒＪꎬＫｒｉｓｔｉａｎｓｅｎＫꎬＫｒｏｇｓｄａｍＡＭ.Ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｙｅａｓｔｓ[Ｍ].ＴｏｔｏｗａꎬＮｅｗＪｅｒｓｅｙ:ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓꎬ２００３:１１１￣１２５.[２１]罗长财ꎬ缪静ꎬ李国莹ꎬ等.Ｎ￣糖基化对一种新型重组耐高温β￣甘露聚糖酶(ＲｅＴＭａｎ２６)稳定性的影响[Ｊ].微生物学通报ꎬｈｔｔｐｓ://ｄｏｉ.ｏｒｇ/１０.１３３４４/ｊ.ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.ｃｈｉｎａ.１８０１９２.[２２]王灵ꎬ韩文杰ꎬ孟冬冬ꎬ等.糖基化对Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒｓｐ.Ｆ３２中内切型木聚糖酶热稳定性的影响[Ｊ].生物技术ꎬ２０１６ꎬ２６(３):３００￣３０６.[２３]ＣｈａｎｇＸꎬＸｕＢꎬＢａｉＹꎬｅｔａｌ.ＲｏｌｅｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃＧＨ１０ｘｙｌａｎａｓｅｆｒｏｍＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１７ꎬ１２(２):ｅ０１７１１１１.(责任编辑㊀游俊)。