蛋白交联
蛋白交联(参考资料)
蛋白质交联方法及其应用蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。
随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的发展，蛋白质交联技术的方法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛的应用。
蛋白质交联方法首先发展于人工抗原的制备研究。
自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。
为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质连接的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。
近10多年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶—抗体偶合物。
常用的交联方法如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可避免地要产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使交联效率降低、结合物活性减弱。
为了克服这一不足，人们发展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯，以实现控制交联，提高交联反应的选择性和交联产物的均一性。
将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。
这是现代药物研究领域一个崭新的分支。
载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，因此要求设计pH敏感或特定酶敏感的偶联键。
导向药物的发展对蛋白质交联方法提出了更高的要求。
早在1906年，Ehrlich就提出了靶向给药的设想。
随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。
单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最引人注目的领域之一，而其中研究得最广泛的是肿瘤治疗的抗体导向研究。
交联质谱clms
交联质谱clms交联质谱（CLMS）是一种分析蛋白质交联状态的技术，利用化学手段将蛋白质分子中相邻的氨基酸残基与其他分子相互交联，从而形成交联产物。
这种技术具有高灵敏度、高精度和高通量等优点，成为生物医学科学研究的热门领域。
本文将从以下几个方面介绍CLMS技术。
1. 原理CLMS技术的核心原理是利用化学反应将氨基酸残基与其他分子相连，从而形成交联产物。
常用的化学交联试剂有二硫化物（如二氧化硫、氧化铜等）、交联剂（如二甲亚砜、环氧乙烷等）和N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）等。
这些试剂能够与蛋白质中的氨基酸残基（如半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸等）发生化学反应形成稳定的交联产物。
2. 应用CLMS技术的应用范围非常广泛，主要用于研究蛋白质交联状态、复合物组成、结构等。
在药物研发、生物医学研究、食品安全检测等领域都有重要的应用。
如在药物研发中可以用CLMS技术分析药物与受体之间的交联关系，以此了解药物的作用机制；在食品安全检测中可以用CLMS技术检测食品中的蛋白质交联状态，从而判断是否存在添加非法物质等。
3. 优势CLMS技术相比传统的分析方法具有以下几个优势：（1）灵敏度高：CLMS技术能够检测蛋白质分子中微弱的交联信号。
（2）精度高：CLMS技术能够对蛋白质分子中的各种交联关系进行准确的定量和定位。
（3）通量高：CLMS技术能够同时分析大量样品，从而提高分析效率和速度。
4. 行业前景随着生物医学科学的发展，CLMS技术在药物研发、蛋白质组学、代谢组学等领域的应用越来越广泛。
未来，CLMS技术将会得到更广泛的应用和推广，并在生物医学科学中发挥更重要的作用。
总之，交联质谱（CLMS）作为一种新兴的分析技术，具有广泛的应用前景和发展空间。
我们相信，在生物医学科学的推动下，它将不断发展壮大，为人类健康和生命科学研究做出更大的贡献。
蛋白质连接技术资料讲解
马来酰亚胺基类活泼酯法：
蛋白质 伯氨基
连接分子 巯基
SPDP试剂法：异型双功能交联剂N-羟基琥珀亚胺基-3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯(SPDP)
蛋白质
连接分子
伯氨基
巯基、氨基
苯丁酸氮芥衍生物法：
蛋白质 伯氨基
连接分子 氨基
卤代乙酰衍生物法：
连接基团：氨基、巯基
双马来酰亚胺试剂法：
蛋白质 伯氨基
连接分子 羟基
亚胺酸酯法：
蛋白质 伯氨基
连接分子 氨基
卤代硝基苯法：
蛋白质 氨基、羟基、巯基
连接分子 氨基、羟基、巯基
Mannich反应法：
蛋白质 伯氨基
连接分子 酮、酚类苯Βιβλιοθήκη 法：蛋白质 氨基、羟基、巯基
连接分子 氨基、羟基、巯基
E11man试剂法：
E11man试剂即5．5’—二硫—2，2’—双硝基苯甲酸(DTNB)，该试剂可以与巯基作用
蛋白质连接技术
蛋白质交联系指将小分子物质（如 药物、半抗原等）或大分子物质 (如酶、蛋白毒素等)以共价键的方 式连接于蛋白质分子，以制备人工 抗原、酶标抗体、载体释放药物、 抗体导向药物和免疫毒素等。
交联方法
游离氨基 游离羧基 苯基 酚基 巯基 羟基 咪唑基 吲哚基 胍基
重氮化法：
蛋白质 酚羟基的邻位、咪唑环、吲哚环
连接两个巯基
三氯三嗪试剂法：
蛋白质 伯氨基
连接分子 羟基
必须注意，第一个分子中不能含有氨基及巯基等亲核性较 强的基团，否则，易形成自身聚合
连接分子 含芳香胺的化合物
副反应多，故一般限于人工抗原的制备
戊二醛法：连接两个伯胺
最温和的交联反应之一，可在4~40℃温度范围，pH6.0~8.0 的缓冲水溶液中进行，但是缓冲组份中不得含有氨基化合 物，本交联方法易形成相同蛋白间的连接；产物的均二性 较差。因此，多用于酶标抗体的制备。
生化交联实验报告结果
一、实验目的本实验旨在探究蛋白质之间的交联反应，通过使用交联剂使蛋白质分子之间形成共价键，从而改变蛋白质的结构和功能。
本实验以牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）为研究对象，通过观察交联前后蛋白质的沉淀现象、电泳迁移率变化以及生物学活性变化，来分析交联反应对蛋白质的影响。
二、实验材料1. 牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）2. 交联剂：戊二醛3. 0.1 mol/L PBS缓冲液（pH 7.4）4. 10% SDS-PAGE凝胶5. 电泳装置6. 染色剂：考马斯亮蓝R-2507. 蛋白质定量试剂盒8. 生物活性检测试剂盒三、实验方法1. 准备BSA和OVA溶液，分别加入0.1 mol/L PBS缓冲液（pH 7.4）至终浓度为1 mg/mL。
2. 将BSA和OVA溶液按照1:1的比例混合，加入0.1 mol/L PBS缓冲液（pH 7.4）至终浓度为0.5 mg/mL。
3. 在混合溶液中加入适量戊二醛，使戊二醛浓度为0.5%。
4. 将混合溶液在室温下反应2小时。
5. 将反应后的溶液用0.1 mol/L PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤3次，去除未反应的戊二醛。
6. 取一定量的反应后溶液进行SDS-PAGE电泳分析，比较交联前后蛋白质的迁移率变化。
7. 取一定量的反应后溶液进行蛋白质定量分析，比较交联前后蛋白质含量的变化。
8. 取一定量的反应后溶液进行生物活性检测，比较交联前后蛋白质的生物学活性变化。
四、实验结果1. 沉淀现象：交联前后，BSA和OVA溶液均出现沉淀现象，但交联后的沉淀量明显多于交联前。
2. 电泳迁移率变化：交联前后，BSA和OVA的迁移率发生了明显变化。
交联后，蛋白质的迁移率变慢，表明蛋白质发生了交联。
3. 蛋白质含量变化：交联前后，BSA和OVA的蛋白质含量无明显差异。
4. 生物活性变化：交联前后，BSA和OVA的生物活性发生了明显变化。
交联后，蛋白质的生物活性降低。
DNA-蛋白质交联的研究进展
DNA-蛋白质交联的研究进展DNA-蛋白质交联是一种重要的生物化学过程，它在细胞内发挥着关键的作用。
DNA-蛋白质交联是指DNA分子和蛋白质之间的相互作用，它能够调控基因的表达、维持染色体结构、参与DNA修复和复制等多种生物学过程。
近年来，科学家们对DNA-蛋白质交联的研究取得了令人瞩目的进展，不仅揭示了其在细胞生物学中的重要作用，还为人类疾病的治疗和诊断提供了新的思路。
本文将从DNA-蛋白质交联的定义、机制、生物学功能和研究进展等方面进行介绍和探讨。
一、DNA-蛋白质交联的定义和机制DNA-蛋白质交联是指DNA分子与蛋白质之间通过共价或非共价键结合的现象。
在细胞内，DNA-蛋白质交联是通过蛋白质与DNA双螺旋结构上的特定序列、特定结构区域相互结合而形成的。
蛋白质在不同的生物学过程中与DNA结合的方式有所不同，主要包括非特异性结合和特异性结合两种机制。
非特异性结合是指蛋白质与DNA上的任何位点都可以相互结合，通常是通过电荷间相互作用、疏水作用等方式实现的。
这种结合方式在染色体的包装中起到了重要的作用，如组蛋白与DNA的结合就是通过非特异性结合实现的。
DNA-蛋白质交联的形成是通过蛋白质的结构域（如DNA结合结构域、螺旋转录因子结构域、锌指结构域等）与DNA上的特定序列或特定结构区域之间的相互作用实现的，这种相互作用对于调控基因的表达、维持染色体的结构和稳定性、参与DNA修复和复制等生物学过程具有重要的意义。
对于DNA-蛋白质交联的研究不仅有助于深入理解细胞生物学过程，还对人类疾病的治疗和诊断具有潜在的应用价值。
DNA-蛋白质交联在细胞生物学过程中发挥着多种重要的生物学功能，主要包括以下几个方面：1. 调控基因的表达DNA-蛋白质交联通过调控基因的转录、剪接和翻译等环节，参与调控基因的表达。
许多转录因子与DNA结合后能够激活或抑制某些基因的转录，从而对基因的表达进行调控。
2. 维持染色体的结构和稳定性DNA-蛋白质交联通过调控染色体的组装和结构，维持染色体的稳定性和整体结构。
蛋白交联
蛋白质交联方法及其应用蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。
随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的发展，蛋白质交联技术的方法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛的应用。
蛋白质交联方法首先发展于人工抗原的制备研究。
自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。
为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人近10常—3—(2(一)重氮化法?含芳香胺的化合物，可以与亚硝酸反应形成重氮盐，然后直接连接于蛋白质分子中酪氨酸残基上酚羟基的邻位，即得以偶氮键相联的结合物。
这种重氮盐也能与组氨酸残基上的咪唑环或色氨酸残基的吲哚环反应：氏碱：(四)混合酸酐法?半抗原或药物及其衍生物分子中的羧基可以在三级胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，生成活泼中间体混合酸酐，然后与蛋白载体上的伯氨基反应，形成酰胺交联键：本反应过程简单，毋需制备和分离中间产物。
(五)碳二亚胺法?碳二亚胺是一类很强的脱水剂，能使羧基和氨基脱水形成酰胺键。
在反应时，一种分子中的羧基先与碳二亚胺反应生成一个加成中间产物，再与另一分子上的氨基反应形成酰胺键，实现两者的交联：除戊二醛外，碳二亚胺是常见的另一类交联剂，最早用于药物化学和有机化学领域；脂溶性的二环己基碳二亚胺至今仍被广泛用于多肽合成领域，但其反应必须在有机溶剂中进行，不适用于蛋白质交联。
水溶性的1—乙基—3—(3—二甲基氨基丙基)—碳二亚胺(EDC)等的出现，使这一缩合反应成功地用于蛋白质交联中。
本交联反应条件温和即使在冷却条件下，也能于中性pH中进行。
交联法蛋白相互作用
交联法蛋白相互作用交联法是一种用于研究蛋白质相互作用的常用方法。
它可以帮助我们了解生物体内蛋白质的互动方式，提供设计新药物和疾病治疗策略的基础。
交联法的原理是通过共价化学交联两个或多个蛋白质，使它们在实验过程中处于固定的位置。
在本文中，我们将详细介绍交联法的原理、应用以及未来的发展方向。
交联法的核心原理是使用一个交联剂（cross-linking reagent）与蛋白质中的自由氨基酸残基（例如赖氨酸、苯丙氨酸等）发生反应，形成共价的连接。
交联剂可以是任何具有双功能的分子，例如含有两个活性酯或酰胺基团的化合物。
交联剂与蛋白质中的氨基酸反应后会形成可逆的、稳定的化学键，使蛋白质相互连接形成一个复合物。
在实验中，交联剂一般是以过量的量加入到反应体系中，以增加交联的效率。
交联法可以使用多种手段来实现，包括化学交联、光交联和酶促交联。
化学交联是最常用的方法，它通常使用含有活性酯或酰胺基团的交联剂。
光交联是利用紫外光照射交联剂，使其产生活性自由基，与蛋白质中的氨基酸发生反应。
酶促交联则是通过酶的作用，将交联剂与蛋白质连接在一起。
交联法的主要应用之一是确定蛋白质的互作结构。
通过交联法，研究人员可以确定蛋白质中靠近的残基，进而推断出蛋白质的空间构象和相互作用方式。
这对于了解蛋白质功能以及蛋白质与其他生物分子的相互作用具有重要意义。
交联法还可以帮助鉴定蛋白质复合物的组成成员，以及分析复合物的稳定性和动态变化。
除了确定蛋白质结构和相互作用，交联法还可以用于研究蛋白质的功能。
例如，交联法可以用于研究酶的催化机制、蛋白质复合物的功能以及信号转导通路的调控机制。
通过交联法，研究人员可以将关键的残基固定在特定的位置，从而改变蛋白质的功能或者破坏其功能。
尽管交联法已经在蛋白质研究中取得了巨大的成功，但仍然存在一些挑战和限制。
首先，交联剂的选择非常重要，需要考虑其反应性、稳定性以及对蛋白质结构的影响。
其次，交联法在分析复杂蛋白质体系时存在一定的困难，例如高分子量蛋白质复合物和跨膜蛋白质。
蛋白质交联度计算公式
蛋白质交联度计算公式
蛋白质交联度是指蛋白质分子中交联键的数量和密度。
它是一种衡量蛋白质结构的重要指标，可以用来评估蛋白质的稳定性和功能。
计算蛋白质交联度的公式如下：
交联度 = (交联键的数量 / 蛋白质分子中氨基酸的数量) × 100%
交联键的数量可以通过实验方法确定，例如使用质谱法或核磁共振法。
这些方法可以检测到分子中交联键的存在和数量。
蛋白质分子中氨基酸的数量可以通过蛋白质序列分析得到，每种氨基酸的数量加起来就是蛋白质分子中氨基酸的总数。
通过上述公式可以计算出蛋白质的交联度。
交联度的数值越高，表示蛋白质分子中交联键的数量越多，蛋白质的结构越稳定。
蛋白质交联度的计算对于研究蛋白质的结构和功能具有重要意义。
通过比较不同蛋白质的交联度，可以了解它们的结构差异和功能差异。
此外，交联度的变化还可以用于评估蛋白质的稳定性，判断蛋白质在不同环境条件下的抗变性能力。
蛋白质交联度计算公式是一种重要的工具，可以帮助研究人员了解蛋白质的结构和功能。
通过实验方法确定交联键的数量，再结合蛋白质序列分析得到氨基酸的数量，就可以计算出蛋白质的交联度。
这个指标对于研究蛋白质的结构和功能具有重要意义，可以用于评估蛋白质的稳定性和抗变性能力。
蛋白交联质谱
蛋白交联质谱蛋白质交联是一种重要的生物化学现象，它在维持细胞结构和功能方面起着重要的作用。
蛋白质交联是指两个或更多蛋白质分子之间以共价键连接的过程。
这种连接可以通过天然交联剂、酶催化或化学反应来实现。
蛋白质交联可以产生具有不同结构和功能的大分子复合物，从而扩大蛋白质的功能范围。
质谱是一种常用的蛋白质分析方法，可以用来研究蛋白质的化学性质、结构和功能。
质谱分析中的一个重要应用是用于鉴定和定量分析蛋白质交联产物。
蛋白质交联产物的质谱分析可以提供关于交联位点、交联结构和交联数量的信息。
这对于理解蛋白质交联的机制和功能具有重要意义。
蛋白质交联产物的质谱分析通常是在两个方面进行的：交联位点的鉴定和交联产物的结构分析。
交联位点的鉴定是通过质谱分析中的肽酶消化和段选择性酶消化来确定。
肽酶消化可以将交联产物水解为小肽片段，然后通过质谱分析鉴定这些片段的氨基酸序列，从而确定交联位点。
交联产物的结构分析是通过质谱分析中的碎片离子诱导解离（CID）和中性损失（NL）扫描进行的。
在CID扫描中，通过碎片离子的相互作用，可以得到交联产物的碎片离子，从而确定其结构。
在NL扫描中，通过测量中性分子的丢失，可以分析交联产物的结构和组成。
质谱分析中常用的方法是质子转移反应器（PTRMS）。
PTRMS是一种基于质谱的分析方法，可以对气态和溶液中的物质进行分析。
PTRMS的原理是通过质子转移反应，将待测物质中的质子质量化，并进行质谱分析。
PTRMS可以用于分析蛋白质交联产物的结构和组成。
蛋白质交联质谱是一种复杂的分析方法，需要综合使用多种技术和仪器来完成。
这包括对样品的制备、质谱分析仪器的选择和参数的调整等。
蛋白质交联质谱的分析结果对于研究蛋白质交联的机制和功能、发现新的靶标和药物靶点等具有重要意义。
总的来说，蛋白质交联质谱是一种重要的蛋白质分析方法，可以提供关于交联位点、交联结构和交联数量的信息。
蛋白质交联质谱的分析结果对于解析蛋白质交联的机制和功能具有重要意义。
蛋白质交联度计算公式
蛋白质交联度计算公式
蛋白质的交联度是指蛋白质分子中交联的程度，通常用于描述
蛋白质的结构和稳定性。
蛋白质的交联度可以通过以下公式进行计算：
交联度（%）=（交联点数/蛋白质分子中的氨基酸总数）×100%。
其中，交联点数是指蛋白质分子中的交联连接数，氨基酸总数
是指蛋白质分子中的所有氨基酸的总数。
通过这个公式，我们可以
计算出蛋白质的交联度百分比，从而了解蛋白质分子中交联的程度。
需要注意的是，蛋白质的交联度计算是一个相对复杂的过程，
需要对蛋白质的结构和交联方式有深入的了解。
同时，在实际应用中，还需要考虑到实验条件、交联试剂的选择等因素对交联度的影响。
因此，在进行蛋白质交联度计算时，需要结合具体的实验设计
和实验结果进行综合分析。
总的来说，蛋白质的交联度计算公式可以作为一个基本的参考，但在实际应用中需要结合具体情况进行综合考量。
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蛋白质交联方法及其应用蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。
随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的发展，蛋白质交联技术的方法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛的应用。
蛋白质交联方法首先发展于人工抗原的制备研究。
自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。
为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质连接的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。
近10多年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶—抗体偶合物。
常用的交联方法如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可避免地要产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使交联效率降低、结合物活性减弱。
为了克服这一不足，人们发展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯，以实现控制交联，提高交联反应的选择性和交联产物的均一性。
将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。
这是现代药物研究领域一个崭新的分支。
载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，因此要求设计pH敏感或特定酶敏感的偶联键。
导向药物的发展对蛋白质交联方法提出了更高的要求。
早在1906年，Ehrlich就提出了靶向给药的设想。
随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。
单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最引人注目的领域之一，而其中研究得最广泛的是肿瘤治疗的抗体导向研究。
其载体主要有针对肿瘤细胞表面相关抗原的抗体及其片断，肿瘤细胞表面受体的模拟配基。
这些载体与药物或毒素分子连接而成的偶合物，能够选择性地杀伤肿瘤细胞，被誉为“生物导弹”。
为了最大限度地保持导向载体和药物弹头的生物活性，同时实现最大的药物载运量，人们不断创新交联剂，改进交联方法，发展了一批新的各具特性的异型双功能交联剂，提高了导向药物的有效性和实用性。
随着新的交联试剂和交联方法的出现，使得放射免疫、酶标免疫和导向药物的研究不断深入；而后者的发展又反过来促进蛋白交联技术趋于成熟。
目前的交联方法可以将任一个半抗原或细胞毒分子以一定方式与载体交联，获得所需的偶合物。
下面分别介绍蛋白质交联中常用的试剂、方法及其应用。
一、交联方法一般说来，蛋白分子中可以用于交联的活性基团有游离氨基(如赖氨酸的c—氨基或末端氨基)、游离羧基(如天冬氨酸残基，谷氨酸残基及末端羧基)、苯基(苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)、酚基(酪氨酸)、巯基(半胱氨酸)、羟基(丝氨酸或苏氨酸)、咪唑基(组氨酸)、吲哚基(色氨酸)或胍基(精氨酸)等。
为了避免蛋白质变性及其生物活性的损失，药物或半抗原等与蛋白的交联应采用具有中等反应活性的试剂，在温和的条件(如接近中性的pH、室温、水溶液中)进行。
(一)重氮化法含芳香胺的化合物，可以与亚硝酸反应形成重氮盐，然后直接连接于蛋白质分子中酪氨酸残基上酚羟基的邻位，即得以偶氮键相联的结合物。
这种重氮盐也能与组氨酸残基上的咪唑环或色氨酸残基的吲哚环反应：本方法副反应较多，故一般限于人工抗原的制备。
(二)戊二醛法同型双功能交联剂戊二醛的两个醛基可以分别与两个相同或不同分子上的伯氨基形成Schiff氏碱，将两分子以五碳链的桥连接起来。
戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一，可在4~40℃温度范围，pH6.0~8.0的缓冲水溶液中进行，但是缓冲组份中不得含有氨基化合物。
以硼氢化钠或氰基硼氢化还原Schiff氏碱可以形成稳定的单键；根据对偶联键的不同要求，还原步骤也可省略。
但是，本交联方法易形成相同蛋白间的连接；产物的均二性较差。
因此，多用于酶标抗体的制备。
(三)过碘酸盐氧化法[1]糖类或含糖基化合物分子中的邻二醇结构可被过碘酸钠氧化为醛基，然后与蛋白分子中的氨基形成Schiff氏碱：与戊二醛的交联反应相似，过碘酸钠氧化法比较温和，可在常温和中性pH的条件下进行。
这是一个两步反应，第一步生成醛基衍生物后，过量的过碘酸盐必须除去或消耗后，方可进行与蛋白交联的第二步反应。
(四)混合酸酐法半抗原或药物及其衍生物分子中的羧基可以在三级胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，生成活泼中间体混合酸酐，然后与蛋白载体上的伯氨基反应，形成酰胺交联键：本反应过程简单，毋需制备和分离中间产物。
(五)碳二亚胺法碳二亚胺是一类很强的脱水剂，能使羧基和氨基脱水形成酰胺键。
在反应时，一种分子中的羧基先与碳二亚胺反应生成一个加成中间产物，再与另一分子上的氨基反应形成酰胺键，实现两者的交联：除戊二醛外，碳二亚胺是常见的另一类交联剂，最早用于药物化学和有机化学领域；脂溶性的二环己基碳二亚胺至今仍被广泛用于多肽合成领域，但其反应必须在有机溶剂中进行，不适用于蛋白质交联。
水溶性的1—乙基—3—(3—二甲基氨基丙基)—碳二亚胺(EDC)等的出现，使这一缩合反应成功地用于蛋白质交联中。
本交联反应条件温和即使在冷却条件下，也能于中性pH中进行。
但是，由于碳二亚胺的缩合反应没有选择性；易形成蛋白分子间的自身聚合，产生非均一性产物；先将含羧基的药物或半抗原分子与EDC反应，活化羧基后，再加入蛋白反应物，可以减少蛋白分子交联。
(六)活泼酯法[2]含有羧基的半抗原或药物在二环己基碳二亚胺(DCC)的作用下，与N—羟基琥珀酰亚胺反应，生成活泼酯衍生物，后者与载体蛋白上的氨基反应，形成以酰胺键连接的偶合物：本法是对碳二亚胺法的改进：由于避免了碳二亚胺对蛋白的直接作用，从而避免了蛋白分子间的交联。
活泼酯法在导向药物的研究中得到广泛的应用。
(七)多元酸酐法[3]半抗原或药物分子中的羟基或氨基与琥珀酸酐、顺—乌头酸酐等在无水吡啶催化下反应，形成单酯或单酰胺衍生物，引入游离羧基，然后以活泼酯法或碳二亚胺法与蛋白交联：多元酸酐法可以十分方便地将小分子中的羟基或氨基转变为合游离羟基的衍生物，具有较广的应用范围。
但是，与羟基形成的酯健在血浆中不稳定；而与氨基形成的酰胺键又往往不能充分降解；释放游离药物，影响导向药物的效价。
有趣的是，药物通过顾—乌头酸与蛋白形成的偶合物，在中性pH介质(如血浆中)稳定，而在酸性pH介质中充分解离，释放活性药物。
由此产生的溶酶体内降解性复合物，经细胞内化后，进入溶酶体内，在酸性条件下解离。
(八)二异氰酸酯法二异氰酸酯类双功能试剂中的两个异氰酸基分别与两个不同分子上的氨基反应，介以不同碳链长度的桥将两者偶联：这类试剂除了能与氨基反应形成取代脲外，(在pH＞7时为主要反应)，尚能与羟基反应形成氨基甲酸酯衍生物；水溶液中的副反应(如第二个异氰酸酯基水解产生的胺，能与另一异氰酸酯分子连接)，可能通过疏水作用导致蛋白的聚合。
(九)偶氮苯甲酸法对氨基苯甲酸重氮化后，与带苯环的半抗原偶联引入羧基，再利用羧基的反应连接于蛋白上：(十)O—羧甲基羟胺法半抗原上的酮基与O—羧甲基羟胺反应，制备羧甲基肟衍生物。
引入的羧基再与载体蛋白的氨基反应，形成半抗原—蛋白偶合物：(十一)对-肼基苯甲酸法带酮基的半抗原也可以与对—肼基苯甲酸反应，引入羧基，再按常法与载体蛋白交联；(十二)．叠氮化法[4]羧酸甲酯衍生物经肼解、亚硝化，转变为叠氯化物，再与载体蛋白上的氨基反应：(十三)氯乙酸钠法半抗原的羟基与氯乙酸钠反应，形成羧甲基醚衍生物，再通过羧基与蛋白交联：(十四)亚胺酸酯法双功能试剂亚胺酸酯类如丙双亚胺酸二乙酯双盐酸盐可以与半抗原和载体蛋白的氨基交联，中间介以一个三碳桥：亚氨酸酯类水溶性良好，反应条件温和，与氨基的反应选择性高，这类试剂的最大特点是，可与蛋白分子上的赖氨酸残基广泛反应，而不影响蛋白分子的净电荷改变。
具有不同碳链长度的亚氨酸酯可将半抗原间以一定距离与蛋白连接。
(十五)卤代硝基苯法双功能试剂二硝基二氟苯或二氟二硝基苯砜分子中的氟原于，由于邻近硝基的活化作用，易和半抗原或载体蛋白上的亲核基团如氨基、羟基、巯基等反应：(十六)Mannich反应法酮、酚类半抗原，可以用Mannich反应引入羧基，然后与常法与蛋白交联；(十七)苯醌法交联过程分两步进行，第—步反应完成后，分离除去过量试剂，再进行第二步反应。
(十八)E11man试剂法[5]E11man试剂即5．5’—二硫—2，2’—双硝基苯甲酸(DTNB)，该试剂可以与巯基作用，交联反应分两步进行：本法用于游离巯基的保护和活化，以便与游离巯基的另一蛋白分子进行巯基交换反应。
(十九)马来酰亚胺基类活泼酯法马来酰亚胺基结构中的双键比较活泼，可与游离巯基进行选择性加成反应。
马来酰亚胺基取代羧酸衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺酯试剂与含氨基的药物或蛋白反应，引入马来酰亚胺基，与另—含有游离巯基的分子通过巯基对双键的加成反应连接起来。
这是一组异型双功能交联剂，常用的有N—羟基琥珀酰亚胺基—间—(N—马来酰亚胺基)-苯甲酸酯（SMB），N—羟基琥珀酰亚胺—4—(N—马来酰亚胺基) -苯丁酸酯（SMPB）等。
(二十)SPDP试剂法[6]异型双功能交联剂N-羟基琥珀亚胺基-3—(2-吡啶基二硫)—丙酸酯(SPDP)可以通过其分子中的活泼酯组份与氨基反应，也可以通过2—吡啶二硫基团与脂肪硫醇反应.SPDP能够于蛋白分子中引入巯基，然后利用巯基交换反应或巯基加成反应与另一分子交联：这是目前较为常用的一种交联剂，交联反应条件温和，副反应较少，能够定量地于蛋白分子中引入保护的巯基，且能够方便地测定其含量。
同类的交联剂尚有N—羟基琥珀酰亚胺—(4—a—甲基—a—(2—吡啶基—二硫代甲基)—苯甲酸酯(SMPT)[7]和N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2—毗啶二硫)—丁酸酯(SPDBt[8])。
通过在二硫键的a—位引入位阻性基团如甲基，可以增加交联物中二硫键的稳定性。
(二十一)苯丁酸氮芥衍生物法[9]苯丁酸氮芥的N—羟基琥珀酰亚胺基酯或混合酸酐衍生物分子中的活性羧基和氮芥基可以分别与两个蛋白分子中的氨基反应，将两者连接起来：在中性及微碱性pH条件下,氮芥基倾向于与巯基反应，而在较高pH时倾向于与氨基反应。
(二十二)卤代乙酰衍生物法卤代乙酸的活泼酯衍生物如N—羟基琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯分子中的活泼酯成分和α—位活泼卤素可以分别与蛋白分子中的巯基及氨基反应，实现两种分子的交联：本交联反应迅速，具有较高选择性，形成的硫醚键在血浆中十分稳定。