实验方案(双歧杆菌的分离)

1 双歧杆菌的分离

1.1 样品

取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。

1.2 培养基

根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。

1.2.1 缓冲蛋白胨水溶液（BP）

成份：蛋白胨10g 磷酸氢二钠2g

葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g

氯化钠5g 蒸馏水1000ml

制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121℃，杀菌15min后置4℃的冰箱中备用。

1.2.2 选择性改良NPNL培养基（苏世彦）

成份：酵母膏5g 淀粉0.5g

蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g

胰蛋白胨5g 溶液A 10ml

大豆蛋白胨5g 溶液B 5ml

葡萄糖10g 溶液C 50ml

乳糖3g 琼脂 15g

吐温80 1g pH 7.2

牛肝提取液150ml

制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121℃杀菌10min，备用。

溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g溶于蒸馏水100ml。

溶液B：FeSO4·7H2O 0.2g、MgSO4·7H2O 4g、MnSO4·4H2O 0.135g、NaCl 0.2g溶于蒸馏水100ml。

溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。

1.2.3 NPNL培养基(孙雪)

培养基成分及用量：牛肉浸汁粉(oxoid)3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，

植胨3g，酵母浸出汁5g，肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml，溶液B 5ml，吐温80 1g，盐酸半胱氨酸0.5g，琼脂15g，蒸馏水815ml，X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖苷)60mg。pH 7.2，121℃，15min 高压灭菌。

溶液A：K2HPO425g，KH2PO425g，蒸馏水250ml。

溶液B：MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，MnSO40.337g，蒸馏水250ml，硫酸新霉素100μg/ml，硫酸巴龙霉素200μg/ml，萘啶酮酸15μg/ml，氯化锂3mg/ml。

1.3 分离方法

取成年人的粪便1g，放人含有9ml缓冲蛋白胨水溶液中，用液枪充分混匀，制成1:10的稀释液，摇匀后取1ml注人含有9ml缓冲蛋白胨溶液中制成1:100的稀释液，在此基础上作10-3~10-9与的稀释，由于肠道中双歧杆菌的菌数一般在109左右，所以取10-4~10-9稀释液用倾注法倒平板，每个稀释液都各取1ml分别注人到两只无菌平皿中，每个稀释度重复3个平板。待培养基凝固后倒置，将温度调至37℃进行厌氧培养48h。用缓冲蛋白胨水溶液做稀释液可以有效地保护双歧杆菌的存活，避免受外界环境因素的影响。

1.4 分离培养

在加人样品稀释液的平皿中，分别注人适量冷却至50℃左右的选择性改良NPNL培养基，然后放人37℃的恒温培养箱中厌氧培养1.4.1 培养特性与镜检特性

双歧杆菌在改良NPNL培养基上，经过厌氧培养以后，菌落直径1-2cm，圆形、凸起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，粘稠湿润。经革兰氏染色后镜检，双歧杆菌为革兰氏阳性无芽抱杆菌，呈多形性、典型的双歧杆菌为V字型或Y型；也有直、弯、棒状、匙形等多种形态，排列成单、双、短链、X、Y、V 或栅状；其大小为2-8×0.4-0.6μm，不具英膜和鞭毛，无运动性。

培养48h 后，平板上菌落呈现深蓝色、白色、浅蓝色三种颜色。

见图1。将深蓝色菌落革兰氏染色后镜检，大部分菌体呈染色不均匀、分叉形状，符合双歧杆菌的基本的形态特征。见图2。

图1 菌落形态及颜色图2 分离出的双歧杆菌

讨论

311双歧杆菌为专性厌气菌, 标本采集后要避免暴露于空气中, 尽可能快地带回实验室, 不要冷冻, 不要使用富集培养基或转移培养基。尽快用稀释液作适当稀释后接种于合适的培养基中, 置于适宜的厌氧条件下培养。

312每次标本检测需用标准菌株接种相同批次的培养基,并在同一厌氧罐中进行厌氧培养, 以检测培养基的质量和厌氧环境, 以保证每次检测结果的可靠性。

313培养基添加剂不宜在4℃保存时间太长, 时间太长抗生素效价下降, 抑制其他细菌作用降低, 不利于双歧杆菌的选择, 每次新鲜配制为好。

314双歧杆菌和乳酸菌均含有半乳糖苷酶, 我们在自制改良BS培养基[1]中加入52溴242氯232吲哚2B2D2半乳糖苷(X2Gal)作为底物, 半乳糖苷酶可分解底物, 释放出吲哚。由于双歧杆菌的半乳糖苷酶活性比乳酸菌以及其他细菌高, 吲哚释放的数量不同, 使双歧杆菌与乳酸菌和其他细菌菌落呈现不同深浅的颜色, 培养基平板上双歧杆菌菌落呈深蓝色, 其他细菌一般为白色或淡蓝色[2]。长双歧杆菌半乳糖苷酶在Mn2+的条件下可被少量激活, 因而在双歧杆菌培养基中应加入适量的硫酸锰。据报道25种双歧杆菌90%以上对半乳糖呈阳性反应[3], 因此该培养基能对双歧杆菌进行较好的选择。

315我们自制的改良BS培养基除具有双歧杆菌生长必需的营养物质、维生素、微量元素外, 还添加了双歧杆菌生长因子“吡福多素”(异麦芽寡糖), 双歧杆菌在此培养基上能较好生长, 其他细菌受到抑制; 双歧杆菌在此培养基上形成的菌落的形态、大小与BL培养基上形成的菌落的形态、大小无多大差别, 而颜色易与其他细菌区别。因此该培养基是大便双歧杆菌计数较好的选择性培养基。

另外有文献报道，作为缓冲体系的磷酸盐不利于菌株的冷冻保藏，限制了菌体在后期的应用效果。NPNL中高浓度的无机盐对人体具有潜在的危险，不适于大规模使用。其中的L-半胱氨酸盐酸盐灭菌后产生不良气味，也不利于应用于食品中。对上述限制NPNL工业化应用的成分进行替换或剔除。（长双歧杆菌BBMN68工业化培养基筛选）