与氮素同化相关酶及测定方法
硝酸还原酶(NR)检测
硝酸还原酶（NR）检测
硝酸还原酶（Nitrate reductase, NR）属于氧化还原酶，是植物氮素同化过程中的关键酶，分布于细胞质内或细胞膜外，可催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，并与亚硝酸还原酶以偶联调节的形式对氮代谢进行调节，在初级氮同化的控制中起着重要作用。
测定原理：硝酸还原酶可催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3-+NADH+H+→ NO2-+NAD++H2O，NADH在340nm处有特征吸收峰，通过340nm处吸光度的变化即可表征硝酸还原酶活力。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测硝酸还原酶活性变化。
此外，我们还提供其他氮代谢类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定硝酸还原酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 硝酸还原酶活性信息。
硝酸还原酶的测定
硝酸还原酶的测定一、实验目的和要求掌握体内法测定植物组织中硝酸还原酶的原理和方法，阐明诱导酶的含义。
2、实验内容与原则硝酸还原酶（nr）是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。
它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：--产生的NO2可以从组织渗透到外部溶液中，并在溶液中累积。
NO2含量的增加表明酶的活性增加。
装no2含量的测定用磺胺比色法。
在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对c氨基苯磺酸（或对c氨基苯磺酰-订线（胺）反应生成重氮，然后与αC萘胺（或萘基乙二胺）反应生成紫红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm波长处有最大吸收峰，可通过分光光度法测定。
溶液中NO2-的含量可用标准曲线测定。
3、主要仪器设备1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。
2、实验试剂0.1mol/lph7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液3.两组大麦幼苗在15-25℃的蒸馏水中培养一周。
一组用硝酸钾治疗，另一组用氯化铵治疗。
四、操作方法和实验步骤1.切两组新鲜叶片。
一组为0.51g处理苗，另一组为0.50g对照苗。
将叶片分别切成0.5~1cm的碎片并压实。
2、两组中各加入15ml的酶促反应液。
3.真空提取10min，充分交换细胞内外液。
4.盖上盖子，在30℃的培养箱中保存20分钟。
5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。
6、比色：在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的od值。
7.空白管：4ml H2O+2ml磺酰胺溶液+2ml萘乙二胺溶液？在室温下放置15分钟后，在540nm处用分光光度法测定亚硝酸的OD值。
五、实验数据记录和处理称重：处理过的幼苗0.51g；对照苗0.50god值：处理苗0.513a；对照苗0.050aNO2含量标准曲线：y=257.29x-4.8262（x=OD值；y=NO2含量（nmol））。
植物硝酸还原酶(NR)活力测定(活体法)
植物硝酸还原酶（NR）活力测定（活体法）一、原理硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以Nμg·g-1·h-1为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好二、仪器与用具分光光度计；真空抽气泵（或20ml注射器筒）；天平；单面刀片；保温箱（或恒温水浴）；刻度试管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。
三、试剂1. 亚硝酸钠标准液称取分析纯NaNO2 0.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀释定容至1000ml，即为每ml含NaNO2 5μg（亚硝态氮近似1μg/ml）的标准液。
2. 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液：K2HPO4 19.24g，KH2PO4 2.2g，加水溶解后定容至1000ml。
3. 1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液：称取10.0g加入250ml浓HCl中，用蒸馏水定容至1000ml。
4. 0.2%（W/V）α-萘胺溶液：称取2.0gα-萘胺溶于250ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至1000ml。
5. 30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
6. KNO3（0.1mol/L）、异丙醇（1% V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称10.10g KNO3溶于1000ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加10ml异丙醇混匀。
四、方法1. 标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0-2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]:硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以-1-1ug.g.h为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 2422422.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml;-13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL);(0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，4贮于棕色瓶中;-1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO，0.0570g 24.2KHOP.3HO，溶于1 000ml去离子水中; 2427( 30%三氯乙酸溶液:30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法];1. 标准曲线制作:管号 1 2 3 4 5 6 7亚硝酸钠标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 试剂蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 (ml) 1%磺胺 4 4 4 4 4 4 40.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4每管含亚硝态氮(ug) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
硝酸还原酶活性测定方法
硝酸还原酶活性的测定一．试验原理：硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键酶，与作物吸收和利用硝态氮的能力相关。
它催化NO3－还原为NO2－的反应：NO3－+NADH+H+→NO2－+NAD++H2O反应产生的NO2－可从组织内渗透到外界溶液中，定时测定一定的反应溶液中NO2－含量的变化情况则可了解此酶的活性大小。
NO2－的定量测定是用磺胺比色法。
此法简单易行而又非常灵敏，可测出0.5微克/ml NaNO2含量的变化。
二．试剂：磷酸缓冲液（Na2HPO4.12H2O NaH2PO4.2H2O） KNO3溶液磺胺试剂α－萘胺试剂 NaNO2标准溶液1. 0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O 30.0905g与NaH2PO4.2H2O2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml；2. 0.2 mol/L KNO3：称取 KNO3 20.22 g，用蒸馏水溶解，移入100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。
3.磺胺（对氨基苯磺酸胺）试剂：1克磺胺溶于25毫升浓盐酸后再用蒸馏水稀释至100 ml 。
4.α－萘胺试剂：0.2克α萘胺溶于25 ml 浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100 ml 。
5.NaNO2标准溶液：1克NaNO2溶于1000ml 蒸馏水中配成NaNO2母液。
实验时按处理稀释成要求浓度。
如1微克/ ml ：取母液1ml ，用蒸馏水稀释成1000 ml 。
三．仪器721型分光光度计真空泵保温箱天平真空干燥器打孔器三角瓶移液管烧杯四．试验步骤1．将新鲜取回的材料叶片用水清洗后用吸水纸吸干水份。
用打孔器取下直径为1厘米的圆片，再用蒸馏水洗2－3次，将蒸馏水吸干。
在天平上称取等重的叶子园片两份：每份0.4克左右（或每份取50个圆片）。
将两份圆片分别置于下列两种溶液中，容器使用50ml 三角瓶。
（1）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +蒸馏水5 ml 。
（2）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +0.2 M KNO3溶液5 ml 。
硝酸还原酶的测定方法
硝酸还原酶的测定方法硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。
红色的偶氮染料。
反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。
增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。
这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。
仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。
0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml 蒸馏水器中。
磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水器稀释至100ml。
α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水器中，稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水器溶解成1000ml。
然后吸取5ml，再加稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。
操作步骤 1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。
然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。
将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测 3. ．绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。
植物生理学实验考试试题 (1)
植物生理学实验考试试题一、名词解释：1、标准曲线：用标准溶液制成的曲线。
先配制一系列不同浓度的标准溶液, 在溶液吸收最大波长下, 逐一测定吸光度,然后用坐标纸以溶液浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标作图, 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律, 必然得到一条通过原点的直线, 即标准曲线。
4、氮素代谢：氮素及含氮的活体物质的同化异化和排泄，总称为氮素代谢。
5、淀粉酶：是水解淀粉和糖原的酶类总称。
6、真空渗入：指将叶片打孔放入注射器中，加水浸没，排出空气后用手指堵住前端小孔，同时把活塞向外抽拉，即可造成减压而排出组织中的空气，轻放活塞，水液即进入组织的方法。
7、离心技术：是根据物质颗粒在一个离心场中的沉降行为而发展起来的。
它是分离细胞器和生物分子大分子物质必备的手段之一，也是测定某些纯品物质的部分性质的一种方法。
8、电泳：各种生物大分子在一定pH 条件下，可以解离成带电荷的颗粒，这种带电颗粒在电场的作用下向相反电极移动的现象称为电泳。
9、同工酶：凡能催化同一种化学反应但其分子结构和带电性质不同的一组酶称为同工酶10、迁移率：指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。
11、聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。
20、超氧化物歧化酶（SOD）：普遍存在动植物体内的一种清除超氧阴离子自由基Ｏ2 的酶。
21、硝酸还原还原酶：是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸。
22、诱导酶：又称适应酶，指植物体内本来不含有，但在特定外来物质的诱导下诱导生成的酶。
如硝酸还原酶可为NO3-所诱导生成。
二、填空：1、测定植物可溶性蛋白质含量时，绘制标准曲线是标准蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标。
2、常用的测定植物可溶性蛋白质含量的方法有：Folin-酚试剂法(Lowry 法) 、双缩脲法、考马斯亮蓝法和紫外吸收法。
硝酸还原酶活性的测定.
硝酸还原酶活性的测定一、原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2NO3⎯+NADH+H→NO2⎯+NAD+H2O产生的NO2⎯可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2⎯的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2⎯含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。
分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。
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NADH
COOH │ CHNH2 │ CH2 │ CH2 │ CONH2
铁氧还蛋白 COOH
│ C=O │ CH2 │ CH2 │ COOH
2H+，2e—
NH3
NADH
谷氨酰胺 合成酶Biblioteka 谷 氨 酰 胺谷氨酸合成酶
谷氨酸 脱氢酶 COOH │ CHNH2 │ CH2 │ CH2 转氨基 │ 含氮化 COOH
②谷草转氨基作用
谷丙转氨酶 CH 3 （ GPT） 磷酸吡 哆醛
COOH CH2 + CH C=O 2 H-C-NH2 COOH COOH
COOH COOH CH2 CH2 H-C-NH2 + CH2 C=O COOH COOH
谷草转氨酶 COOH （ GOT） CH 2 磷酸吡 C=O 哆醛 COOH
粗酶液制备 取1g水稻根/叶，置于冰浴的研钵中，加入少量石 英砂和3ml提取缓冲液（100mmol/L TrisHCl(pH7.6)含1.0mmol/L EDTA， 1.0mmol/LMgCl2· 6H2O，10mmol/L β-琉基乙醇）于 4℃研磨成匀浆。混合均匀后于高速冷冻离心机4℃ 、20,000g离心20min（13，000g 30min），收集上 清，即为粗酶提取液，置于-80℃冰箱中冻存，待 测。粗酶液用于Gs、NADH-GOGATH的活力测定 。
工作曲线 即可查得丙酮酸体积 (ml),若查得的丙酮酸体积超过 0.2ml时应将酶粗制液稀释 后再进行测定 , 测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积 V(ml) 。工作曲线绘制 : 取 10ml 试管 6 支 , 各管加 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 0.1ml, 分别加 GPT 底物液 0.5 、 0.45 、 0.40 、 0.35 、 0.30 、 0.25ml, 丙酮酸标准液 0( 对照管 ) 、 0.05 、 0.10 、 0.15 、 0.20 、 0.25ml。置37℃水浴中 5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混匀, 再置37℃水浴 中 20min, 取出后各管加 0.4mol/L 氢氧化钠溶液 5ml, 混匀 ,10min 后同上比色 , 读取各 管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度 ,以各管丙酮酸体积为横座标 ,以相 应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。 (四)结果计算 转氨酶活度以每克植物鲜样在30min内反应生成的丙酮酸微摩尔(μmol)表示。 GOT活度,μmol/g·30min=(C×V×20)/(m×2) GPT活度,μmol/g·30min=(C×V×20)/(m×2) 式中 ,C— 丙酮酸标准溶液的浓度 (μmol/ml);V— 由工作曲线查得的丙酮酸体积 (ml);20— 稀释倍数 ;2— 反应时间换算系数 ,GOT 实际反应时间为 1h, 按习惯本法酶 活性以30min计算〔4〕,故应除以2;m—植物鲜重(g)
无机态： NO3-－N、NH4+－N （主要） 吸收的形态 有机态：NH2 －N、氨基酸、 核酸等 （少量）
（一）植物对硝态氮的吸收与同化
1. 吸收：旱地作物吸收NO3-－N为主，主动吸收
2. 同化
(1) NO3-－N的还原作用(nitrate reduction)
过程：
NO3-
NR，Mo
根、叶细胞质
第二类，尿素 < AA效果 < 硫酸铵：如天门冬氨酸等
第三类，效果 < 尿素：如脯氨酸、缬氨酸等
第四类，有抑制作用：如蛋氨酸
植物转氨酶(GOT和GPT)活度比色测定方法及其应及GOGAT酶活 性的测定 主要试剂 (1)0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.2):0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷 (24.2g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至200ml)50ml和 0.2mol/L HCl44.2ml,用蒸馏水稀释至200ml。 (2)0.1mol/L磷酸盐缓冲液:称取磷酸氢二钠 (AR)11.928g,磷酸二氢钾 (AR)2.176g,加少量蒸馏水溶解并定容至1000ml。 (3)2,4-二硝基苯肼溶液:称取2,4-二硝基苯肼19.8mg,用10mol/L HCL10ml溶解后,加蒸馏水至100ml,保存于棕色瓶中备用,此液可保存 3个月。 (4)0.4mol/L氢氧化钠溶液:16g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至 1000ml。
2谷氨酸
谷氨酸＋17酮酸
17种氨基酸
合成
蛋白质
转氨基作用（transamination）
（1）定义：是指一种α -氨基酸和α -酮酸在转氨酶的作 用下生成相应的α-酮酸和新的氨基酸的过程。
谷丙转氨基作用 （2）生物体内两种重要的转氨基作用 谷草转氨基作用
①谷丙转氨基作用
COOH CH3 CH2 H C NH2 + CH2 C=O COOH COOH
1· 酶粗制剂的提取 将 新 鲜 植 物 材 料 剪 碎 , 取 鲜 重 0.2g 左 右 放 入 研 钵 , 加 0.05mol/LTris-HCl 缓冲液 (pH7.2)2.0ml, 在冰浴中研磨 , 得到 的匀浆用高速离心机 20000×g离心20min,上清液供测酶活 度用。 2· 谷草转氨酶(GOT)活度测定 取 10ml 试管 2 支 , 一支作测定管 , 分别加酶粗制剂 0.1ml 和 GOT底物液0.5ml,另一支作对照管,仅加酶粗制剂0.1ml。将 二管同时置 37℃水浴 ,60min 后取出 , 各管加 2,4 二硝基苯肼 液0.5ml终止反应,对照管再加GOT底物液0.5ml。将二管再 置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L NaOH 5.0ml,混 匀 ,10min 后用分光光度计比色 , 波长 500nm, 蒸馏水调零点 , 读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度 , 得吸光 度差值,查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml)。若查得的丙 酮酸体积超过 0.2ml 时应将酶粗制液稀释后再进行测定 ,测 定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(ml)。
NO2-
NiR，Fe、Mn
根、叶绿体
NH3
NR：硝酸还原酶(nitrate reductase) NiR：亚硝酸还原酶(nitrite reductase)
氨的同化
植物吸收铵盐以后，或当植物所吸收的硝酸盐被 还原成氨后，氨必须立即被同化成氨基酸，否则就会 毒害植物。因为氨可能抑制呼吸过程中的电子传递系 统。 氨的同化方式为：进入谷氨酸合成酶循环。
(1) 吸收：根、叶均能直接吸收
(2) 同化：
脲酶 水解
①脲酶途径：尿素
NH3
瓜氨酸
氨基酸
②非脲酶途径：直接同化 尿素 氨甲酰磷酸 精氨酸
尿素的毒害：当介质中尿素浓度过高时，植物 会出现受害症状
2. 氨基态氮(amino nitrogen)
可直接吸收，效果因种类而异
第一类 效果 > 硫酸铵：如甘氨酸、天门冬酰胺等
提取液配置：（Tris，121.14；EDTA，372.24；MgCl2· 6H2O，203.3 ；β-琉基乙醇原液14.4mol/L） 1L提取液的配置：12.114g Tris+0.3722g EDTA+0.2033g MgCl2· 6H2O 用900ml水溶解，+0.7mlβ-琉基乙醇原液后，用1mmol/L HCl调pH值 至7.6，然后定容至1L。 500ml提取液的配置：6.057g Tris+0.1861g EDTA+0.1016g MgCl2· 6H2O用450ml水溶解，+0.35ml β-琉基乙醇原液后，用 1mmol/L HCl（原液稀释12000倍,83ul定容至100ml）调pH值至7.6 ，然后定容至500ml。
ATP
NH3 NH4+吸收 NO3—还原 N2固定 光呼吸
COOH │ CHNH 2 │ CH2 │ CH2 │ COOH 谷氨酸
合物 作用 谷氨酸
图1 氨的同化途径的模式
反应式：
NH3＋谷氨酸＋ATP
谷氨酰胺合成酶
谷氨酰胺＋ADP＋Pi
谷氨酸合成酶
谷氨酰胺＋α -酮戊二酸＋2e－＋2H＋ 转氨酶
与氮素同化相关酶及测定方法
自 然 界 中 N 素 循 环
一、植物体内氮的含量与分布
含量：占植物干重的0.3～5％。
植物种类：豆科植物>非豆科植物 品种：高产品种>低产品种 器官：种子>叶>根>茎秆
二、氮的生理功能
1. 氮是蛋白质的重要成分（蛋白质含氮16～18％）
2. 氮是核酸和核蛋白的成分（核酸中的氮约占植 株全氮的7％） 3. 氮是酶的成分
4.氮是叶绿素（叶绿素a:C55H72O5N4Mg)的成分 （叶绿体含蛋白质45～60％）
5. 氮是多种维生素的成分:如维生素B1 (C12H17ON3S)、B2 (C17H18O6N4 )、B6(C6H11O3N)
6. 氮是一些植物激素的成分（如IAA、CTK） 7. 氮也是生物碱的组分（如烟碱、茶碱、可可 碱、咖啡碱、胆碱－－卵磷脂(磷脂酰胆碱）
(5)1mol/L氢氧化钠溶液:40g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至 1000ml。 (6)丙酮酸标准液(2μmol/ml):精确称取纯丙酮酸钠22.0mg于100ml容 量瓶中,加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至刻度。此液应新鲜配制。 (7)GOT底物液(DL-门冬氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L): 称取α-酮戊二酸29.2mg和DL-门冬氨酸2.66g置于一小烧杯中,加入 1mol/L氢氧化钠20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后将溶液移入100ml 容量瓶内,用0.1mol/L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。 (8)GPT底物液:(DL-丙氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L): 称取α-酮戊二酸29.2mg和DL-丙氨酸1.79g置于一小烧杯中,加入 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)约80ml煮沸溶解后,待冷,用1mol/L氢氧 化钠调pH至7.4(约加0.5ml),再加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至100ml混匀, 加氯仿数滴防腐,贮于冰箱内。