植物生理指标检测方法

植物组织中可溶性糖含量的测定在作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。

它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。

由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。

Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。

在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。

但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。

此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。

糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。

二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物鲜样或干样。

（二）试剂1. 80 ％乙醇。

2. 葡萄糖标准溶液（100 μg/mL ）：准确称取100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 μg/mL ）。

3 ．蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 ～ 3 周。

（三）仪器设备分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（ 5 、 1 、0.5 mL ），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。

三、实验步骤1. 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5 ～ 1.0 g （或干样粉末 5 ～100 mg ），放入大试管中，加入15 mL 蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min ，取出冷却，过滤入100 mL 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。

2. 标准曲线制作取 6 支大试管，从 0 ～ 5 分别编号，按表 24-1 加入各试剂。

表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10 min ，取出冷却，在620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ μg ）为横坐标绘制标准曲线。

3 ．样品测定取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ，同以上操作显色测定光密度。

重复 3 次。

四、结果计算溶性糖含量（％）＝从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100式中： C ——从标准曲线查得葡萄糖量， μg 。

V T ——样品提取液总体积 , mL 。

V 1 ——显色时取样品液量， mL 。

W ——样品重（ g ）。

植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。

在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位/mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。

因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。

常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。

本实验将分别介绍这两种方法。

1．考马斯亮蓝法一、实验原理考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465 nm，后者在595 nm。

在一定蛋白质浓度范围内（0-100 μg/mL），蛋白质－色素结合物在595 nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。

故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1 h内保持稳定。

该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

二、实验材料、仪器和试剂1.材料小麦叶片或其他植物组织2.仪器设备分光光度计，离心机，研钵，25 mL容量瓶1个，刻度吸管0.5 mL 2支，2 mL 1支，10 mL 试管3支。

3.试剂(1)牛血清白蛋白配成1000 μg/mL和100 μg/mL。

(2)考马斯亮蓝G-250：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容至1000 mL。

此溶液在常温下可放置一个月。

(3)90%乙醇(4)磷酸（85%，W/V）三、实验步骤：1.可溶性蛋白的提取称取新鲜植物叶片0.5 g置于研钵中，加入5 mL 4o C下预冷的浓度为50 mmol/L，pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10 mL离心管中，在4 o C冰箱中静置10 min，于15000 rpm/min下冷冻离心25 min，上清液即为过氧化物粗提液。

4 o C下保存备用。

2.标准曲线的绘制(1)0-100 μg/mL标准曲线的制作取6支试管，按下表数据配制0-100 μg/mL 血清白蛋白液各1 mL 。

准确吸取所配各管溶液0.1 mL ，分别放入10 mL 具塞试管中，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2 min 后，在595 nm 下比色，绘制标准曲线。

配制0-100 μg/mL 血清白蛋白液管号1 2 3 4 5 6 100 μg/mL 牛血清蛋白量(mL) 蒸馏水量(mL) 蛋白质含量(mg)0 1.0 00.2 0.8 0.020.4 0.6 0.040.6 0.4 0.060.8 0.2 0.081.0 0 0.10(2) 0-1000 μg/mL 标准曲线的制作另取6支试管，按表10-2数据配制0-1000 μg/mL 牛血清白蛋白溶液各1 mL 。

与步骤（1）操作相同，绘出0-1000 μg/mL 的标准曲线。

配制0-1000 μg/mL 血清蛋白血液管号7 8 9 10 11 12 1000 μg/mL 牛血清白蛋白（mL ） 蒸馏水量(mL) 蛋白质含量(mg)0 1.0 00.2 0.8 0.20.4 0.6 0.40.6 0.4 0.60.8 0.2 0.81.0 0 1.03. 样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1 mL （样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5 mL 考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min 后在595 nm 下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。

四、 结果计算与分析样品蛋白质含量（mg/g 鲜重）=式中 C －查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg ）；V －提取液总体积（mL ）；a －测定所取提取液体积（mL ）； W －取样量（g ）。

叶绿素测定方法1、 称取剪碎叶片0.2g ，放入容量瓶。

2、 加50ml 95%的乙醇。

3、 遮光浸提48-72小时，中间摇晃一次。

（保证各批次浸提时间一致）4、 分光光度计测吸光值，三波长（649，665，470），分别对应叶绿素a 、b 和其他。

空白为95%乙醇。

总叶绿素含量为三者之和。

一般叶绿素a/b 为3：1至4：1选择的波长不一样，计算公式就不一样，网上也有其他的波长方法，计算公式里的系数响应也有差异。

WaV C淀粉含量的测定原理淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，测定葡萄糖含量，根据葡萄糖含量换算成淀粉含量(C6H12O6 )n→ ( C6H10O5) n + nH2O糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。

在625 nm 波长下的OD值与糖含量成正比。

由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色仪器用具和试剂1.仪器用具：移液枪、10ml离心管、试管、50ml容量瓶、试管架、棕色瓶（>=500ml）、螺口瓶（>=500ml）、烧杯、移液管（连续加样器）、离心机、分光光度计；2.试剂：葡萄糖标准液Ⅰ：精确称取0.1000g蔗糖（分析纯），于小烧杯中加水溶解，定容至100ml，加2-3滴浓H2S04，该溶液可长期保存；葡萄糖标准液Ⅱ:准确吸取1mg/ml的蔗糖标准液5ml，加水定容量50ml，得到浓度为0.1mg/ml蔗糖标准液；蒽酮溶液：100mg蒽酮溶于50ml浓H2S04（化学纯）中，避光保存，当天配制当天使用；3mol/L NaOH溶液：12g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；3mol/L Hcl溶液：25ml浓盐酸与75ml蒸馏水混匀。

测定方法1.植物淀粉相关溶液的提取：向测可溶性糖所剩残渣中加入7ml3mol/L的盐酸，在沸水浴中煮沸45分钟，取出冷却，4000转/分离心15分钟，取上清到50ml容量瓶中，加入7ml 3mol/L NaOH，用蒸馏水定容到50ml，作为待测样品。

3.准确吸取待测液1.0ml，加蒽酮4.0ml，在45℃水浴中显色10-15分钟，各管在加入蒽酮试剂时要迅速，加完后用力振荡混匀。

4.取出后避光冷却，在 625 nm处测OD值，从标准曲线上得到提取液中可溶性总糖含量。

结果计算葡萄糖糖含量（%）=标准曲线对应含糖量×定容体积×100／（样品质量×显色吸取液体积×103）粗淀粉含量（%）=葡萄糖含量×0.9强酸溶液，注意安全超氧化物歧化酶(SOD)的测定一、实验原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，EC 1.15.1.1)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基O2·ˉ，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm处有最大吸收。