鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验
一.试验目的
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
二.试验步骤
1.根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）,将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟, 然后制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
2.取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管各加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
3.将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。
三.结果分析
1.将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或形成凝胶但倒转180°后从管壁滑脱者为阴性。
2.若最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。
计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc），计算方法见中国药典。
3.反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性
结果的浓度。
4.当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
四.注意事项
1.保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
2.安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。
QC-7129B鲎试剂灵敏度复核操作规程
正文规范鲎试剂灵敏度复核的操作过程和要求，确保鲎试剂灵敏度复核结果的可靠性。
适用于质监处药理室对鲎试剂灵敏度的复核。
质监处药理室分析人员负责本规程的实施和完成相关记录。
USP版附录85；CP版附录Ⅺ E 。
细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。
鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。
细菌内毒素检查用水(BET水)：系指与灵敏度为0.03EU/ml 或更高灵敏度的鲎试剂在37 1 C 条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
细菌内毒素标准品：USP细菌内毒素参考标准品(RSE)或已标定的细菌内毒素工作标准品(CSE)。
反应终点浓度：是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈现阳性结果的浓度。
一、试剂、材料与仪器设备试剂：鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。
细菌内毒素检查用水(BET水) 批号、规格、生产商。
细菌内毒素标准品批号、效价、生产商。
材料及仪器设备：电热恒温水箱型号、设备编号。
电热鼓风干燥箱型号、设备编号。
漩涡混合器型号。
无热原试管规格：1075mm。
正文无热原玻璃瓶规格：25ml。
无热原玻璃吸管规格：1ml、2ml、5ml、10ml。
试管架、无热原封口膜、洗耳球、酒精棉球、砂轮片。
二、试验准备试验所用的容器、用具都必须经过处理，250C以上干烤至少1小时，以去除外源性内毒素。
试验操作过程应避免微生物的污染。
三、内毒素溶液配制细菌内毒素标准品系列溶液配制取RSE或CSE 1瓶，按照使用说明书加入规定量的细菌内毒素检查用水使溶，并用漩涡混合器间歇混匀30分钟，然后用细菌内毒素检查用水进一步稀释至2.0、、 0.5、 0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每一步稀释应混匀至少30秒钟。
鲎试剂灵敏度复核记录
文件名称File Name Record of Review for LimulusReagent SensitivityFile NumberREC-SOP-C003059-01-02生效日期Effective Date 2018-10-18有效期至Expiry Date2021-10-17审批及颁发/APPROV AL & ISSUANCE部门签名日期起草质量控制部审核质量控制部质量保证部批准质量负责人颁发质量保证部会审/COLLECTIVE REVIEW部门签名日期部门签名日期/ / /分发/DISTRIBUTIONCopy-1 Copy-2/质量保证部质量控制部/文件名称File Name Record of Review for LimulusReagent SensitivityFile NumberREC-SOP-C003059-01-02生效日期Effective Date 2018-10-18有效期至Expiry Date2021-10-17变更历史/CHANGES版本号修改简述提出人生效日期01 由原文件RE-C003060《鲎试剂灵敏度复核记录》变更而来；文件编码改变。
魏永红2017-06-0102 增加所使用仪器及试剂的信息汪华2018-10-18 附：记录样张REC-SOP-C003059-01-02鲎试剂灵敏度复核记录Record of Review for Limulus Reagent Sensitivity 起草人/日期审核人/日期批准人/日期执行日期2018-10-18 制订依据SOP-C003059 《细菌内毒素检查法标准操作规程》1 试剂鲎试剂批号：；规格： ml×支；生产厂家：□湛江安度斯生物有限公司；□福州新北生化工业有限公司；细菌内毒素检查用水批号：；规格： ml×支；内毒素含量： EU/ml；生产厂家：□湛江安度斯生物有限公司；□福州新北生化工业有限公司；细菌内毒素标准品批号：；规格：支/盒；效价：______EU/支；生产厂家：□中国药品生物制品检定所；□；2 仪器试管恒温仪型号：TAL-40D 编号：□QC-187 □QC-216 □QC-2173 操作根据鲎试剂灵敏度标示值（λ）将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混匀15分钟，然后制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液。
US-QR-24-025(A01)鲎试剂灵敏度复核记录
江阴贝瑞森生化技术有限公司编号：US-QR-24-025版次：A/01
鲎试剂灵敏度复核记录
被复核物料复核时间
项目
生产厂家规格批号
试剂
内毒素工作标准品
细菌内毒素检查用水
标示灵敏度λ
灵敏度复核结果
内毒素标准品浓度
0.5 0.25 0.125 0.0625 Nc 反应终点浓度
（Eu/ml）
内毒素标准溶液
平行组
注：表中“+”代表样品凝集，为阳性；“—”表示样品不凝集，为阴性
标准λc在0.5λ～2λ范围内，以标示灵敏度λ为该批鲎试剂灵敏度。
结果由＝lg-1（∑X／4）（式中X为反应终点浓度的对数值（lg）），计算的到λc为 EU/ml 备注
检验人：复核人：。
凝胶法检查技术
=0.210EU/ml 即本批号鲎试剂的复核灵敏度（λc）为0.210EU/ml 结论：本批鲎试剂的灵敏度标示值符合规定。
25
何时需做这个试验呢？
1或2会、、内影使试毒响用验素检新条标验批件准结号有品果的任的鲎何改试可变剂能
数据处理： 灵敏度测定值λc=antilg（ΣX/n） X：为反应终点浓度的对数值（lg） 鲎试剂灵敏度标示值λ有效：2λ≥λ c≥0.5λ
15
反应终点浓度是系 列浓度递减的内毒 素浓度中最后一个 呈阳性结果的浓度
灵敏度复核试验举例
• 试剂
试剂名称
厂家
规格
标示效价
数量
鲎试剂
安度斯
0.1ml/支 (1.25ml/支)
鲎试剂的选 择
加样及反应
反应溶液的 制备
MVD的计 算
结果判断
32
(五）干扰试验
• 干扰试验通常分为两个阶段：
干扰初筛试验-初步筛选出供试品无干扰浓度
范围和鲎试剂灵敏度范围；-非药典要求！
干扰试验
33
(五）干扰试验
• 经常接到用户的咨询电话，样品日常检查需要 选择什么灵敏度的鲎试剂来检测？例如：
• 结果判断
试验有效条件：溶液D：（- -）；溶液C：（+ +）； 无抑制干扰：溶液A：（- -）；溶液B：（+ +）
39
举例：苦参素原料药干扰初筛试验
• （1）供试品限值
– 企业内控标准：＜0.2EU/mg
40
（2）试剂
试剂名称
厂家
规格
标示效价 数量
鲎试剂灵敏度对检测结果判断的影响
田 市 药 品检验所 )
内毒
1 99 5 年 版收载 0 《中 国 药 典 》
.
9
% 氯化 钠 注 射 液 进 行 细
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素 浓 度 只 要 达 到 该 阀值 时 其 与 鳖 试 剂 的 混 合物就 能 生 成 坚
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菌 内 毒 素 检查 规 定 每
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菌 内毒 素 不得 过
海 峡 药学
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1 99 7
年
第
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卷
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期
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有 效率分 别 为 9 7
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批号
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2 。 赏 试剂 灵 敏度 复核结果 1
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体会
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大 飞扬 草 为 大 戟 科大 戟 属 植物 飞 扬 草
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堂试 剂灵敏 度对 检 测结 果判断 的影 响
吴 文光
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细 菌 内毒素检查
。
一 种 限度检 查 是 对 供 试 品 中 内毒素 的 限 量是 否 符合 规 定 的 卢剑 辉 根 据 赏 试剂与 内毒素产 生 凝集 反 应 的机 理 赏 试 剂 的 灵敏度 定 义 为每 批 赏 试剂与内毒素混 合 物在 规 定 条件 下 刚能 生 成 坚 实凝 胶 的 最低 内毒 素浓度 也 就是 说 在 规定条 件 下
鲎试剂
光度测定法：显色基质法
• 利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出 的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。 终点显色法：依据反应混合物中内毒素浓度 和其在孵育终止时释放出的有色团 的量之间存在着量化关系来测定内毒 素含量的方法。 动态显色法：是检测反应混合物的色度到达某 一预先设定的吸光度所需要的反应时 间，或是检测色度增长速度的方法。
光度测定法：检査法
• 按“光度测定法的干扰试验” 中的操作步骤进行检测。 • 使用系列溶液C 生成的标准曲线来计算溶液A 的每一个平行管的 内毒素浓度。 • 试验必须符合以下三个条件方为有效： (1 )系列溶液C 的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求； (2 )用溶液B 中的内毒素浓度减去溶液A 中的内毒素浓度后，计算 出的内毒素的回收率要在50%〜200%的范围内； (3) 阴性对照的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大 于标准曲线最低点的反应时间。
凝胶法:凝胶半定量试验
• 本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中 内毒素的含量。按表3 制备溶液A 、B、C 和D。按鲎 试剂灵敏度复核试验项下操作。 结果判断：若阴性对照溶液D 的平行管均为阴性，供 试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性，系列溶 液C的反应终点浓度的几何平均值在0 .5〜2ƛ， 试验有效。系列溶液A 中每一系列的终点稀释倍 数乘以ƛ，为每个系列的反应终点浓度。如果检 验的是经稀释的供试品，则将终点浓度乘以供试 品进行半定量试验的初始稀释倍数，即得到 每一系列内毒素浓度c。
鲎试剂
• 鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含 有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够 准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和(1,3)-β-葡聚糖. • 普通鲎试剂 灵敏度0.5～0.125EU/ml，适用于仅需要检测内毒素限量的样品。 高灵敏度鲎试剂 灵敏度0.06～0.015 EU/ml，适用于内毒素限量较低的样品 细菌内毒素检查。 特异性鲎试剂 灵敏度0.5～0.015EU/ml，适用于成分较为复杂，会对鲎试剂 产生干扰的样品。 定量法鲎试剂 最低检测限0.03～0.005 EU/ml，适用于需要对内毒素进行定 量测定的样品。
细菌内毒素验证
2
鲎试剂灵敏度复核试验
• 根据鲎试剂灵敏度的标示值（ λ ），将细菌内毒素工作标准品加入1ml内毒素检查 用水溶解，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后按所用的鲎 试剂灵敏度2λ、λ、0.5λ、0.25λ进行稀释。0.1ml鲎试剂+ 0.1ml标准品，平行4管； NC： 0.1ml鲎试剂+ 0.1mlBET用水，平行2管37℃±1℃孵育60min±2min。
8
干扰试验结果举例
例1、批号1——厂家1鲎试剂试验结果
2λ（ 2λ ） 1λ（ 1λ ） 0.5λ（ 0.5λ ） 0.25λ（ 0.25λ ）
阴性对照 -
+ + + + + +
+ + + + + +
- - -
- - -
2、批号1——厂家2鲎试剂试验结果
2λ（ 2λ ） 1λ（ 1λ ） 0.5λ（ 0.5λ ） 0.25λ（ 0.25λ ）
4
干扰试验预试验
• 结果一 供试品浓度 MVC0.25 MVC0.125 MVC0.06 MVC0.03 BET水
供试品溶液
供试品阳性 对照 • 结果二
-++
-++
-++
-++
-++
供试品无干扰或者干扰很小，可用上述任一浓度进行干扰试验
MVC0.25 MVC0.125 供试品溶液 供试品阳性 对照 ---++
A
—
—
—
2
B
2λ /供试品 溶液
供试品 溶液
1 2 4 8
细菌内毒素检查规程
细菌内毒素检查规程一、目的：阐述细菌内毒素检查规程。
二、适用范围：适用于细菌内毒素的检查规程。
三、责任者：品控部。
四、正文：1 简述1.1 本规程适用于2005年版附录中细菌内毒素检查法——凝胶法1.2 鲎试剂灵敏度复核试验的目的不仅是考查鲎试剂和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确和实验条件是否符合规定。
因此要求每个实验室在将一批新的鲎试剂用于干扰试验或供试品细菌内毒素检查前应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
1.3 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和工艺是否有变化，鲎试剂来源于不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
1.4 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。
阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。
2 实验材料及用具2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。
2.2 电热干燥箱除外源性内毒用，温度应能维护250℃以上至少一小时。
2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37°±1℃保持一小时。
2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。
2.5 旋涡混合器2.6 鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号2.7 细菌内毒素国家标准品（NSE），细菌内毒素工作标准品（WSE），除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。
2.8 细菌内毒素检查用水（BET水）系指与灵敏度为0.03Eu/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下不产生凝集反应的灭菌注射用水。
2.9 实验用具移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10³75mm）、三角瓶、小试管（16³100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管架、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮。
所用玻璃器皿经过250℃干烤至少1小时。
塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。
2.10 试剂75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液3 操作方法3.1 试验准备3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。
鲎试剂标准
鲎试剂标准本品为鲎科动物东方鲎（Tachyplecus tridentatus）的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品。
本品含能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原（Proclotting enzyme），凝固蛋白原（Coagulagen）其灵敏度以细菌内毒标准品或工作标准品测定，应为标示量的50％－200％。
（一）性状本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水生生理盐水中易溶。
（二）鉴别1．取本品按装量加水溶解后，加茚三酮试液《中国药典1990年版》（二部附录162页）0.25ml，加热煮沸1－2分钟，显蓝色紫色。
2．取本品按装量加水溶解后，再加水适当稀释，照分光光度法《中国药典1990年版》（二部附录24页）测定，在270±1nm的波长处有单一吸收峰。
3．取本品按装量加入内毒检查用水溶解后，吸取0.1ml加入0.1ml细菌内毒素工作标准品或标准品50EU，混匀后，于37℃水浴中放置1小时，有凝胶形成。
（三）检查干燥失重：取本品约0.1在g ，在66℃减压干燥至恒得，减失重量不得过5％（中国药典1990年版二部附录55页）。
自身凝集：取本品4支，按装量加入配带的鲎试剂溶剂，溶解后，分别从每支取0.1ml，再分别加入配带的鲎试剂溶剂0.1ml，混匀后，于37±1℃水浴中放置4小时，不得形成凝胶，若有2管以上形成凝胶，判为不合格；若仅有1管形成凝胶，照同样方法，另取8支重复检查，8支均不得形成凝胶。
缓冲能力：任意取5％、10％葡萄糖注射液，氯化钠注射液无菌注射用水或注射用水适量，加稀盐酸调节pH使供试品溶液pH值为2.90-3.00，取此溶液适量与等量鲎试剂溶解液混匀，重复测定，pH值应为6.00-8.00。
（四）灵敏度测定预测：1．取细菌内毒素工作标准品1支，按说明溶解燕稀稀释成1→8等比系列稀释液。
2．取同一批鲎试剂若干支，分别按标示量加入配带的试剂溶剂制成鲎试剂溶液。
取10×75mm试管若干支，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，加入内毒素稀释液0.1 ml ，每一稀释液最少作2管，同时作2管阴性对照。
鲎试剂灵敏度
▪ 鲎的血变形细胞中含有两种物质，即高相对分子质量的凝固 酶原和凝固蛋白原，凝固酶原被内毒素激活转化成具有活性 的凝固酶，在凝固酶的酶解作用下，将凝固蛋白原转化成凝 固蛋白，凝固蛋白又通过交联酶作用互相聚合而形成牢固的 凝胶。可简单表示如下： 内毒素
↓ 凝固酶原-----→凝固酶
↓ 凝固蛋白质-----→凝固蛋白
死某些其他微生物或癌细胞的物质，称抗生素。抗 生素多由放线菌和真菌产生，细菌仅产生少数几种，
如多粘菌素、杆菌肽等。
（5）细菌素
某些细菌能产生一种仅作用于有近缘关系的细菌 的抗菌物质，称细菌素。细菌素为蛋白类物质，抗 菌范围很窄，无治疗意义，但可用于细菌分型和流 行病学调查。细菌素以生产菌而命名。大肠埃希菌 产生的细菌素称大肠菌素，绿脓杆菌产生的称绿脓 菌素，霍乱弧菌产生的称霍乱菌素。
交联酶↓ 凝胶
三、操作用仪器及试剂
1．仪器 超净工作台，分析天平（万分之一） ， 细菌
内毒素定量测定仪 ，电热干燥箱， 旋涡混合器， 三角瓶， 凝集管（10mm×75mm）， 小试管 （16mm×100mm）， 移液管（或刻度吸管、 定量移液器）, 大口径试管，水浴恒温器或干热 恒温器， 试管架， 计时器, 洗耳球, 封口膜 或金属试管帽 , 脱脂棉，吸水纸，剪刀，砂轮等。
第二节 微生物内毒素测定的操作
可作为部分注射剂热原检查的代替方法，与
一、操作目的 家兔热原检查法相比，有快速、灵敏、重现
性好、简便易行等优点，并有利于热原检查 标准化。
二、操作原理
鲎,属节肢动物，肢口纲。在3亿中前的泥盆纪末期，鲎就问世 了，堪称海洋里的远古遗民。鲎是用鳃呼吸的节肢动物,目前 世界上仅有4种：中国鲎、美洲鲎、马来鲎和圆尾鲎。
通常利用生化试验的方法，检测微生物对 各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为微 生物的生化反应。这一反应通常用于微生物 的鉴别。