鲎试剂灵敏度
细菌内毒素测定技术—鲎试剂灵敏度复核和方法验证试验
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
二、鲎试剂灵敏度的复核 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于内毒素 检查。但是注意要以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
知识点：干扰试验
一、干扰试验 是为了确定供试品在多大的稀释倍数或 浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为产 品能否用细菌内毒素检查法提供依据，并且验证供试品 的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对 照结果呈阴性时，供试品是否存在干扰作用。
编号
内毒素浓度
被加入内毒素的溶液 平行管数
A
无
供试品溶液
至少2
标准曲线的中点（或附近点
B
）的浓度（设为λm）
C
至少3个浓度 （最低一点设定为λ）
供试品溶液 检查用水
至少2 每一浓度至少2
D
无
检查用水
至少2
A 为稀释倍数不超过MVD 的供试品溶液。B 为加入了标准曲线中点或 靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A 有相同稀释倍数的供 试品溶液。C 为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备 标准曲线的标准内毒素溶液。D 为阴性对照。
浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml 表示。当使用新批号的 鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进 行鲎试剂灵敏度复核试验。
复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检 验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。
细菌内毒素试验（鲎试验）的全面解析
细菌内毒素试验（鲎试验）的全面解析一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin)；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。
产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。
如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。
另一类为内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。
细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
和热原的关系热原(pyrogen)系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。
热原是否就是内毒素？细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原。
细菌内毒素被认为是热原的本质，此事在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。
热原反应：含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。
来源和控制方法1、细菌内毒素的特性2、去除细菌内毒素的方法(1)吸附法此法是利用活性炭对热原的吸附作用达到去除作用的方法。
常用的吸附剂中，活性炭对热原的吸附作用最强，一般用量为总容量的0.1%-0.5% ，将溶液加热到70℃左右保温一定时间效果更好。
使用的活性炭应符合药典规定要求。
(2)蒸馏法此法是利用热原具有不挥发性而达到去除目的。
因此，凡适于蒸馏的药品均可用蒸馏法除去热原。
(3)热破坏法此法是利用热高温能破坏热原质达到去除目的。
因此，凡适用于高温处理的如热原检查试验中接触药液的容器，可用180℃干烤3小时，或250℃干烤30min以上。
(4)强酸强碱处理法此法利用强酸强碱能破坏热原而达到去除的目的。
(5)其他，也可以采用过滤等方法去除热原。
QC-7129B鲎试剂灵敏度复核操作规程
正文规范鲎试剂灵敏度复核的操作过程和要求，确保鲎试剂灵敏度复核结果的可靠性。
适用于质监处药理室对鲎试剂灵敏度的复核。
质监处药理室分析人员负责本规程的实施和完成相关记录。
USP版附录85；CP版附录Ⅺ E 。
细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。
鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。
细菌内毒素检查用水(BET水)：系指与灵敏度为0.03EU/ml 或更高灵敏度的鲎试剂在37 1 C 条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
细菌内毒素标准品：USP细菌内毒素参考标准品(RSE)或已标定的细菌内毒素工作标准品(CSE)。
反应终点浓度：是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈现阳性结果的浓度。
一、试剂、材料与仪器设备试剂：鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。
细菌内毒素检查用水(BET水) 批号、规格、生产商。
细菌内毒素标准品批号、效价、生产商。
材料及仪器设备：电热恒温水箱型号、设备编号。
电热鼓风干燥箱型号、设备编号。
漩涡混合器型号。
无热原试管规格：1075mm。
正文无热原玻璃瓶规格：25ml。
无热原玻璃吸管规格：1ml、2ml、5ml、10ml。
试管架、无热原封口膜、洗耳球、酒精棉球、砂轮片。
二、试验准备试验所用的容器、用具都必须经过处理，250C以上干烤至少1小时，以去除外源性内毒素。
试验操作过程应避免微生物的污染。
三、内毒素溶液配制细菌内毒素标准品系列溶液配制取RSE或CSE 1瓶，按照使用说明书加入规定量的细菌内毒素检查用水使溶，并用漩涡混合器间歇混匀30分钟，然后用细菌内毒素检查用水进一步稀释至2.0、、 0.5、 0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每一步稀释应混匀至少30秒钟。
鲎试剂灵敏度实验记录检查记录(01版)
检验编号：
一、鲎试剂
批号
标示灵敏度
EU/ml
供样单位
规格
生产单位
检验数量
检验目的
灵敏度复核
检验日期
年月日
检验依据
《中华人民共和国药典》（2005年版）二部
二、标准品
WSE批号
效价
EU
来源
BET水批号
规格
ml/支
来源
内毒素标准品复溶时的体积为ml；稀释方法为：取0.1ml内毒素标准溶液，加入0.9mlBET水，即为1→10稀释液，取1→10稀释液0.5ml，加入BET水0.5ml，即为0.5EU/ml内毒素标准溶液。
三、反应结果（温度：℃时间：分钟）
内毒素浓度
2.0λ
1.0λ
0.5λ
0.25λ
阴性对照
反应终点浓度
重
复
管
数
1பைடு நூலகம்
2
3
4
结果是否有效
计算结果
结果判断
检验员
复核员
鲎试剂灵敏度复核记录
结果是否有效
计算结果
结果判断
检验人员
BET水批号：12011305
规格：mL/支来源：福州新北化工业有限公司
内毒素标准品复溶时的体积为mL，稀释方法为：用刻度吸管准确吸取内毒素检查用水1mL制成细菌内毒素标准液0λ1.0λ0.5λ0.25λ
（）（）（）（）
NC
反应终点浓度
重1
复2
管3
鲎试剂灵敏度复核试验记录
一仪器设备
试管恒温仪
二鲎试剂检验日期：年月日
批号：
灵敏度：EU/mL
供养单位：
规格：mL/支（瓶）
生产单位：
有效期：年
检验目的：灵敏度考核
检验数量：支（瓶）
检验依据：中国药典年版
三标准品
NES批号：
效价：EU来源：
WSE批号：150601-201072
效价：EU来源：中国药品生物制品检定所
QC-7129B鲎试剂灵敏度复核操作规程
CP版附录ⅪE。
细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。
鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。
一、试剂、材料与仪器设备
试剂：
鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。
细菌内毒素检查用水(BET水)批号、规格、生产商。
细菌内毒素标准品批号、效价、生产商。
材料及仪器设备：
电热恒温水箱型号、设备编号。
电热鼓风干燥箱型号、设备编号。
漩涡混合器型号。
无热原试管规格：1075mm。
正文
无热原玻璃瓶规格：25ml。
五、试验结果观察和有效性
结果观察将安瓿从电热恒温水箱中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+)；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为(–)。保温和拿取安瓿过程应避免受到振动造成假阴性结果。
有效性对于细菌内毒素标准品系列溶液，如果最大浓度2.0管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管均为阴性，试验方为有效。
标题：
1.目的
2.范围
3.职责
4.参考资料
5.定义
6.鲎试剂灵敏度的复核
标题：
标题：
7.鲎试剂的有效期
8.鲎试剂的保存
9.需复核的情况
10.相关记录
正文
规范鲎试剂灵敏度复核的操作过程和要求，确保鲎试剂灵敏度复核结果的可靠性。
适用于质监处药理室对鲎试剂灵敏度的复核。
鲎试验检查细菌内毒素应注意的问题
鲎试验检查细菌内毒素应注意的问题鲎试验检查细菌内毒素应注意的问题发布时间02年09月05日 09时18分方法：通过对干扰鲎试验准确性干扰因素的分析(包括鲎试剂本身、操作条件、配制原料等)，提出了鲎试验中应注意的问题。
结果：只要克服了检查中的干扰因素，鲎法具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。
鲎试验是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断供试品中细菌内毒素限量是否符合规定的一种方法[1]。
它具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。
中国药典1995年版已收载细菌内毒素检查法(简称鲎试验)，但只用于几种输液的检查。
根据现有的实验证明，凡不干扰细菌内毒素检查或虽有干扰，但可以克服的药品注射剂，将能够全部以鲎法代替家兔热原检查法。
但是该法受到许多因素的影响，故在做鲎试验检查时，应注意下列问题。
1鲎试剂本身1.1鲎试剂灵敏度 为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，用于试验的鲎试剂应首先核对灵敏度。
因为在我们的实际工作中，发现鲎试剂均符合药典规定标准前提下，由于生产厂家不同，部分鲎试剂的实测灵敏度与标示值有差异而导致检测同一检品时，用相同标示值的鲎试剂，出现不同结果。
因而先核对灵敏度可避免因鲎试剂本身造成的判断失误。
建议法定部门和生产单位应注意鲎试剂的质量检查。
1.2供试品稀释 在取样品时，一定要熟悉中国药典的内容，不能直接取大输液原液0.1ml进行检查，这是排除干扰因素的简单有效的方法。
因药典已明确规定试验中鲎试剂的灵敏度不超过0.5EU/ml，根据供试品的稀释公式： 供试品稀释倍数= L/λυL ：供试品的内毒素限量(1EU/ml)λυ：鲎试剂灵敏度的标示值(EU/ml)故检测大输液均应稀释后才能进行试验，如选用更高灵敏度的鲎试剂，则应增加样品的稀释倍数。
稀释用的细菌内毒素检查用水药典作了规定。
在4h内不得与鲎试剂产生凝集反应。
如果直接用供试品原液试验，就会使供试品的内毒素提高到0.5EU/ml或0.5EU/ml以下，这样，根据目前大输液的生产和贮藏条件，有些就会达不到，鲎法检出的阳性率会提高，兔法复核的机遇也将增多，势必会浪费人力物力。
[精华]鲎试剂试验方法
![[精华]鲎试剂试验方法](https://img.taocdn.com/s3/m/28cbff01caaedd3383c4d3b4.png)
[精华]鲎试剂试验方法鲎试剂实验方法鲎试剂按实验方法可分为:凝胶法、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。
凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。
此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。
凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.2ml/支的单个测试或0.5ml/支至5.2ml/瓶的真空封口西林瓶装的多个测试。
使用时一般应加细菌内毒素检查用水复溶后使用。
厦门市鲎试剂实验厂有限公司的真空封口试管凝胶法鲎试剂是把鲎试剂直接灌装在试管中，在真空中压盖封口的新产品。
使用时直接用样品溶解鲎试剂，不会割伤手，更加简单方便安全。
特异性鲎试剂，即弃G因子鲎试剂，是厦门市鲎试剂实验厂有限公司国内首创的产品，它专一对内毒素起反应，避免了G因子旁路的干扰，使检测结果更加可靠，在药检和临床检验方面是不可或缺的理想检测试剂。
目前厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的各种内毒素检测鲎试剂均为特异性鲎试剂，都能对抗葡聚糖的干扰，只对内毒素起反应。
因此不列为独立品种。
动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂，这四种方法都是定量检测内毒素的。
这几种定量法鲎试剂统称光度法鲎试剂。
根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
终点浊度法未见商品化产品。
动态浊度法(又称动态比浊法)是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
动态浊度法的特点为:1. 能准确定量。
2.检测范围宽，可达4个数量级。
3.灵敏度高达0.005EU/ml。
4. 操作简便，系统自动检测分析，一步即成。
5. 经济实用，试剂样品需要量少，可降至50μL。
6. 和微生物检测系统Elx808(配套IU)及专用软件TALgent使用，一次可同时检测多达96个样品。
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(2)毒素与酶
细菌可产生内、外毒素及侵袭性酶，与细菌的致 病性密切相关。
内毒素即革兰阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成 分为类脂A。菌体死亡崩解后释放出来。外毒素是由 革兰阳性菌及少数革兰阴性菌在生长代谢过程中释 放至菌体外的蛋白质。具有抗原性强、毒性强、作 用特异性强的突出特点。
某些细菌可产生具有侵袭性的酶，能损伤机体组 织，促进细菌的侵袭、扩散，是细菌重要的致病因 素，如链球菌的透明质酸酶等。
吲哚试验阳性
生成红色的 玫瑰吲哚
(3)甲基红试验
葡萄糖分解 产生丙酮酸
不能形成乙 酰甲基甲醇，
中性的乙酰 甲基甲醇
培养液 pH＞5.4，
加甲基红指示剂呈桔黄色， (为甲基红试验阴性 )
培养液呈酸性pH＜5.4，指示 剂甲基红呈红色，称甲基红试 验阳性。
(4) VP试验
丙酮酸
脱羧、氧化 生成
(在碱性溶液中)
第六章 微生物代谢产物的测定技术
教学目标： １、微生物代谢产物的测定技术 ２、知道微生物的致病性。
教学重点： 微生物代谢产物的测定技术，微生物的致病性。
教学难点： 微生物的致病性
第一节 理论基础
多糖、蛋白 质等大分子 营养物质
微生物
分解
பைடு நூலகம்
单糖、小肽 或氨基酸
分解 代谢
吸收进入菌体，再经氧化或胞内 酶分解形成菌体可利用的成分
二、微生物的致病性
1．侵袭力
（一）细
病 菌的毒力 原 菌 的 致 病 性
指病原菌突破宿主皮肤、黏膜生理 屏障，在体内生长繁殖和扩散的能力。 侵袭力与其表面结构和侵袭性酶有关。
2．毒素 其来源、性
（1）外毒素
主要是G+菌在生长繁殖过程
中合成并分泌到菌体外的毒性
质和作用不
极强,对机体的组织器官具有选
同，可分为
（3）色素
有些细菌能产生色素，对细菌的鉴别有一定意 义。 细菌色素有两类：
①水溶性色素，可使培养基带上相应的颜色， 如绿脓杆菌产生的绿脓色素使培养基或脓汗呈绿 色。
②脂溶性色素，不溶于水，仅保持在菌落内 使之呈色而培养基颜色不变，如金黄色葡萄球菌 色素。
（4）抗生素 某些微生物代谢过程中可产生一种能抑制或杀
通常利用生化试验的方法，检测微生物对 各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为微 生物的生化反应。这一反应通常用于微生物 的鉴别。
(2)发酵试验
多种单糖
酸、醛、醇、 酮、气体等 代谢产物
不同的微生物对糖的分解能力和 代谢产物不同，可用于鉴定。
(2)吲哚试验
营养物质中 的色氨酸
吲哚
加入对二甲基 氨基苯甲醛
▪ 鲎的血变形细胞中含有两种物质，即高相对分子质量的凝固 酶原和凝固蛋白原，凝固酶原被内毒素激活转化成具有活性 的凝固酶，在凝固酶的酶解作用下，将凝固蛋白原转化成凝 固蛋白，凝固蛋白又通过交联酶作用互相聚合而形成牢固的 凝胶。可简单表示如下： 内毒素
大肠埃希菌
＋、＋、－、－
产气杆菌
－、－ 、 ＋、＋
I、M、VI、C生化试验录像
2.合成代谢产物及临床意义
除了合成 多糖、蛋 白质、脂 肪、核酸、 细胞壁及 各种辅酶 等自身成 分外
(1) 热原质 (2) 毒素与酶 （3）色素 （4）抗生素
（5）细菌素
(1)热原质
热原质即菌体中的脂多糖，大多是革兰氏阴性 菌产生的。注入人或动物体内能引起发热反应，故 名热原质。热原质耐高热，高压蒸汽灭菌（121℃， 20′ ） 不 能 使 其 破 坏 ， 加 热 （180℃4h;250℃45′;650℃1′）才使热原质失去作 用。热原质可通过一般细菌滤器，但没有挥发性， 所以，除去热原质最好的方法是蒸馏。药液、水等 被细菌污染后，即使高压灭菌或经滤过除菌仍可有 热原质存在，输注机体后可引起严重发热反应。生 物制品或注射液制成后除去热原质比较困难，所以， 必须使用无热原质水制备。
化学成分 蛋白质
脂多糖
热稳定性 不稳定，加热60℃以上被 耐高温，250℃30min才
破坏
被破坏
抗原性 强
弱
类毒素 经0.3-0.4%的甲醛能变成无 不能用甲醛液脱毒成类 毒性而有抗原性的类毒素 毒素
毒性
强，对机体的组织器官具 弱，对机体的组织器官
有选择性
选择性不强
致热作用 不能引起宿主发热
引起发热反应
合成代谢
既能分解营养物质产生分解代谢产物，又能利用简单化合物产生 合成代谢产物。有的产物可用来鉴别微生物，有的产物与微生物 的致病性有关，有的产物可作为药物供临床上治疗疾病。
一、微生物的代谢产物 1．分解代谢产物及应用
不同的微生物，其自身含有的酶系统不同， 因此，在利用营养物质进行代谢时产生的代 谢产物也不完全相同。
第二节 微生物内毒素测定的操作
可作为部分注射剂热原检查的代替方法，与
一、操作目的 家兔热原检查法相比，有快速、灵敏、重现
性好、简便易行等优点，并有利于热原检查 标准化。
二、操作原理
鲎,属节肢动物，肢口纲。在3亿中前的泥盆纪末期，鲎就问世 了，堪称海洋里的远古遗民。鲎是用鳃呼吸的节肢动物,目前 世界上仅有4种：中国鲎、美洲鲎、马来鲎和圆尾鲎。
二乙酰
胍基的化合 物反应
红色化合物
VP阳性
黄色为VP阴性
(5)枸橼酸盐利用试验
枸橼酸盐
唯一碳源
分解 生成
碳酸盐，同时 分解培养基的 铵盐生成氨
培养基变 为碱性
使培养基内的指 示剂溴麝香草酚 蓝由淡绿转为深 蓝，
此为阳性反应
指示剂不变 色(原为绿 色)，为阴性 反应
吲哚试验 、甲基红试验 、VP试验 、枸橼酸盐利用 试验 通常统称为I、M、VI、C生化试验。在鉴定上 使用广泛。
死某些其他微生物或癌细胞的物质，称抗生素。抗 生素多由放线菌和真菌产生，细菌仅产生少数几种，
如多粘菌素、杆菌肽等。
（5）细菌素
某些细菌能产生一种仅作用于有近缘关系的细菌 的抗菌物质，称细菌素。细菌素为蛋白类物质，抗 菌范围很窄，无治疗意义，但可用于细菌分型和流 行病学调查。细菌素以生产菌而命名。大肠埃希菌 产生的细菌素称大肠菌素，绿脓杆菌产生的称绿脓 菌素，霍乱弧菌产生的称霍乱菌素。
择毒性作用的蛋白质。
（2）内毒素
是G-菌在死亡裂解或用人工
（二）细菌侵入的数量
方法破坏菌体后才释放出来细
胞壁中的能引起机体发热反应脂多
糖类脂A成分 。
（三）细菌侵入的部位
表6-1 细菌外毒素和内毒素比较
外毒素
内毒素
来源
活菌的代谢产物，并分泌 到菌体外
革兰阴性菌细胞壁的组 成成分，菌体裂解后释 放出来